Studeren Cell Rolling Trajecten op Asymmetrische Receptor Patterns
13 februari 2011
Beschrijven we een protocol om te observeren en cel-rollen trajecten te analyseren op asymmetrische receptor-patroon substraten. De resulterende gegevens zijn nuttig voor de engineering van receptor-patroon substraten voor label-free cell scheiding en analyse.
Dit protocol observeert en analyseert celroltrajecten op asymmetrische receptorpatronen om de ontwikkeling van receptorpatroon-substraten voor labelvrije scheiding en analyse van cellen te faciliteren; begin met microcontactprinten van PEG-moleculen op een gouden substraat om afwisselende patronen van zelfgeassembleerde monolagen te creëren, gevolgd door het opvullen van het substraat met P-selectine-receptoren. Integreer vervolgens het substraat in de flowkamer. Voer de HL 60-cellen de kamer in.
Registreer een beeldsequentie van de rollende interactie van HL 60-cellen op P-selectinepatronen en analyseer de beelden die uit de video zijn geconverteerd. De trajecten van de rollende celranden, de trackinglengte en de rollingsnelheden op het vlak, in de regio en aan de rand kunnen worden verkregen met behulp van een MATLAB-programma. Deze methode kan inzicht verschaffen in hoe HO 60-cellen bewegen op asymmetrische receptorpatronen in een shearflow.
Dit kan worden toegepast voor het kwantificeren van andere interacties op het celoppervlak, directe analyse van cellen door hun trajecten op receptorpatronen te observeren, en voor het ontwerp van micro-footing apparaten voor celscheiding. Microcontactdruk wordt gebruikt om afwisselende patronen van zelfgeassembleerde monolagen van peg-moleculen op het gouden substraat te creëren.
Inkt eerst de PDMS-stempel met een 5 mM PEG-oplossing in ethanol. Laat het oppervlak 20 minuten drogen. Plaats de stempel voorzichtig gedurende 40 seconden op het goudoppervlak en zorg voor een goed contact tussen het goudoppervlak en de stempel.
Er is geen overdruk vereist. Spoel het oppervlak met ethanol en droog dit onder een stroom stikstof. Incubeer nu de substraten met behulp van een perfusiekamer gedurende drie uur bij kamertemperatuur met een P-selectine-oplossing van 15 µg/mL om de overige gebieden te patroonvormen met P-selectine, spoel de kamer vervolgens en vul de oppervlakken aan met 1 mg/mL BSA gedurende één uur om aspecifieke interacties te blokkeren.
Spoel het oppervlak met DPBS-buffer voordat het cell rolling-experiment wordt uitgevoerd. Assembleer de flowkamer en laat vervolgens een suspensie van 10⁵ cellen per milliliter HL 60-cellen over de patroonoppervlakken in een rechthoekige flowkamer stromen, met inclinatiehoeken van 10 graden voor het receptorpatroon.
Bij een kamertemperatuur van 24,5 °C. Stel de spuitenpomp zo in dat er een stroomsnelheid van 75 µL per minuut wordt gegenereerd met een corresponderende laminaire schuifspanning van 0,5 dyn/cm². Registreer nu het rollen van HL 60 met een omgekeerde microscoop en een gemonteerde camera.
Interacties met adhesieve p-selectine en substraten. Gebruik een 4x objectief met een snelheid van één frame per seconde gedurende een periode van 300 seconden. Voer drie onafhankelijke experimenten uit.
Presenteer de gegevens als het gemiddelde en de standaarddeviatie van de gemiddelde waarden die uit elk experiment zijn verkregen. Microscoopbeelden zijn geconverteerd vanuit de video van HL 60.Rolling. Interacties met adhesieve p-selectine en substraten tonen heldere en donkere regio's die respectievelijk overeenkomen met de p-selectine receptor en de PEG-regio's.
De sporen worden hier afgebakend met behulp van een aangepast MATLAB-programma. De hellingshoek van de rand was 10 graden en de schuifspanning bedroeg 0,5 dines per vierkante centimeter. Verdere analyses richten zich op de distributie van de lengte van de randsporing, de gemiddelde waarde van de lengte van de randsporing, alsofzoals VE en VP, de rolgebaarsnelheden op de rand en binnenin de banden.
Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u de celbanen op de asymmetrische receptorpatronen kunt onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol observeert en analyseert celroltrajecten op asymmetrische receptorpatronen om de ontwikkeling van substraten met receptorpatronen voor labelvrije celscheiding en -analyse te faciliteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Biomaterialen
- Microfluidica
Achtergrond
- Celroling is een kritisch proces in diverse biologische interacties.
- Asymmetrische receptorenpatronen kunnen het celgedrag beïnvloeden.
- Labelvrije technieken zijn essentieel voor celseparatie en -analyse.
- Microcontactdruk is een nuttige methode voor het creëren van gepatroneerde substraten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het observeren van celrollets op met receptoren gepatteerde substraten.
- Het analyseren van de trajecten van rollende cellen voor een betere engineering van substraten.
- Het verschaffen van inzicht in de dynamiek van celbewegingen onder stromingscondities.
Gebruikte methoden
- Microcontactprinten van PEG-moleculen op een gouden substraat.
- Creatie van afwisselende patronen van zelfgeassembleerde monolagen.
- Backfillen van het substraat met P-selectine en receptoren.
- Integratie in een flowkamer en imaging van HL-60-cellen die over de patronen rollen.
Belangrijkste resultaten
- Beeldsequenties van HL-60 celinteracties werden opgenomen.
- Trajectorieën van rollende cellen werden geanalyseerd met behulp van MATLAB.
- Er werden gegevens verkregen over de randtrackingslengte en de rol-snelheden.
- Er werden inzichten verschaft in celbeweging op asymmetrische receptormpatronen.
Conclusies
- Het protocol maakt een gedetailleerde analyse van de dynamiek van celrolling mogelijk.
- Asymmetrische receptorpatronen kunnen worden ontworpen voor een effectieve celscheiding.
- Deze methode draagt bij aan het begrip van celgedrag in schuifstroming.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Inzicht in de rolltrajecten van cellen op asymmetrische receptorpatronen maakt het rationele ontwerp van labelvrije microfluïdische scheidingsapparaten mogelijk. Dit protocol levert kwantitatieve gegevens over de randvolglengte en de rol-snelheid onder een gedefinieerde schuifspanning, wat voorspellende modellering van celgedrag in stroming ondersteunt. Dergelijke inzichten verminderen de empirische iteratie bij het ontwerpen van apparaten voor celzuivering en workflows voor fenotypische analyse.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de bindingskinetiek van ligand-receptor onder fysiologische afschuifspanning mogelijk, wat bijdraagt aan de validatie van targets voor adhesie-gemedieerde pathways.
- Operationele waarde: Biedt een labelvrije methode om de functionele receptoractiviteit te beoordelen zonder gebruik van fluorescente tags of genetische reporters.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve resultaten van de rol-snelheid van cellen en de edge tracking-lengte voor vergelijkende analyse tussen verschillende receptordichtheden of patroongeometrieën.
- Operationele waarde: Standardiseert de substraatpreparatie via microcontactprinten en integratie van een flowkamer voor reproduceerbare adhesie-assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de mechanistische risicoreductie van adhesie-gebaseerde scheidingsstrategieën door het ontwerp van receptorpatronen te koppelen aan observeerbare resultaten van celbanen.
- Operationele waarde: Maakt screening van celphenotypes mogelijk op basis van rolgedrag, wat nuttig is voor het verrijken van subpopulaties in preklinische modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de vroege ontdekkingsfase om assay-ontwikkeling en de generatie van preklinische tools te ondersteunen, in het bijzonder voor targets waarbij adhesie onder stroming een functionele readout is.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetoetsing van receptor-ligandinteracties in schuifstroom, waardoor mechanistische bijdragen aan celrolling worden verduidelijkt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve adhesiemetrieken die vergelijking van cellijnen of receptormodulatoren mogelijk maken.
- Analyses: Genereert distributies van edge tracking-lengte en rolling-snelheid, wat een statistische basis biedt voor de vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro rolling-dynamiek met potentiële bruikbaarheid in label-vrije celseparatieapparaten voor preklinische monsterverwerking.
- Herbruikbaarheid binnen organisaties: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van adhesie-gemedieerd celgedrag over meerdere targets en celtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in adhesiegebaseerde scheidingsmechanismen door trajectparameters onder gecontroleerde afschuiving te kwantificeren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde microcontactprinting, receptor backfilling en de opstelling van de stroomkamer.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium van apparaatontwikkeling door vroege functionele validatie van receptorpatronen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt go/no-go-beslissingen voor microfluïdische scheidingstechnologieën door empirische gegevens over de prestaties van patronen te leveren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microcontact printing, oppervlaktechemie en microfluidische stroomregeling.
- Afhankelijk van toegang tot omgekeerde veldmicroscopie, een hogesnelheidscamera en MATLAB-gebaseerde tools voor partikeltracking.
- Vereist cross-team standaardisatie van substraatfabricage en rapportage van stroomcondities voor reproduceerbaarheid op meerdere locaties.
- Aanpassing aan alternatieve celtypen vereist validatie van ligand-receptorparen en optimalisatie van shear stress-parameters.
- Beperkt door het transiënte karakter van celrandinteracties, wat de volledige trajectreconstructie beperkt en gesegmenteerde analyse noodzakelijk maakt.
