Name: Studeren Cell Rolling Trajecten op Asymmetrische Receptor Patterns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Leer celrolbanen analyseren op asymmetrische receptorpatronen met HL-60-cellen en microcontactprinten. Deze methode biedt inzicht in celbewegingsdynamica onder stromingsomstandigheden voor labelvrije celscheiding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd ondersteund door de Deshpande Centrum voor Technologische Innovatie aan MIT (RK en JMK) en de NSF LOOPBAAN award 0.952.493 tot RK door de chemische en biologische scheidingen programma. Wij danken het Instituut voor Nanotechnologie Soldier (ISN) en de Microsystems Technology Laboratory (MTL) op MIT voor het gebruik van hun faciliteiten.

1. HL60 cellen rollen 1.1. Fabricage van Patterned Substrates. <ol><li> Met behulp van microcontact afdrukken (μCP) 4-7 te maken afwisselend zelf-geassembleerde monolagen (SAM) van de PEG-moleculen op de goud gecoate glas dia's: Vervaardig microcontact afdrukken polydimethylsiloxaan (PDMS) postzegels, dat de receptor patronen gedefinieerd met hellingshoek van α = 10 ° door een SU-8 molding proces. Reinig het oppervlak met goud piranha-oplossing (3:1 mengsel van zwavelzuur tot 30% waterstof peroxide) gedurende 20 minuten en daarna het oppervlak afspoelen met overvloedig DI water bij 24,5 ° C voor gebruik. Inkt van de PDMS stempel met 5mm PEG-oplossing in ethanol. Droog de stempel in de lucht gedurende 20 minuten. Voorzichtig zet de stempel op de gouden oppervlak voor 40 sec en zorg ervoor dat er een goed contact tussen de goud-oppervlak en de stempel. Geen overdruk nodig is. Spoel het oppervlak met ethanol en drogen onder een stroom van N 2. </li><li> Incubeer de ondergrond binnen de P-selectine-oplossing (15 ug / ml in DPBS) met behulp van een perfusie kamer (Electron Microscopy Sciences) gedurende 3 uur bij 24,5 ° C tot patroon van de resterende gebieden met P-selectine. Spoel het oppervlak met overvloedig DPBS. </li><li> Backfill het oppervlak met BSA (1 mg / ml in DPBS) gedurende 1 uur voor niet-specifieke interacties te blokkeren. Spoel het oppervlak met overvloedig DPBS. </li></ol> 1.2. Cel Rolling Experimenten in een Flow Kamer. <ol><li> Stroom een suspensie van HL60 cellen (~ 10 5 cellen / ml) over de oppervlakken met een patroon in een rechthoekige stroom kamer (Glycotech, Inc; breedte w = 1,0 cm, lengte = 6 cm, hoogte h = 0,0127 cm) bij 24,5 ° C. Gebruik een injectiepomp (World precisie-instrumenten, SP230IW) om het debiet van 75 pL / min te genereren, met bijbehorende shear stress rond 0,5 dyn / cm 2 (~ 0,05 Pa). Bereken schuifspanning τ door gebruik te maken van het vliegtuig Poiseuille stroming vergelijking τ = 6μQ/wh 2, waar μ is de kinematische viscositeit (0,001002 Pa s), Q is volumestroom, w is de breedte van de stroom kamer, en h is de hoogte van de doorstroming kamer. </li><li> Gebruik een omgekeerde microscoop (Nikon TE2000-U) met een gemonteerde camera (Andor IXON 885) tot HL60 cellen rollende interacties met lijm P-selectine substraten met behulp van een 4 × plaat doel, meestal met een snelheid van 1 beeld per seconde voor de duur van 300 s. Uitvoeren van drie onafhankelijke experimenten, voor elke shear stress omvang en het patroon kantelhoek. Huidige gegevens als gemiddelde en standaarddeviatie van de gemiddelde waarden die zijn verkregen van elk experiment. </li><li> Data Analysis. Analyseer de afbeelding sequenties door een op maat gemaakte Matlab (Mathworks, Inc) programma dat een deeltje tracking freeware 8 tot en met tracks te genereren langs de lijn patroon randen gebruikt. Tracks verlengen tot het einde van een P-selectine band worden geselecteerd en voorzien van twee rechte lijn segmenten - een lijn met de stroom mee, de andere lijn met het patroon rand. Deze twee segmenten worden vervolgens gebruikt om de rand tracking lengte te berekenen, rollen snelheid op de rand, en de rollen snelheid op de vlakte regio. </li></ol> 2. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2640/2640fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur (A) toont een van de microscoop beelden omgezet van de video van HL60 rollende interacties met lijm P-selectine substraten met behulp van een 4 × doelstelling. Heldere en donkere gebieden overeenkomen met P-selectine receptor en PEG regio's, respectievelijk. Figuur (B) toont de sporen verkregen met behulp van een aangepaste Matlab-programma. De rand hellingshoek is 10 ° en de shear stress was 0.5 dyn / cm 2. De rand tracking lengte, l e, verplaatsing, d, en de rollende snelheden op de rand en in de banden, V en V e p, respectievelijk, worden beschreven in figuur (C-1). Figuur (C-2) geeft de verdeling (van het aantal geregistreerde cellen) van de rand van tracking lengte. Inzetstukken geven de gemiddelde waarde van l e en de glooiende snelheid op de rand (V e) en binnen de band (V p) op de hoek van α = 10 ° en de vloeistof schuifspanning magnitude ongeveer 0,5 dyn / cm 2. Foutbalken vertegenwoordigen een standaardafwijking, waarbij n = 3 repliceren experimenten (3 repliceren oppervlakken) voor elke conditie.

<ol><li>Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+control+of+cell+rolling+in+two+dimensions+through+surface+Patterning+of+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors.</a> Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).</li>
<li>Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+Lateral+Displacement+of+HL60+Cells+Rolling+on+Asymmetric+P-selectin+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns.</a> Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).</li>
<li>Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+rolling+in-vivo+is+mediated+by+p-selectin+glycoprotein+ligand-1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1.</a> Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).</li>
<li>Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+patterns+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Printing patterns of proteins.</a> Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).</li>
<li>James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+protein+layers+on+solid+substrates+by+thin+stamp+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing.</a> Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+proteins+on+mixed+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).</li>
<li>Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: 
	
 <a target="_blank" href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a> Forthcoming.</li>
<li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.</li>
<li>Greenberg, A. W., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+mediated+by+differential+rolling+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cell separation mediated by differential rolling adhesion.</a> Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).</li>
<li>Higuchi, A., Tsukamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+of+hepatocytes+and+fibroblasts+through+surface-modified+polyurethane+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).</li>
<li>Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+surfaces+segregate+compliant+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterned surfaces segregate compliant microcapsules.</a> Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).</li>
</ol>

We hebben beschreven een protocol naar cel rollen trajecten te onderzoeken op asymmetrische receptor-oppervlakken met een patroon vervaardigd met behulp van microcontact afdrukken 2. De optische microscoop beelden van de patroon oppervlak van een duidelijke tegenstelling tussen de PEG en P-selectine gebieden kan worden gebruikt om te bevestigen of stempelen succesvol is. Scherpe, rechte kanten kan worden waargenomen wanneer de afstempeling goed wordt uitgevoerd. Hard drukken van de stempel kan resulteren in s...

<table><tbody><tr><td>Humane promyelocytaire leukemiecellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td>HL60-cellen</td></tr><tr><td>Met goud gecoate glazen objectglazen</td><td>EMF</td><td>TA134</td><td>Goudglazen</td></tr><tr><td>(1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleenglycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674508</td><td>PEG</td></tr><tr><td>Recombinant humaan P-selectine</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ADP3-050</td><td>P-selectine</td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>BSA-50</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s fosfaatgebufferde zoutoplossing </td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Zwavelzuur </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>316989</td><td></td></tr></tbody></table>

studeren cell rolling trajecten op asymmetrische receptor patterns

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Zijdelingse verplaatsing van cellen loodrecht op een stroom stroom door walsen op asymmetrische receptor patronen biedt een gelegenheid voor de ontwikkeling van nieuwe apparaten voor de label-free scheiding en analyse van cellen 1. Dergelijke apparaten kunnen gebruik maken van zijdelingse verplaatsing voor continue-flow scheiding, of receptor patronen die hechting moduleren om onderscheid te maken tussen de verschillende cel fenotypes of niveaus van receptor expressie. Begrijpen van de aard van de cel rollen trajecten op receptor-patroon substraten is noodzakelijk voor de engineering van de substraten en het ontwerp van dergelijke apparaten. Hier tonen we een protocol voor het bestuderen van cellen rollen trajecten op asymmetrische receptor patronen die cel rollen adhesie 2 ondersteunen. Goed gedefinieerde, um-schaal patronen van P-selectine-receptoren werden vervaardigd met behulp van microcontact afdrukken op goud gecoate dia&#39;s die werden opgenomen in een flow kamer. HL60 cellen die de PSGL-1-ligand 3 werden stroomde over een gebied van de patroon lijnen en gevisualiseerd op een omgekeerde helder veld microscoop. De cellen gerold en gevolgd langs de schuine randen van de patronen, wat resulteert in een zijwaartse afbuiging. Elke cel meestal van staal voor een bepaalde afstand langs de randen patroon (gedefinieerd als de rand tracking lengte), los van de rand, en opnieuw aan een downstream patroon. Hoewel dit detachement maakt het moeilijk om volgen het gehele traject van een cel van de ingang af te sluiten in de stroom kamer, was particle-tracking-software gebruikt om te analyseren en de glooiende trajecten van de cellen opbrengst in de tijd toen ze bewegen op een enkele receptor -patroon lijn. De trajecten werden vervolgens onderzocht op uitkeringen van cel-rollen snelheden en de rand tracking lengtes voor elke cel voor verschillende patronen te verkrijgen. Dit protocol is handig voor het kwantificeren van cel-rollen trajecten op de receptor patronen en met betrekking tot deze technische parameters zoals hoek van het patroon en de shear stress. Deze gegevens zal nuttig zijn voor het ontwerp van microfluïdische apparaten voor het label-free cell scheiding en analyse.

Beschrijven we een protocol om te observeren en cel-rollen trajecten te analyseren op asymmetrische receptor-patroon substraten. De resulterende gegevens zijn nuttig voor de engineering van receptor-patroon substraten voor label-free cell scheiding en analyse.

Studeren Cell Rolling Trajecten op Asymmetrische Receptor Patterns

Laterale verplaatsing van cellen loodrecht op een stroomrichting door middel van rollen op asymmetrische receptorpatronen biedt een kans voor de ontwikkeling van nieuwe ...

Dit protocol observeert en analyseert cell-rollingtrajecten op asymmetrische receptorpatronen om de engineering van receptorpatroonsubstraten voor labelvrije cel-scheiding en analyse te faciliteren. Begin met microcontactprinten van PEG-moleculen op een gouden substraat om afwisselende patronen van zelfgeorganiseerde monolagen te creëren, gevolgd door het opvullen van het substraat met P-selectine-receptoren. Plaats vervolgens het substraat in de flowkamer. Laat de HL 60-cellen door de kamer stromen.Neem een beeldsequentie op van de rollende interactie van HL 60-cellen op P-selectinepatronen en analyseer de beelden die uit de video zijn geconverteerd. De trajecten van de rollende celranden, de trackinglengte en de rollingsnelheden op het vlak, in de regio en aan de rand kunnen worden verkregen met behulp van een MATLAB-programma. Deze methode kan inzicht bieden in hoe HO 60-cellen bewegen op asymmetrische receptorpatronen in een shear flow.Dit kan worden toegepast voor het kwantificeren van andere interacties aan het celoppervlak, directe analyse van de cellen door hun trajecten op receptorpatronen te observeren, en voor het ontwerp van micro-footing-apparaten voor celseparatie. Mi

studying-cell-rolling-trajectories-on-asymmetric-receptor-patterns

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit rapport geeft een visuele voorstelling van de parallelle plaat stroom kamer analyse voor het bestuderen van leukocyten endotheliale interacties onder fysiologische shear stress. Deze methode is vooral nuttig voor het onderzoeken van de rol van het endotheel (E)-selectine en leukocyten E-selectine liganden die leiden tot leukocyten rollen op de endotheliale cellen oppervlakken.

Analyse van de Fysiologische E-selectine-Mediated Leukocyte Rolling op microvasculaire endotheel

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Deze studie gebruikte een multi-well plaat microfluïdische systeem aanzienlijk verhogen doorvoer cel rollen studies onder fysiologisch relevante schuifkracht. Gezien het belang van cel rollen in het multi-step cel homing cascade en het belang van cel homing na systemische toediening van exogene populaties van cellen bij patiënten, biedt dit systeem potentieel als een screening platform om celtherapie verbeteren.

Systematische analyse van In Vitro Cel Rolling Met behulp van een multi-well plaat Microfluidic System

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.

Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

In dit protocol presenteren we de experimentele procedures van een celverspreidende test die is gebaseerd op live-cell microscopie. We bieden een open-source computationele tool voor de onbevooroordeede segmentatie van fluorescerend gelabelde cellen en kwantitatieve analyse van lamellipodiadynamiek tijdens celverspreiding.

Kwantitatieve analyse van celranddynamiek tijdens celspreiding

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.

Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

Leer celrolbanen analyseren op asymmetrische receptorpatronen met HL-60-cellen en microcontactprinten. Deze methode biedt inzicht in celbewegingsdynamica onder stromingsomstandigheden voor labelvrije celscheiding.

Studeren Cell Rolling Trajecten op Asymmetrische Receptor Patterns

Meer video's verkennen