Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie

Dit experiment heeft als doel om te bepalen of twee eiwitten in cellen interageren en om aspecten van de plaatsen van die interactie te bepalen. Eerst worden cellen getransfecteerd met expressieconstructies die coderen voor de twee eiwitten van belang, waarvan er een gefuseerd is met het eindterminus van een gefragmenteerd fluorescerend eiwit en de andere gefuseerd is met het complementaire C-terminus van het gefragmenteerd fluorescerend eiwit. Na het laten ontwikkelen van fluorescent signaal in cultuur, worden de eiwitcomplexen gevisualiseerd door beeldvorming en immunoblotting.

Vervolgens worden de verzamelde beelden geëxporteerd naar beeldverwerkingssoftware zoals Image J. Om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit per cel in een gecontroleerd experiment te kwantificeren, kunnen BIFC-resultaten eiwit-eiwitinteracties en de lokalisatie van deze complexen aantonen, zoals de SH drie domeinen van het scaffold-eiwit die intersecteren en het pro-rijke domein van PI drie KC twee bèta. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals coloclisatie, immunoprecipitatie en fret, is dat BFC toelaat voor de ruimtelijke lokalisatie van zwakkere tijdelijke interacties in de cel. En deze methode vereist geen uitgebreide post-processing van beelden zoals bij fret.

Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden op het gebied van signaaltransductie, zoals of eiwitten X en Y interageren, en zo ja, welke specifieke compartimenten waarin deze complexen in de cel worden gelokaliseerd. Over het algemeen zullen nieuwkomers in deze methode worstelen omdat ze niet de juiste configuratie hebben gekozen voor het tot expressie brengen van hun biopsie. Gelabelde eiwitten van belang. Begin met het selecteren van een van de meerdere fluorforen voor de BIFC-fusie-eiwitten.

Overweeg dat de amino- en carboxy-terminale uiteinden van Venus in staat zijn om een complex te vormen bij 37 graden Celsius, terwijl de Y-F-P-B-I-F-C-fragmenten een pre-incubatie bij 30 graden Celsius vereisen. Ontwerp expressievectoren voor het toevoegen van tag aan de eiwitten van belang door te overwegen hoe de aanhechting van de BIFC-fragmenten de functie van de eiwitten van belang kan beïnvloeden. Bijvoorbeeld, RAs familie, GTP a's zijn lipoidgemodificeerd aan het carboxy-uiteinde en kunnen niet op dit einde worden gelabeld zonder deze modificatie te verstoren.

Voer altijd pilotexperimenten uit om de transfectiecondities te bepalen. Monitor ook de cellen door middel van fluorescentiemicroscopie om een optimale tijd voor signaalontwikkeling te identificeren. Voer vervolgens Western Blot-analyse uit om gelijke expressie van de constructies te bevestigen.

Belangrijk is om immuno te kleuren voor de HA of flag-tag om te verifiëren dat de toevoeging van de BIFC-fragmenten de cellulaire lokalisatie van de eiwitten van belang voor elke monsterplaat niet verandert. 1,3 keer 10 van de vijf veroorzakende cellen elk op een glazen bodemplaat en twee putjes van een zes-putjesplaat en laat de cellen 's nachts bezinken in een incubator van 37 graden Celsius de volgende dag. Bereid DNA's voor transfectie door middel van lipectomie of een andere voorkeursmethode.

Verdun eerst het DNA in 250 microliter serumvrij DMEM als een transfectiecontrole. Voeg CFP toe bij één 50, de hoeveelheid van uw totale BIFC DNA's. Verdun nu de lip in 250 microliter serumvrij DMEM met 10 microliter lip per één microgram DNA.

Meng de DNA- en lip-verdunningen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Spoel cellen twee keer met warm serumvrij DMEM. Voeg twee milliliter serumvrij DMEM toe aan elke glazen bodemplaat of putje van een zes-putjesschaal.

Splits vervolgens elke transfectiemix gelijkmatig tussen één glazen bodemplaat en twee putjes van een zes. Welplaat. Beïnvloedig de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vijf uur. Verwijder tenslotte het transfectiemedium en vervang het met compleet DMEM plus 10%FBS medium.

Beïnvloedig de cellen gedurende de tijd die in pilotexperimenten is bepaald om de noodzakelijke expressieniveaus van de eiwitten van belang te verkrijgen. Bekijk de getransfecteerde cellen onder een epifluorescentiemicroscoop om ervoor te zorgen dat de positieve controle fluorescent is. Spoel de cellen drie keer met PBS voor levende celbeeldvorming.

Plaats de cellen in media zonder indicator sterft. Voor het beeldvormen van gefixeerde cellen. Voeg 2%paraformaldehyde toe en plaats op ijs gedurende 10 minuten.

Spoel vervolgens de cellen drie keer met PBS, nu bedekt met één milliliter PBS en bewaar in het donker bij vier graden Celsius, lyceer onmiddellijk de cellen in de zes-putjesschaal. Voor Western Blot-analyses is het belangrijk dat alle cellen tegelijkertijd worden voorbereid, zodat de lyscellen representatief zijn voor de beeldvormingscellen. Voer een Western Blot uit om ervoor te zorgen dat de tag-eiwitten op gelijkwaardige niveaus worden tot expressie gebracht.

Bij het beeldvormen van cellen met een confocale microscoop, is het belangrijk om de instellingen constant te houden gedurende het experiment, zodat de fluorescentie vergelijkbaar is tussen monsters. Zorg ervoor dat u individuele cellen beeldt waarbij pixels niet verzadigd zijn. Aangezien CFP is opgenomen als een transfectiecontrole, selecteert u alleen CFP-positieve cellen voor analyse van BIFC-signalen.

Kwantificeer fluorescentie met behulp van beeldverwerkingssoftware zoals Image J.Open afbeeldingsbestanden in Image J.Ga naar analyse instellingen metingen. Vink de vakjes aan voor gebied en gemiddelde grijze waarde in het metingsvakje. Merk op dat in dit voorbeeld, veneuze afbeeldingen pseudo gekleurd groen zijn en CFP-afbeeldingen, pseudo gekleurd rood.

Gebruik de freehand-selectietool om een omtrek rond de rand van de hele cel in het CFP-kanaal te tekenen en laat deze omtrek op zijn plaats. Verander naar het YFP-kanaal. Ga naar analyse, meet de gemiddelde grijze waarde die de gemiddelde fluorescentie-intensiteit per cel weergeeft voor elke afbeelding.

Teken een cirkel in het YFP-kanaal in een gebied dat geen cel bevat. Neem een meting voor dit gebied als achtergrond. Trek de achtergrond af van elke afbeelding.

Ten slotte, om de gemiddelde fluorescentie-