In kaart brengen en de toepassing van Enhancer-trap Flippase Expression in larvale en volwassen Drosophila CNS

Het algemene doel van het volgende experiment is om GAL four expressie te verfijnen door gebruik te maken van weefselspecifiek lipase met GAL 80 conversietools. Dit wordt bereikt door het genereren van een verzameling enhancer trap Philippe transgene vlieglijnen en het bepalen van het CNS expressiepatroon van lipase in elke lijn. Met behulp van een GFP reporter IMMUNOCHEMIE en GFP rapporten kan GL worden onderscheiden van neuronale expressie om GAL four expressie te kruisen in lijnen van belang ET flip lijnen over de vliegen die een GAL 80 conversietool bevatten in het nageslacht.

Clonale analyse kan worden gebruikt om de verfijning van GAL four expressie te analyseren, zoals in het oog. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat enhancer track play-based lijnen samen met GAL 80 conversietools kunnen worden gebruikt met een snelle verzameling van GAL four alliantie die al beschikbaar is in de vlieg gemeenschap. Bovendien kan dit concept worden uitgebreid naar andere GALI four UAS opkomende modelorganismen zoals zebravis.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het in kaart brengen van neurale circuits die onderliggen aan gedrag. Hoewel dit protocol het gebruik van flip base in een subset van fotoreceptorcellen demonstreert, kan de intersectionele methode worden toegepast op analyse van andere weefsels, inclusief niet-neuronale weefsels. Naarmate meer enhancer trap lipase lijnen worden gekarakteriseerd.

Gout four US is een belangrijke techniek die wijd wordt gebruikt door vlieg biologen. Een nadeel van de meeste GAL four lijnen is dat ze te breed worden uitgedrukt om te worden gebruikt voor gedragskaarttekening van de hersenen met behulp van de finger methoden. Het is niet mogelijk om GAL four expressie te verfijnen in T-shirts van belang Voordat een ET flip transgeen wordt gebruikt om de expressie van GAL four expressie lijnen gedeeltelijk te beperken.

Het is eerst nuttig om het expressiepatroon van ET flip x twee transgeen in een laat stadium van ontwikkelende lava en bij volwassenen te kennen om flip a's expressie in CNS te visualiseren. Zet een kruising op tussen mannetjes met het ET t flip X twee transgeen van belang en maagdelijke vrouwtjes die een GFP reporter voor et flip expressie bevatten uit het nageslacht. Verzamel dwalen derde instar F1 larven voor dissectie. Plaats ze in een schone S guard schaal en verwijder eventueel puin met een penseel en spoel de schaal eenmaal af met een keer PBS.

Vul de schaal nu met ijskoud een keer PBS om de larven te anesthetiseren om toegang te krijgen tot het CNS van een lava, houd zijn mondhaak vast met een paar pincetten. Grijp de cuticula nabij het uitgestrekte anterieure sferoïde en pel het terug. Het CNS blijft vastzitten aan de mondhaak samen met enkele andere structuren.

Nu, met behulp van pincetten, verwijder je alle overtollige structuren rond het CNS terwijl je het CNS dissecteert. Breng ze individueel over in een drie wereld Pyrex schaal gevuld met PBS. Zodra alle CNS zijn gedisseceerd, fixeer ze door ze volledig onder te dompelen in 200 microliter 4%PFA op ijs.

Als een CNS drijft, is het niet volledig gereinigd van al het omringende weefsel. Mocht dit gebeuren, gebruik dan een paar pincetten om het CNS opnieuw onder te dompelen in het fixeermiddel na 15 minuten fixeren, was het weefsel met ijskoud PB S3 keer en was het weefsel vervolgens drie keer meer in ijskoud PBT. Het weefsel is nu klaar om te worden geïmager of gelabeld door antilichamen of opgeslagen in PBT bij vier graden Celsius voor later.

Kleuren van dezelfde kruising die wordt gebruikt om larven te maken, verzamel F1 volwassenen vóór de dissectie. Dompel vijf tot tien vliegen onder en koel 95% ethanol gedurende 30 seconden om het was op het oppervlak van de cuticula te verwijderen. Om het ethanol te verwijderen, was de volwassenen drie keer met ijskoud een keer PBS en na de derde was, draag er een van ze over naar een 35 millimeter sil guard schaal gevuld met ijskoud een keer PBS om een volwassene voor dissectie voor te bereiden.

Plaats het met de ventrale kant omhoog en steek een minion pin halverwege door het abdomen. Begin met dissectie door met behulp van pincetten de poten te verwijderen. Vervolgens verwijder je de hoofdcuticula door het hoofd vast te zetten bij de props en tegelijkertijd de cuticula van onder het oog naar de bovenkant van het hoofd te pel.

Verwijder voorzichtig, met behulp van geslepen pincetten, je weefsels rond de hersenen omdat je weefsels sterke autofluorescentie hebben en het de hersenen laat drijven tijdens het fixeren. De hersenen zijn slechts een deel van het volwassen CNS. Het andere deel is het ventrale zenuwkoord of VNC in het thorax en dat moet ook worden gedissecteerd.

Eerst, verwijder je de thoraxcuticula door de vlieg vast te zetten bij de basis van het achterste been en voorzichtig de thoraxcuticula uit te trekken tot aan de basis van de nek. Ten tweede, om de VNC bloot te leggen, spreid je voorzichtig de twee helften van de thoraxcuticula. Ten derde, verwijder je het abdomen van de thorax door het vast te zetten bij de basis van het tweede been en het abdomen weg te trekken vanaf de eerste abdominale roerstaafnacht.

Ten vierde, maak je de VNC schoon door het vast te zetten in het humerusgebied en voorzichtig het weefsel rond de VNC te scheuren. Scheur de ring van bindweefsel rond de cervicale verbinding los en verwijder overtollig weefsel terwijl je de hersenen verzamelt. En VNC breng ze over als peren in een negen wereld Pyrex schaal gevuld met gekoeld een keer PBS op ijs.

Om de volwassen weefsels te fixeren, dompel ze onder in 4%PFA op ijs gedurende 15 minuten. Volg het bad met drie ijskoud PBS wasbeurten en drie PBT wasbeurten. Het weefsel is nu klaar om te worden geïmager of gelabeld door antilichamen om transgeen expressie met nauwkeurigheid te analyseren.

Het is handig om het CNS te labelen met neuronale of gliële markers om een referentiekader te bieden, begin door het weefsel gedurende een nacht bij vier graden Celsius te in