Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen
May 31st, 2011
Dit artikel beschrijft de procedures met betrekking tot overexpressie en analyse van kleine GTPases in gepolariseerd epitheliale cellen met behulp van micro-injectie techniek.
Deze procedure beoordeelt de effecten van kleine GTP ACE's op gepolariseerd membraantransport. Eerst, co-injecteer DNA-plasmiden die coderen voor de kleine GTP ACE en de reporter-eiwitten in celkernen van gepolariseerde cellen. Vervolgens druk je het DNA uit bij temperaturen die de reporter-eiwitten in het endoplasmatisch reticulum of het TGN zullen vasthouden terwijl de kleine GTPa zich in het cytosol accumuleert, ga verder met het achtervolgen van het reporter-eiwit naar het celoppervlak in aanwezigheid van cyclo heide om verdere eiwitsynthese te voorkomen.
Ten slotte, label je het reporter-eiwit op het celoppervlak voor immunofluorescentie-analyse. Resultaten verkregen uit deze test laten visualisatie toe van de verandering in oppervlaktelokalisatie door middel van confocale microscopie. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transfectie is dat tijdens de korte overexpressietijden die met micro-injectie worden bereikt, secundaire effecten minimaal zijn, waardoor we de primaire effecten van de eiwitten van belang kunnen bestuderen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celpolariteit, zoals hoe kleine gtpa gepolariseerd membraantransport reguleert. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de individuele stappen die nodig zijn voor een succesvolle micro-injectie moeilijk te verklaren zijn zonder visuele hulpmiddelen. Isolateer endotoxine-vrij plasma-DNA met de Sigma Aldrich endotoxine-vrije maxi prep kit volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik voor dit experiment drie heldere 12 millimeter transwell-filters met een poriegrootte van 0,4 micrometer om te kweken.
Plaats vier keer 10 van de vijfde MDCK-cellen op elk filter. Onderzoek na twee dagen de cultuur onder een microscoop om te controleren of de cellen in een gesloten monolaag groeien. Voor micro-injectie.
Op de dag van micro-injectie, bereid 360 bij 15 millimeter platen van vijf liter MM-groeimedia plus 15 millimeter heis voor en plaats ze in een 39 graden Celsius incubator. Bereid bovendien drie 12-well platen van een milliliter MEM-groeimedia plus 50 millimolar heis en 0,1 milligram per milliliter cycloheximide voor en plaats ze in een 31 graden Celsius incubator. Zet de micro-injectiemicroscoop aan, ingesteld als deze invertede microscoop met verwarmd platform, 10 x en 32 x objectieven, en een einor femto jet.
Stel het verwarmde platform in op 39 graden Celsius. Open ook de stikstofgastanklevering naar de luchttafel. Verdun nu het DNA met gefilterd water tot een eindconcentratie van 0,2 milligram per milliliter.
Spin vervolgens DNA in een einor microcentrifuge bij 13.000 RPM gedurende 30 minuten. Verwijder de bovenste portie en plaats deze in een nieuwe buis. Bereid vervolgens de MDCK-cellen voor door de eerste filter uit zijn kweekschaal te nemen met de chirurgische blaadje, de filter uit de filterhouder te knippen en deze in de voorbereide 60 bij 15 millimeter plaat te plaatsen die vijf milliliter 39 graden Celsius verwarmd MEM-groeimedia plus 50 millimolar heis bevat.
Om de filter in de kweekplaat te verzwaren, plaats de chirurgische blaadje in het midden van de filter en breng vervolgens de kweekplaat over op het verwarmde platform van de microscoop. Laad twee tot drie microliters van het verdunde DNA in een micro-injectienaald. Draai de beschermhoes van de naald los en laat hem op de grond vallen.
Om de naald in de houder te plaatsen, druk op de menutoets van de injecteer en zorg ervoor dat de klep gesloten is. Schroef de naald in zijn houder. Wees voorzichtig om de naald niet te strak in te schroeven.
Dit kan leiden tot breuk, druk opnieuw op de menutoets. De toegepaste compensatiedruk zal voorkomen dat het medium tijdens de micro-injectieprocedure in de naald wordt gezogen. Tik ten slotte op de joystick om opgeslagen homering te wissen om de naald op de cellen te laten zakken.
Gebruik het 10 x objectief en breng de naald in de lichtstraal boven het vloeistofoppervlak. Focus nu op de cellen. Focus opnieuw door de focuswiel 180 graden omhoog te draaien en zoek de naald.
Beweeg langzaam de naald in focus. Breng het dan weer uit focus. Werk naar het brengen van de cellen in focus weer.
Breng de naald weer in focus. Herhaal totdat de naald het oppervlak van het medium raakt, waarop een halo wordt waargenomen. Ga door tot op het punt waarop de cellen in focus zijn, maar de naald nog steeds wazig buiten het focusvlak is.
Schakel nu over naar het 32 x objectief en zoek grove instellingen. Stel de Z-limiet in door de apicale membraan aan te raken met de punt van de naald en ongeveer 10 micrometer af te trekken. Aangezien de kernen ongeveer 10 micrometer onder de apicale membraan liggen.
Breng nu de naald een paar microns uit het focusvlak zo snel mogelijk. Richt met de naald boven het nucleair en druk en laat de injectieknop van de joystick los. Begin bij 95 PSI om de juiste injectiedruk te vinden.
Als de druk te hoog is, gaan de cellen kapot. Als de druk te laag is, blijft een witte stip bestaan, maar er gebeurt niets anders. Voer een succesvolle injectie uit die een faseverandering met zich meebrengt zonder verandering in celgrootte.
Injecteer 100 tot 500 cellen binnen het gat van de chirurgische blaadje dat op de cellen ligt. Plaats vervolgens de cellen met de kweekschaal en chirurgische blaadje in een 39 graden Celsius incubator en incubeer gedurende twee uur. Breng ten slotte cellen over in de voorbereide 12-well plaat van een milliliter, MEM plus 50 millimolar 0,1 milligram per milliliter, cyclo heide en incubeer gedurende twee uur bij 31 graden Celsius.
Om verbleken van het uitgedrukte GFP-signaal te voorkomen, bescherm de monsters tegen licht door ze tijdens alle volgende procedures voor oppervlaktekleuring af te dekken met aluminiumfolie. Plaats de cellen in een kweekschaal op een metalen plaat op ijs en was. Eenmaal met ijskoud PBS plus plus, plaats een schoon stukje paraform op de metalen plaat op ijs, pipet 30 microliter druppels van een antilichaam dat de ecto
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft de procedures die betrokken zijn bij overexpressie en analyse van kleine GTPases in gepolariseerde epitheelcellen met behulp van de micro-injectietechniek. De methode maakt het mogelijk om de primaire effecten van eiwitten te bestuderen met minimale secundaire effecten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Eiwitanalyse
Achtergrond
- Kleine GTPases spelen een cruciale rol in cellulaire processen.
- Het begrijpen van hun functie in gepolariseerde cellen is essentieel voor verschillende biologische toepassingen.
- Micro-injectie biedt een unieke benadering om deze eiwitten te bestuderen.
- Vorige methoden kunnen secundaire effecten introduceren die de resultaten bemoeilijken.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van kleine GTPases op gepolariseerd membraantransport te analyseren.
- Om veranderingen in eiwitlokalisatie te visualiseren met behulp van confocale microscopie.
- Om een betrouwbare methode te vestigen voor het bestuderen van eiwitdynamiek in cellen.
Gebruikte methoden
- Co-injectie van DNA-plasmiden die kleine GTPases en reporter-eiwitten coderen, in celkernen.
- Expressie van DNA bij specifieke temperaturen om eiwitlokalisatie te controleren.
- Gebruik van cycloheximide om verdere eiwitsynthese tijdens analyse te voorkomen.
- Immunofluorescence-labeling van reporter-eiwitten op het celoppervlak.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van veranderingen in oppervlaktelokalisatie in gepolariseerde cellen.
- Demonstratie van minimale secundaire effecten tijdens korte overexpressieperioden.
- Biedt inzichten in de dynamiek van kleine GTPases in cellulaire contexten.
- Resultaten gevalideerd door middel van confocale microscopietechnieken.
Conclusies
- De micro-injectietechniek is effectief voor het bestuderen van kleine GTPases.
- Het maakt nauwkeurige controle over eiwitexpressie en lokalisatie mogelijk.
- Bevindingen dragen bij aan een beter begrip van membraantransport in gepolariseerde cellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, high-level overexpression of regulatory proteins in polarized epithelial cells with minimal secondary effects, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By isolating the primary functional impact of small GTPases on membrane trafficking, it improves target validation confidence and predictive value for downstream screening. The approach provides a disease-relevant system for studying basolateral sorting pathways relevant to epithelial barrier function and drug absorption.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing how specific GTPase mutants affect polarized protein trafficking.
- Operational Value: Enables rapid functional assessment within 10–12 hours, accelerating early-stage target interrogation.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing compensatory responses during short overexpression windows.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated polarized cell systems expressing reporter proteins like VSVGts045 for basolateral sorting analysis.
- Quantitative Output: Enables surface localization measurement via immunofluorescence and confocal microscopy for comparative condition testing.
- Reproducibility: Standardized microinjection and temperature-shift protocol supports consistent results across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models epithelial polarity mechanisms implicated in barrier function and nutrient/drug transport.
- Translational Continuity: Links discovery-phase target modulation to preclinical validation of membrane trafficking pathways.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go decisions by clarifying whether a target modulates basolateral delivery in a polarized context.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to validate targets influencing epithelial membrane dynamics before assay development and lead identification stages.
- Discovery Biology: Tests how small GTPase activity states regulate apical-basolateral protein sorting, clarifying pathway involvement.
- Screening: Prepares standardized polarized monolayers for consistent reporter protein trafficking assays.
- Analytics: Provides quantitative readouts of surface localization changes to compare effector conditions.
- Translational Research: Connects GTPase function to epithelial barrier phenotypes relevant to absorption and toxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple regulatory proteins in polarized trafficking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in polarized membrane trafficking through direct functional testing.
- Operational Value: High reproducibility and standardization via defined microinjection, temperature shift, and cycloheximide blockade steps.
- Strategic Value: Faster target triage by minimizing confounding secondary effects seen with prolonged overexpression.
- Portfolio Impact: Enables evidence-based prioritization of targets based on functional impact in disease-relevant epithelial systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques and polarized epithelial cell culture.
- Dependent on specialized equipment including heated-stage microscope and microinjection apparatus.
- Needs standardized protocols for DNA preparation, temperature cycling, and cycloheximide treatment.
- Must account for variability in monolayer polarization quality across cell preparations.
- Limited to adherent polarized cell models; not applicable to suspension or non-polarized systems.
