Fysiologische, morfologische en neurochemische Karakterisering van neuronen gemoduleerd door Movement

Het algemene doel van deze procedure is om de fysiologische respons van individuele neuronen tijdens beweging vast te leggen en vervolgens de morfologie en neurochemie van deze neuronen verder te karakteriseren. Dit wordt bereikt door het dier eerst te anesthetiseren en chirurgisch voor te bereiden. De volgende stap is het elektrofysiologisch registreren van de intracellulaire respons van individuele neuronen tijdens beweging.

Na de perfusie van het dier en de verwerking van de hersenen is de laatste stap het visualiseren en analyseren van de fysiologische respons en de neuronale morfologie. Uiteindelijk combineren de technieken van intracellulaire neuronale registratie, immunochemie en analyse om de modulaties in het membraanpotentiaal van individuele neuronen tijdens beweging aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals celcultuur, is dat neuronale verbindingen en synaptische input behouden blijven en dat de neuronen niet ex autotomiseerd of in kunstmatige media geplaatst worden. Op de dag vóór het experiment wordt een neuronale tracer, zoals mierikswortelperoxidase, in de perifere doelgebieden geïnjecteerd om motorneuronen retrograden te labelen.

Anestheseer de rat de volgende dag en plaats deze op een warmtepad; scheer de huid boven de achterzijde van de schedel met een dierenclipper met gebruik van aseptische technieken. Maak een incisie langs de binnenkant van het dijbeen en voer een canule in de vena femoralis in voor aanvullende anesthesie. Voer een andere canule in de arteria femoralis in om de bloeddruk te monitoren.

Plaats tenslotte een canule in de trachea. Plaats de rat vervolgens in een stereotaxisch frame. Voer een craniotomie uit om het cerebellum bloot te leggen, waarbij u zorgvuldig voorkomt dat de grote veneuze sinus, die zich direct onder de verbinding tussen de pariëtale en interpariëtale botten bevindt, wordt geraakt.

Bedek vervolgens het oppervlak van de hersenen met verwarmde minerale olie. Plak nu de onderkaak vast aan een staaf die is gekoppeld aan een elektromagnetische vibrator. De beweging van de onderkaak wordt aangestuurd door stuursignalen van een signaalgenerator naar de vibrator.

Plaats vervolgens een randaarde-elektrode onder de huid naast de craniotomie. Ter voorbereiding van de intracellulaire elektroden worden glazen micro-elektroden gevuld met een IDE- of tetraethyldiamine-kleurstofoplossing. De elektrode-impedantie bedraagt 60 tot 80 megaohm voor axonen met een grote diameter en 80 tot 150 megaohm voor kleine afferente axonen en interneuronen.

Plaats vervolgens de micro-elektrode in de headstage van de elektrometer met behulp van een kleine telescoop die in positie is vastgezet achter de kop van het dier. Visualiseer de micro-elektrode via het 20 x ingesloten reticle van de telescoop. Het doelgebied bevindt zich ongeveer 0,5 millimeter caudaal ten opzichte van de inferieure rand van de colliculus inferior.

Maak nu een kleine opening in de pia mater om de oppervlakte van de hersenen nauwkeurig te kunnen lokaliseren. Compenseer de capacitieve terugkoppeling overmatig, zodat er een terugkoppelsignaal wordt gegenereerd zodra de elektrode de hersenen raakt. Beweeg de elektrode verder totdat deze de hersenen binnendringt.

De volgende stap is het activeren van herhaalde verplaatsing van de onderkaak. Voer vervolgens de elektrode met behulp van een stappenmotor het brein in. Wanneer een neuronale penetratie wordt aangegeven door een plotselinge daling in het dc-potentiaal en voortdurende synaptische activiteit, stop dan met het verder invoeren van de elektrode.

Wanneer de penetratie als stabiel wordt beschouwd, worden de ramp-and-hold en sinusvormige kaakbewegingen gestart. Registreer de neuronale respons en karakteriseer het neuron op basis van deze respons. Gebruik vervolgens een stompe probe om de huid rond het hoofd en de intraorale holte te exploreren om het receptieve veld van het neuron in kaart te brengen.

Onderzoek de reactie van het neuron op andere stimuli, zoals spiercontractie of nociceptieve stimuli. Wanneer de opnames zijn voltooid, injecteer dan één tot vier nano amp DC-stroom voor een totale injectie van 15 tot 70 nano amp minuten. Bewaak de penetratie van de elektrode en staak de stroominjectie.

Als het membraanpotentiaal positiever wordt dan minus 30 millivolts, is de volgende stap het snijden van het hersenweefsel. Verwijder de hersenen na het euthanaseren en perfunderen van het dier. Snijd vervolgens coupes van 50 tot 100 micron in het frontale, sagittale of horizontale vlak.

Om de relatie tussen het gelabelde sensorische neuron en diverse motorische neuronen te visualiseren, wordt het weefsel verwerkt voor H-R-P-D-A-B of Texas red, afhankelijk van het weefsel; aanvullende analyses kunnen worden uitgevoerd met een fluorescentie- of confocale microscoop of met behulp van software voor kwantitatieve colocalisatie. Indien gewenst kan immunochemische verwerking voor synaptofysine worden uitgevoerd om synapsen binnen gelabelde neuronen nauwkeurig te lokaliseren. Deze figuur toont een neuron in de hersenstam dat na elektrofysiologische karakterisering is geïnjecteerd met IDE.

Op basis van de neuronale respons tijdens beweging kan dit neuron worden geïdentificeerd als een secundair afferent neuron van de spierspoel. De bruine omtrek geeft de locatie van de motorische kernus van de nervus trigeminus aan. Deze figuur toont de fysiologische respons van een sensorisch neuron tijdens kaakverplaatsing.

De respons van het neuron wordt weergegeven als de onmiddellijke vuurfrequentie. Merk op dat de respons de mandibulaire verplaatsing nauwgezet imiteert, wat aangeeft dat dit specifieke neuron sensorische feedback geeft met betrekking tot de positie van de mandibula. Deze figuur toont een sensorisch neuron dat reageerde tijdens het spieronderzoek.

Het neuron werd gekleurd met ide na immunochemische processing. De synaptische batons, die zichtbaar zijn als rode zwellingen, zijn gecolokaliseerd met het gele synaptophysine. Groen is een fluorescente missile-kleuring.

Deze figuur is een animatie van een axon van een primair afferent neuron van een spierspoeltje. Meerdere optische coupes van het gelabelde neuron werden gebruikt om de animatie te genereren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals elektronenmicroscopie, confocale microscopie en anterograde of retrograde neuronale labeling, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de ultrastructurele kenmerken van het neuron, de colocalisatie van neurotransmitters met synaptische blaasjes en de neuronale connectiviteit.