Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

Dit experiment is ontworpen om lipidbindende eiwitten te identificeren en om de interactie tussen lipiden en eiwitten te analyseren in een gedefinieerde membraanomgeving van lipidensfers. Eiwitten uit celhomogenaat worden geïncubeerd met vers bereide lipidenvesikels van fosfatidylserine en ceramide. Het reactiemengsel wordt vervolgens aangevuld met Ni-NTA-geconjugeerde magnetische beads om de met de lipidenvesikels geassocieerde eiwitten aan de magnetische beads te verankeren. Vervolgens worden de eiwit-lipidenvesikels gezuiverd via magnetisch geactiveerde cel sortering.

Om de resultaten van het gebonden lipide-eiwit te identificeren, wordt SDS-PAGE Western blotting gebruikt om de lyx-zuivering van endogene en recombinante atypische PKC en een specifiek ceramide-bindend domein tot expressie gebracht in MDCK-cellen aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze nieuwe techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ELISA of plasmonresonantiespectroscopie zoals oppervlaktebinding, is dat de lipide-eiwitinteractie plaatsvindt in een membraanachtige omgeving en dat de bindende eiwitten kunnen worden gezuiverd en geanalyseerd. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie en diagnose van ziekten waarbij lipiden betrokken zijn, omdat de fysiologische lipide-eiwitinteractie bij deze ziekten is verstoord.

Voor sommige van deze ziekten zijn de eiwitdoelen zelfs niet bekend en moeten deze worden geïdentificeerd. Om een therapie op basis van lipiden te ontwerpen, begint men met lipid-SLE's die zijn bereid uit een gedroogd mengsel van equimolaire hoeveelheden fosfatidylserine en C16-ceramide in 100 µL sicaalbuffer. Sonicate gedurende één uur na toevoeging van 300 µL sicaalbuffer, aangevuld met 0,1 mM mangaanchloride. Centrifugeer de monsters bij 12.000 ×g gedurende 20 minuten bij 4 °C en resuspendeer vervolgens het pellet van grote lipidevesikels in 100 µL sicaalbuffer. Voeg één nM van de fluorescerende kleurstof vibrant cm DII toe en incubeer gedurende één uur bij 37 °C om de visualisatie van de SLE-fractie na max-scheiding te vergemakkelijken. Win een roze pellet van vibrant cm dai-gekleurde fosfatidylserine-ceramide-SLE's terug door centrifugatie en resuspendeer in 100 µL trisbuffer.

Bereid vervolgens een detergentvrij cellysaat voor door cellen te soniceren in 300 µL hypertoon buffer van 10 mM tris-HCl, bevattend protease- en fosfataseremmers, en centreer deze. Om membraanresten te verwijderen, voegt u nu het heldere cellysaat toe aan de lipid fysische suspensie en incubeert u het mengsel gedurende twee uur bij 4 °C. Aangezien cellysaten endogene membranen met fosfatyline kunnen bevatten, wordt aanbevolen om het lysaat van deze membranen te zuiveren via aanvullende centrifugatiestappen.

Voeg 20 µL van een XNV-bindingsbuffer en 50 µL van een oplossing met magnetische beads geconjugeerd aan een XNV toe aan het reactiemengsel; incubeer dit gedurende één uur bij 4 °C en voer de magnetische geactiveerde cel sortering (MACS) uit volgens het protocol van de fabrikant. Monitor vervolgens de vibrant CM DII-fluorescentie in de doorstroom- en elutiefracties met een microplaat-fluorescentiereader om de aanwezigheid en hoeveelheid lipiden in een antilichaam-competitie-assay te bepalen. Om de specificiteit van de bindingsreactie van A PKC voor de ceramide-fosfoserine-vesikels te verifiëren, wordt 1 µg anti-PKC zeta konijnen polyklonaal antilichaam gedurende één uur bij 4 °C geïncubeerd met een cellysaat, gevolgd door incubatie met de lipidvesikels.

Ga verder met SDS-PAGE en immunoblottingsanalyse van de eiwitbinding aan de ceramidefosfoserine-residuen in het maximale eluaat voor de in vitro reconstitutie van een lipide-eiwitpolariteitscomplex. Begin met een roze pellet-preparatie van levendig CM-DII gekleurde fosfoserineceramide-vesikels zoals eerder getoond; resuspendeer de vesikels in 100 µL TRI-buffer, aangevuld met 100 µM γ-S-GTP, 1 mM GDP en een combinatie van de relevante recombinante eiwitten. Incubeer vervolgens de reactie drie uur bij 4 °C. Voeg daarna 5 µL van een 20x stockoplossing van een X-in-V buffer en 50 µL X-in-V geconjugeerde magnetische beads toe.

Incubeer het mengsel onder milde agitatie nog eens 30 minuten bij vier graden Celsius. Voer de NX NV magnetische geactiveerde cel sortering verder uit zoals aanbevolen in het protocol van de fabrikant om precipitatie te vergemakkelijken. Vul de elutiefractie aan met 10 micrograms puur e albumin.

Concentreer de eiwitten door weyl flue-precipitatie. De bodemfase bestaat uit chloroform-methanol met verrijkte vibrant cm dii. De bruinachtige interfase bevat de magnetische beads en het geprecipiteerde eiwit.

Kwantificeer de ellu-lipidevesikels door detectie van roze, levendig cm dii in de organische chloroform-methanolfase van de weyl flu-reactie. Gebruik gelijke hoeveelheden lipidevesikels om de eiwitgehaltes tussen monsters te normaliseren en analyseer deze via SDS-PAGE en immunobloting.

Een detergent-vrij lysaat van MDCK-cellen die full-length PKC Zetta tot expressie brengen, C-terminaal gekoppeld aan een groen fluorescent eiwit of een ceramide-bindend domein. De C-terminus van PKC Zetta werd geïncubeerd met fosfoserine.

Na elutie van de max-kolom werden de ceramide-vesikels en eiwitten geanalyseerd via immunoblotting. Het ceramide-bindende fragment C 20 Zeta, EGFP en volledig lengte P KC Zeta werden teruggewonnen uit het eluaat van de max-kolom, wat consistent is met de specificiteit en effectiviteit van de lyx-procedure. De negatieve controle EGFP, die niet bond aan de fosforige ceramide-vesikels uit Syrië, was niet detecteerbaar in het eluaat.

Wanneer Linx wordt aangevuld met andere methoden zoals SDS-PAGE en western blotting of proteomanalyse, kunnen aanvullende vragen worden beantwoord, zoals welke eiwitten deel uitmaken van het lipide-bindend eiwitcomplex. Na de ontwikkeling heeft LabX de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van enkelvoudig lipidenonderzoek om ceramide-geïnduceerde apoptose en celpolariteit in neurale stamcellen en epitheelcellen te onderzoeken.