Name: Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer de micro-injectiemethode voor analyse van kleine GTPases in gepolariseerde epitheelcellen. Deze techniek minimaliseert secundaire effecten en visualiseert eiwitlokalisatie via confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (GM070736) naar H. Fölsch. SF Ang werd ondersteund door een A * STAR Graduate Scholarship Award, en RS Kang werd ondersteund door de cellulaire en moleculaire basis van Disease Training Program (GM8061)

1. Isolatie van plasmide-DNA <ol><li> Gebruik een Sigma-Aldrich endotoxine-vrij maxiprep kit om endotoxine vrij DNA voor te bereiden volgens de protocol van de fabrikant. Deze kit werkt voor ons, omdat het een betrouwbare manier verwijdert alle endotoxinen uit DNA-preparaten. Endotoxinen die met het DNA geïnjecteerd in celkernen zal leiden tot celdood. </li><li> Voeg 100 ul fenol / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) om het geïsoleerde DNA, vortex en spin voor een min bij 13000 rpm in een Eppendorf microcentrifuge. Breng de bovenste water-fase in een nieuwe buis en voeg 100 ul chloroform / isoamylalcohol (24:1), vortex en spin zoals hierboven. Breng de bovenste water-fase waarin de DNA naar een nieuwe buis. Deze stap is nodig om elk eiwit uit het DNA, die voorkomt verstopping van de micro-injectie naald. </li><li> Neerslag van het DNA door het toevoegen van Na Acetaat (pH 6,0) tot een uiteindelijke concentratie van 300 mm en 2 X vol 100% ethanol. Incubeer bij -20 ° C gedurende de nacht. Spin DNA voor 20 min bij 13000 rpm in een Eppendorf microcentrifuge, een keer wassen met 70% ethanol, en resuspendeer in 300 ul endotoxine-vrij water (Sigma-Aldrich). </li><li> Bepaal DNA-concentratie. Een typische DNA-concentratie varieert van 1 tot 5 ug / ul. </li></ol> 2. Cultuur van MDCK cellen <ol><li> Split MDCK cellen. Tellen cellen en zaad 4 X 10 5 cellen op heldere 12-mm Transwell filters (0,4 micrometer poriegrootte, Corning Costar, 3460). Voor een experiment met een mock-injectie-controle en twee verschillende mutante Rab eiwitten je nodig hebt om zaad drie filters. </li><li> Cultuur MDCK cellen in MEM medium met 2 mM L-glutamine, 0,1 mg / ml penicilline / streptomycine en 7% (vol / vol) foetaal runderserum (= MEM groei media) bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Verandering media in de basolaterale kamer elke dag. Dit helpt de polarisatie proces, omdat het bootst de situatie van de epitheelcellen in dieren. </li><li> 2 dagen na zaaien check-in een microscoop of de cellen groeien in een gesloten monolaag. Als u geen gaten te detecteren in de monolaag, voert u uw experiment op dag 3. Als er nog steeds gaten, voert u uw experiment op dag 4. </li></ol> 3. Micro-injectie Procedure en post-injectie Incubaties <ol><li> Op de dag van het experiment voor te bereiden 5 ml MEM groei media plus 50 mM HEPES in een 60 x 15 mm plaat voor elk filter en plaats in een 39 ° C incubator. Daarnaast, stelt u een well van een 12-wells plaat met 1 ml MEM groei media plus 50 mM HEPES en 0,1 mg / ml cycloheximide per filter en plaats in een 31 ° C incubator. </li><li> Zet uw micro-injectie microscoop en stel de verwarmde etappe naar 39 ° C. We maken gebruik van een omgekeerde microscoop (Axiovert 200, Carl Zeiss microimaging, Inc) met een verwarmd podium, 10X en 32X doelstellingen en een Eppendorf Femtojet (Injectman NI2). Ten slotte opent de stikstof gas tank die de lucht tafel levert met stikstof. </li><li> Verdunnen DNA met gefilterd water (gebruik 0,2 um filter) tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mg / ml in een totaal volume van 10 - 100 pl. Vervolgens, spin-DNA in Eppendorf microcentrifuge bij 13.000 rpm gedurende 30 minuten. Verwijder de bovenste gedeelte en plaats in een nieuwe buis. Deze stap zorgt ervoor dat wanneer u uw verdund DNA te laden in de micro-injectie naald u nauwkeurig kunt laden "schoon" DNA. Je DNA is nu klaar voor micro-injectie. </li><li> Bereid uw cellen door het nemen van de eerste filter uit de cultuur schotel. Met een chirurgisch mes (Feather chirurgische Blade, roestvrij staal, nr. 11), knip de filter uit de filterhouder en plaats in 5 ml, 39 ° C warm MEM groei media plus 50 mM HEPES (60 x 15 mm plaat). Verzwaren van de filter in de cultuur plaat met de chirurgische mes die u gebruikt voor het knippen het uit. Plaats het op de filter zodanig dat het gat van de chirurgische mes het midden van het filter omringt. Plaats uw cultuur bord op de verwarmde tafel van de microscoop. </li><li> Belasting 2-3 ul van uw verdund DNA (in dit geval plasmiden die coderen voor VSVGts045-GFP = mock injectie controle) in een micro-injectie naald (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), draai de beschermkap van de naald en laat hem op de vloer vallen . Nu is de naald is klaar om te worden geschroefd in de houder. Om dit te doen, drukt u op de menutoets van je injectman en zorg ervoor dat de klep is uitgeschakeld. Schroef de naald in de houder, pas op niet te schroeven in de naald te strak als dat kan leiden tot breuk. Nu, de menu-toets te drukken, zal de toegepaste P c voorkomen dat de media uit worden gezogen in de naald tijdens de microinjeciton procedure. Tot slot, tikt u op uw joystick om de opgeslagen homing te wissen. </li><li> Het verlagen van de naald op de cellen, gebruik maken van de 10X objectief en breng de naald in de lichtbundel boven de vloeistof. Nu richten op de cellen, opnieuw de aandacht te brengen door te draaien aan de focus wiel 180 ° omhoog, en vind de naald. Vervolgens langzaam de naald te verplaatsen in beeld, dan brengen van de focus weer (te werken tot het brengen van de cellen in beeld weer) komen, de naald in de voorcus opnieuw. Herhaal dit totdat de naald raakt het oppervlak van de media, op welk punt alles wat je ziet is een halo. Als je een punt waarop de cellen in focus te bereiken, maar de naald is nog steeds vaag (dat wil zeggen uit de focal plane) verandering in het 32X objectief en fijn grof instellingen. </li><li> Stel de z-te beperken door het aanraken van de apicale membraan met de punt van de naald en aftrekken van ongeveer 10 micrometer als de kernen waarin ongeveer 10 urn onder het apicale membraan. </li><li> Nadat u de z-limiet, vinden van de juiste inspuitdruk. Begin bij 95 PSI. Als de druk te hoog is, zullen je cellen opblazen. Als je de druk te laag is, ziet u een witte stip die blijft, maar verder niets gebeurt. Met een succesvolle injectie, ziet u een fase veranderen zonder een cel grootte aan te passen. Voor de injectie, breng de naald een paar micron uit de focal plane zo snel mogelijk. Richt met de naald boven de kern (dat wil zeggen het midden van een individuele cel) en druk op de injectie-knop van uw joystick, maar niet houd de knop ingedrukt. </li><li> Injecteer 100-500 cellen in het gat van de chirurgische mes dat ligt aan je cellen. Als u klaar bent, plaats je cellen met de cultuur schotel en chirurgische mes in een 39 ° C incubator, en incubeer gedurende 2 uur Gedurende deze tijd, is VSVGts045-GFP tot expressie gebracht en uitgescheiden in het ER. Echter, bij 39 ° C, kan VSVGts045-GFP niet correct vouwen en kan dus niet verlaten van de ER. Ondertussen zal de kleine GTPase van belang zich ophopen in het cytosol in co-injectie experimenten. </li><li> Na 2 uur, plaats uw cellen in 1 ml MEM groei media plus 50 mM HEPES en 0,1 mg / ml cycloheximide in een 12-well plaat en incubeer gedurende 2 uur bij 31 ° C. Tijdens deze achtervolging periode zal VSVGts045-GFP correct vouwen, laat de ER en wordt geleverd aan het celoppervlak. </li><li> Herhaal de stappen 3,1 tot 3,10 voor de filters twee (injecteren plasmiden die coderen voor VSVGts045-GFP en bijvoorbeeld V5-gelabeld Rab13T22N) en drie (injecteren plasmiden die coderen voor VSVGts045-GFP en bijvoorbeeld V5-gelabeld Rab13Q67L). Elke injectie duurt ongeveer 20 - 60 minuten. Het is echter absoluut van cruciaal belang om elk filter op dezelfde manier te behandelen door de temperatuur verschuiving incubaties en het oppervlak vlekken totdat je het hersteld de cellen. Na fixatie, mag u de rest van uw kleuringsprotocol voor alle filters tegelijk. </li></ol> 4. Oppervlak Kleuring voor immunofluorescentie analyse Let op, om te voorkomen bleken van de GFP signaal van VSVGts045-GFP, de bescherming van de exemplaren van het licht door het bedekken met aluminium folie tijdens alle volgende procedures. <ol><li> Wilt u het oppervlak vlekken uit te voeren, plaats je cellen in een cultuur schotel op een metalen plaat op het ijs en was uw cellen 1x met ijskoude PBS 2 + (PBS [0,2 g / liter KCl, 0,2 g / liter KH 2 PO 4, 8 g / liter NaCl, en 2,17 g / liter Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O], plus 0,1 g / liter CaCl 2 en 0,1 g / liter MgCl 2 x 6 H 2 O). Vervolgens, plaats 30 pi van een antilichaam dat het ectodomein van uw proteïne herkent, in dit geval de muis monoklonaal antilichaam TK1 (IgG 1, verkregen uit de late Thomas Kreis), op een schone parafilm geplaatst op de metalen plaat op het ijs. Plaats het filter met uw cellen ondersteboven op de daling en voeg een paar druppels van het antilichaam op de achterzijde van het filter. Incubeer gedurende 1 uur op ijs. </li><li> Plaats cellen in een 12-wells plaat, was 3x met ijskoude PBS 2 + (of RT warm PBS 2 + zonder voorafgaande oppervlak vlekken), en bevestig met 3% paraformaldehyde gedurende 15 min bij RT. </li><li> Een keer wassen cellen met PBS 2 + en laat in PBS 2 + gedurende 5 minuten. </li><li> Incubeer de cellen in het blokkeren / permeabilisatie buffer (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] saponine in PBS 2 +) met 10% [vol / vol] geit serum. Incubeer 1 uur bij RT. </li><li> Verdunnen primaire antilichamen tegen de uitdrukkelijke Rab GTPase te ontdekken, in dit voorbeeld anti-V5 (muis monoklonaal antilichaam IgG 2a, Invitrogen), 1:200 in het BPB. Spin verdund antilichamen in een Eppendorf microcentrifuge gedurende 10 minuten bij 13.000 rpm. Plaats 30 ul van het antilichaam-oplossing op schone parafilm geplaatst in een vochtige kamer. Plaats de cellen op filter op zijn kop op het antilichaam te laten vallen en incubeer gedurende 1 uur bij RT. </li><li> Plaats cellen terug (rechts boven) in een 12-wells plaat en was 5x meer dan 30 min met BPB bij RT. </li><li> Verdunnen passende secundaire antilichamen, in dit geval geit anti-muis IgG een Alexa 594-gelabeld (voor VSVG detectie aan de oppervlakte, Invitrogen), en Cy5-gelabelde secundaire antilichamen aan uw Rab GTPase, in dit voorbeeld geit herkennen anti-muis IgG 2a Cy5-gelabelde (Jackson ImmunoResearch), 1:200 tot BPB en spin zoals hierboven. Plaats 30 ul antilichaamoplossing op een schone parafilm in een natte kamer en plaats cellen op filter op zijn kop op het antilichaam te laten vallen. Incubeer 1 uur bij RT. </li><li> Herhaal stap 4.6. </li><li> Dip cellen op filter 3X in gedeïoniseerd water en plaats right kant naar boven op microslides. Voeg 10-15 ul mount (10% [wt / vol] DABCO, 50% [wt / vol] glycerol in gedestilleerd water) op de top van de cellen. Plaats 18x18 mm micro dekglas op de top en het gebruik van gezichtstissues voorzichtig op de micro-dekking van glas op de cellen. Seal met nagellak. </li><li> Analyseer exemplaren met een confocale microscoop. We gebruikten een Microsystem LSM 510, Carl Zeiss microimaging, Inc, dat werd uitgerust met een 63x onderdompeling in water lens. </li><li> Voor de voorbereiding van de cijfers aan te passen en te combineren afbeeldingen met behulp van programma's zoals Adobe Photoshop en Adobe Illustrator. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Voor voorbeelden over hoe de co-expressie van kleine GTPases interfereert met VSVG sorteren vriendelijk verwijzen naar gepubliceerde artikelen voor zowel apicale missorting 3, 4 of remming van het oppervlak aflevering 7. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. In de mock-injectie, een injectie van alleen de plasmide coderend VSVGts045-GFP dat wil zeggen, is het eiwit geleverd aan de basolaterale oppervlak van goed-gepolariseerde MDCK cellen zoals beoordeeld door oppervlakte-kleuring (in het rood, figuur 1 A). Merk op dat niet alle van de VSVGts045-GFP wordt geleverd aan de basolaterale membraan tijdens het achtervolgen bij 31 ° C, zoals blijkt uit de uitgebreide intracellulaire signaal voor de totale hoeveelheid eiwit (in het groen, figuren 1 A en B). In cellen die niet goed zijn gepolariseerd VSVGts045-GFP zal ook worden geleverd aan de apicale membraan (figuur 1 B). Als je controle monsters lijken de cel in Figuur 1 B, kun je niet vertrouwen uw gegevens en moeten het experiment met betere-gepolariseerde cellen te herhalen. Schaal bars zijn 5 micrometer.

<ol><li>Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li>
<li>Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li>
<li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li>
<li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li>
<li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li>
<li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li>
<li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li>
<li>Hall, A. Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li>
<li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li>
<li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li>
</ol>

De belangrijkste stappen voor een succesvolle micro-injectie experiment zijn de kwaliteit en de zuiverheid van het DNA en de polariteit van je cellen. Zonder gepolariseerde cellen, zal de injectie controle al mistargeted VSVG en het experiment kan niet worden gebruikt. Als het DNA is van slechte kwaliteit, kan het DNA verstoppen de injectienaald die leidt tot slechte of geen expressie van het gewenste eiwit helemaal. Ook is het raadzaam om expressieplasmiden waarvan bekend is dat leiden tot hoge expressie niveaus, zoals...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Axiovert 200 Microscoop met verwarmd podium </td><td> Carl Zeiss Inc </td><td> Custom order </td></tr><tr><td> Injectman NI2 Femtojet micromanipulator </td><td> Eppendorf </td><td> Custom order </td></tr><tr><td> Femtotips II (micro-injectie naalden) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader tips </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> Heldere 12-mm transwell filter ondersteunt </td><td> Corning Costar </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> Endotoxine-free kit plasmide maxiprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

het analyseren van de functie van kleine gtpases door micro-injectie van plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epitheliale cellen polariseren hun plasmamembraan in biochemisch en functioneel verschillende apicale en basolaterale domeinen waar de apicale domeinnaam wordt geconfronteerd met de &#39;vrije&#39; oppervlakken en de basolaterale membraan is in contact met de ondergrond en de naburige cellen. Beide membraan domeinen zijn van elkaar gescheiden door tight junctions, die een diffusie barrière vormen. Apicale-basolaterale polarisatie met succes kunnen worden samengevat in de cultuur als epitheliale cellen zoals Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen worden gezaaid met een hoge dichtheid op polycarbonaat filters en gekweekt gedurende enkele dagen een twee. Opzetten en onderhouden van celpolariteit wordt geregeld door een reeks van kleine GTPases van de Ras superfamilie, zoals Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 en Rab13 3 4 5 6 7. Net als alle GTPases deze eiwitten cyclus tussen een inactieve GDP-gebonden toestand en een actieve GTP-gebonden toestand. Specifieke mutaties in de nucleotide binding regio&#39;s interfereren met deze fiets 8. Bijvoorbeeld, is Rab13T22N permanent opgesloten in het BBP-vorm en dus noemde &#39;dominant negatief&#39;, terwijl Rab13Q67L niet meer kan hydrolyseren GTP en is dus opgesloten in een staat &#39;dominante actief&#39; 7. Voor het analyseren van hun functie in de cellen zowel dominant negatief en dominant actieve allelen van GTPases zijn meestal uitgedrukt in hoge mate te bemoeien met de functie van de endogene eiwitten 9. Een elegante manier om een ​​hoog niveau van overexpressie in een korte tijd te bereiken is de invoering van de plasmiden die coderen voor de relevante eiwitten direct in de kernen van gepolariseerde cellen gekweekt op filter ondersteunt het gebruik van micro-injectie techniek. Dit wordt vaak gecombineerd met de co-injectie van de reporter-plasmiden die plasma membraan receptoren die specifiek zijn gesorteerd naar de apicale of basolaterale domeinnaam coderen. Een lading vaak gebruikt om lading te analyseren sorteren aan de basolaterale domein is een temperatuur gevoelig allel van de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSVGts045) 10. Dit eiwit kan niet goed voudig bij 39 ° C en zal dus worden bewaard in het endoplasmatisch reticulum (ER), terwijl de regulerende eiwit van belang is gemonteerd in de cytosol. Een verschuiving naar 31 ° C zal dan de mogelijkheid VSVGts045 goed te vouwen, laat de ER en reizen naar de plasmamembraan 11. Dit jacht is meestal uitgevoerd in de aanwezigheid van cycloheximide om verdere eiwitsynthese die leidt tot schoner resultaten te voorkomen. Hier beschrijven we in detail de procedure van microinjecting plasmiden in gepolariseerde cellen en de daaropvolgende incubaties inclusief temperatuur verschuivingen die een uitvoerige analyse van regulerende eiwitten die betrokken zijn bij basolaterale sorteren mogelijk te maken.

Dit artikel beschrijft de procedures met betrekking tot overexpressie en analyse van kleine GTPases in gepolariseerd epitheliale cellen met behulp van micro-injectie techniek.

Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Epitheelcellen polariseren hun plasmamembraan in biochemisch en functioneel onderscheidende apicale en basolaterale domeinen, waarbij het apicale domein is gericht naar ...

Deze procedure analyseert de effecten van kleine GTPase's op gepolariseerd membraantransport. Co-injecteer eerst DNA-plasmiden die coderen voor de kleine GTPase en de reportereiwitten in de celkernen van gepolariseerde cellen. Expressie van het DNA vindt vervolgens plaats bij temperaturen die de reportereiwitten in het endoplasmatisch reticulum of het TGN zullen vasthouden, terwijl de kleine GTPase zich ophoopt in het cytosol. Vervolgens wordt het transport van het reportereiwit naar het celoppervlak gevolgd in aanwezigheid van cycloheximide om verdere eiwitsynthese te voorkomen.Label tot slot het reportereiwit aan het celoppervlak voor immunofluorescentieanalyse. De resultaten van deze assay maken het mogelijk om de verandering in oppervlaktelokalisatie te visualiseren via confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transfectie is dat tijdens de korte perioden van overexpressie die met micro-injectie worden bereikt, secundaire effecten minimaal zijn, waardoor we de primaire effecten van de eiwitten van belang kunnen bestuderen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de celpolariteit, zoals de manier waarop kleine gtpa gepolariseerd membraantransport reguleren. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de individuele stappen die nodig zijn voor een succesvolle micro-injectie moeilijk uit te leggen zijn zonder visuele ondersteuning. Isoleer endotoxinevrij plasma-DNA met de Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep kit volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik voor dit experiment drie transparante transwell-filters van 12 millimeter met een poriegrootte van 0,4 micrometer voor de kweek.Breng vier keer 10^5 MDCK-cellen aan op elk filter. Controleer na twee dagen de cultuur onder een microscoop om te verifiëren dat de cellen groeien in een gesloten monolaag. Voor micro-injectie.Bereid op de dag van de micro-injectie platen van 360 bij 15 millimeter voor met vijf liter MM-groeimedium plus 15 millimeter heis en plaats deze in een incubator van 39 °C. Bereid daarnaast drie 12-wells platen voor met één milliliter MEM-groeimedium plus 50 millimolair heis en 0,1 mg/mL cycloheximide, en plaats deze in een incubator van 31 °C. Zet de micro-injectiemicroscoop aan; deze is geconfigureerd als een omgekeerde microscoop met een verwarmde tafel, 10x en 32x objectieven en een einor femto jet.Stel het verwarmde platform in op 39 °C. Open daarnaast de stikstofgastoevoer naar de luchttafel. Verdun nu het DNA met gefilterd water tot een eindconcentratie van 0,2 mg/mL.Centrifuge het DNA vervolgens in een microcentrifuge op 13.000 RPM gedurende 30 minuten. Verwijder het bovenste gedeelte en breng dit over in een nieuwe buis. Bereid vervolgens de MDCK-cellen voor door het eerste filter met een chirurgisch mesje uit de kweekschaal te halen, het filter uit de filterhouder te snijden en het in de voorbereide plaat van 60 bij 15 millimeter te plaatsen, die vijf milliliter op 39 °C voorverwarmd MEM-groeimedium plus 50 millimolair heis bevat.Om het filter in de kweekplaat naar beneden te drukken, plaatst u het scalpelmes in het midden van het filter en brengt u vervolgens de kweekplaat over naar de verwarmde tafel van de microscoop. Laad twee tot drie µL van het verdunde DNA in een micro-injectienaald. Draai de beschermkap van de naald los en laat deze op de vloer vallen.Om de naald in de houder te plaatsen, drukt u op de menutoets van de injector en controleert u of het ventiel gesloten is. Schroef de naald in de houder. Let erop dat u de naald niet te strak aandraait.Om breuk te voorkomen, drukt u opnieuw op de menutoets. De toegepaste compensatiedruk voorkomt zo dat het medium in de naald wordt gezogen tijdens de microinjectieprocedure. Tik tot slot op de joystick om de opgeslagen homing-instellingen te wissen en de naald op de cellen te laten zakken.Gebruik het 10x objectief en breng de naald in de lichtstraal boven de vloeistof. Stel nu scherp op de cellen. Stel opnieuw scherp door het scherpstelsel 180 graden omhoog te draaien en zoek de naald.Beweeg de naald langzaam in focus. Breng hem vervolgens weer uit focus. Werk vervolgens aan het opnieuw in focus brengen van de cellen.Breng de naald opnieuw scherp in beeld. Herhaal dit proces totdat de naald het oppervlak van het medium raakt, waarna een halo zichtbaar wordt. Ga door tot het punt waarop de cellen scherp zijn, maar de naald nog steeds onscherp is buiten het brandvlak.Schakel nu over naar het 32x objectief en bepaal de grove instellingen. Stel de Z-limiet in door met de punt van de naald het apicale membraan aan te raken en daar ongeveer 10 micrometers van af te trekken. De kernen bevinden zich namelijk ongeveer 10 micrometers onder het apicale membraan.Beweeg de naald nu zo snel mogelijk een paar micron uit het brandpuntvlak. Richt de naald boven de nucleus en druk op de injectieknop van de joystick en laat deze weer los. Begin bij 95 PSI om de juiste injectiedruk te bepalen.Als de druk te hoog is, knappen de cellen open. Als de druk te laag is, blijft er een wit stipje zichtbaar, maar gebeurt er verder niets. Voer een succesvolle injectie uit waarbij een faseovergang plaatsvindt zonder dat de celgrootte verandert.Injecteer 100 tot 500 cellen in het gat van het scalpel dat op de cellen rust. Plaats vervolgens de cellen samen met de kweekschaal en het scalpel in een incubator op 39 °C en incubeer gedurende twee uur. Transfer de cellen ten slotte naar een voorbereide 12-wells plaat met één milliliter MEM plus 50 mM 0,1 mg/mL cycloheximide en incubeer gedurende twee uur bij 31 °C.Om bleken van het tot expressie gebrachte GFP-signaal te voorkomen, moeten de monsters tijdens alle opeenvolgende procedures voor oppervlaktekleuring tegen licht worden beschermd door ze af te dekken met aluminiumfolie. Plaats de cellen in een kweekschaal op een metalen plaat op ijs en was deze eenmaal met ijskoud PBS plus plus. Plaats een schoon stuk parafilm op de metalen plaat op ijs en pipetteer druppels van 30 µL van een antilichaam dat het ectodomein van het eiwit van belang herkent.Plaats nu het filter met de cellen ondersteboven op de druppel en voeg een paar druppels antilichaam toe aan de achterzijde van het filter. Incubeer gedurende één uur op ijs. Was de cellen drie keer met ijskoud PBS plus plus en fixeer deze met 3% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Was de cellen eenmaal met PBS plus plus en laat ze vijf minuten equilibreren in PBS plus plus. Incubeer de cellen vervolgens in blocking permeable buffer. Incubeer één uur bij kamertemperatuur, verdun primaire antilichamen 1:200 in BPB om het tot expressie gebrachte RAB GTP ACE te detecteren, centrifugeer 10 minuten bij 13.000 RPM en pipetteer 30 µL van de antilichaamoplossing op een schoon param geplaatst in een vochtige kamer.Plaats de cellen op het filter ondersteboven op de antilichaamdruppels en laat dit één uur incuberen. Plaats de cellen bij kamertemperatuur weer rechtop in een 12-wellplaat en was vijf keer gedurende 30 minuten met BPB bij kamertemperatuur na incubatie met de passende secundaire antilichamen, inclusief een wastap.Dip de cellen op het filter drie keer in gedeïoniseerd water en plaats ze met de rechterkant naar boven op microscopische objectglazen met 10 µL monteermiddel. Plaats een dekglas van 18 bij 18 millimeter erop en druk het dekglas met behulp van tissues voorzichtig op de cellen. Seal dit tot slot af met nagellak in de schijninjectie van alleen het plasmide dat V-S-V-G-T-S-O 45 GFP codeert. Het eiwit wordt afgeleverd op het basolaterale oppervlak van goed gepolariseerde MDCK-cellen, zoals beoordeeld aan de rode oppervlaktekleuring in cellen die niet goed gepolariseerd zijn.Een deel van het GFP-fusieprotein zal naar het apicale membraan worden getransporteerd. Als controlemonsters er zo uitzien, zijn de gegevens onbetrouwbaar en moet het experiment worden herhaald met beter gepolariseerde cellen. Let op dat niet alle tot expressie gebrachte GFP-fusie tijdens de chase bij 31 °C naar het basolaterale membraan wordt getransporteerd, zoals blijkt uit het uitgebreide intracellulaire groene signaal voor het totale protein. Zodra deze techniek onder de knie is, zou deze na de ontwikkeling ongeveer 10 tot 12 uur in beslag moeten nemen.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van membraantransport om regulatoire eiwitten in gepolariseerde epitheelcellen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in het tot expressie brengen van eiwitten in gepolariseerde epitheelcellen met behulp van de microinjectietechniek.

analyzing-function-small-gtpases-microinjection-plasmids-into

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Directe intranucleaire injectie van cDNA is een effectieve techniek voor transfectie post-mitotische cellen. Deze methode biedt een hoge mate van heterologe eiwitexpressie van een of meerdere cDNA constructen en maakt het mogelijk eiwit functie die moet worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving met een verscheidenheid van enkele cel assays.

Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

Werkwijze voor tijdruimtelijke controle kleine GTPase activiteit licht beschreven. Deze methode is gebaseerd op rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en foto-kooien systemen. Optimalisatie van het licht-bestraling kan de ruimtelijk-tijdelijk bestuurd activering van kleine GTPases op het subcellulaire niveau.

Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Een techniek om genetisch te manipuleren epitheelcellen binnen het...

Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Deze presentatie demonstreert een methode waarbij elektroporatie van adherante, gekweekte cellen wordt gebruikt voor het bestuderen van intercellulaire, junctionele communicatie, terwijl de cellen groeien op een plaatje dat bedekt is met geleidend en transparant indium-tinoxide.

Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide

Dit protocol vergelijkt de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rho-familie GTPases, inclusief Rac1. In vivo, concurreren Rac1-bindende eiwitten voor een enkele bindingsinterface, waarvan de conformatie wordt bepaald door een gebonden nucleotide. Het nucleotide is zowel belangrijk als moeilijk experimenteel te beheersen, vanwege de hoge hydrolysesnelheid.

Het vergelijken van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp competitiebepalingen

We beschrijven een methode voor depletie-reddingsexperimenten die de cellulaire integriteit en eiwithomeostase behoudt. Adenofectie maakt functionele analyses van eiwitten mogelijk binnen biologische processen die afhankelijk zijn van fijn afgesteld actine-gebaseerde dynamica, zoals mitotische celdeling en myogenese, op het niveau van een enkele cel.

Adenofection: Een methode voor het bestuderen van de rol van de Molecular Begeleiders in Cellular Morfodynamica door uitputting-Rescue Experimenten

Guanosine trifosfaat (GTP) binding is een van de vroegste gebeurtenissen bij G-proteïne-koppelde receptor (GPCR) activatie. Dit protocol beschrijft hoe u specifieke GPCR-ligandinteracties farmacologisch kunt karakteriseren door de binding van het radioactief gemerkte GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) te monitoren in Reactie op een ligand van interesse.

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoek naar de prenylation en 5'-Guanosinetrifosfaat (GTP)-laden van Rho GTPase. Dit protocol bestaat uit twee gedetailleerde methoden, namelijk membraan fractionering en een GTPase-linked immunosorbent assay. Het protocol kan worden gebruikt voor het meten van de prenylation en de GTP laden van verschillende andere kleine GTPases.

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP's) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.

Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen

Leer de micro-injectiemethode voor analyse van kleine GTPases in gepolariseerde epitheelcellen. Deze techniek minimaliseert secundaire effecten en visualiseert eiwitlokalisatie via confocale microscopie.

Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Meer video's verkennen