Name: Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer fagocytose en NET-vorming door neutrofielen observeren in geïnfecteerde longen met behulp van twee-foton microscopie. Deze methode maakt real-time visualisatie van immuuncelgedrag in vivo mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen dr. Lars Philipsen bedanken voor hun hulp bij het optimaliseren van de intravitale films, dr. Jonathan Lindquist voor het zorgvuldig lezen van het manuscript, en alle leden van de Gunzer laboratorium voor nuttige discussies en opmerkingen tijdens de ontwikkeling van de methode. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) om MG

1. Infectie <ol><li> Gezwollen sporen van de schimmel Aspergillus fumigatus (stam ATCC 46645), worden gegenereerd door pre-incubatie in RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlijn, Duitsland), aangevuld met 5% FCS (v / v). 2x10 7 rust conidia zijn geresuspendeerd in 5 ml medium en geïncubeerd in een 6-well weefselkweek plaat (TPP AG; Trasadingen, Zwitserland, catalogus # 92006) voor 7 uur bij 37 ° C. </li><li> Na de zwelling periode worden de sporen fluorescent gelabelde door het toevoegen van 10 pi van calcofluor witte stockoplossing (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Duitsland, catalogus # F3543; [25 mg / ml] in DMSO) aan elke Aspergillus met goed in het 6-well plaat, het bereiken van een uiteindelijke calcofluor concentratie van 50 ug / ml RPMI. Na voorzichtig mengen, zijn de sporen geïncubeerd voor een extra 15 minuten bij 37 ° C. </li><li> In de volgende stap worden de sporen geoogst door filtratie door een 70 um cel zeef (BD Biosciences, Heidelberg, Duitsland). Na het wassen een keer met 10 ml PBS (centrifuge op 900xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur) de pellet wordt geresuspendeerd in 2 ml PBS en het totale aantal gezwollen conidia bepaald door het tellen met een Neubauer kamer. Tenslotte wordt de sporensuspensie wordt gesponnen neer op 900xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, is het supernatant voorzichtig verwijderd en de pellet geresuspendeerd tot de uiteindelijke concentratie van 1x107 sporen per 100 ul PBS. </li><li> Voor infectie, is 100 ul van de spore-oplossing intratracheaal toegepast in vrouwelijke muizen (C57/BL6, 8-10 weken oud, Harlan, Duitsland). Als neutrofielen zijn om ook in acht worden genomen, is het gebruik van Lys-EGFP muizen, die EGFP onder de lysozyme promotor een aan te bevelen. Begin met verlamming van het dier met een enkel IP-injectie van 150 ul Ketamin / Rompun-oplossing (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Duitsland (Ketamin) en Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Duitsland (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml steriel NaCl [0,9%]). 5 minuten later de verdoofde muis kan worden vastgesteld met een elastische band door zijn tanden aan de helling (dwz een schuin oppervlak) aan de intubatie (aanvullende figuur 1) te vergemakkelijken. Met behulp van pincet, is de tong naar een kant getrokken en een 22G inwonende veneuze katheter (B. Braun AG, Melsungen, Duitsland, Vasofix Braunüle) kan voorzichtig worden ingebracht in de luchtpijp onder permanente verlichting met een zwanenhals lamp. De succesvolle inbrengen van de katheter wordt gecontroleerd door het observeren van regelmatige beweging van de thorax van het dier met de frequentie van de mechanische ventilator. Wanneer de succesvolle intubatie is bevestigd, is 100 ui sporesuspensie aangebracht met behulp van een 100 ul micropipet. Dit volume moet worden ingeademd door het dier, zonder bijkomende hulp in 1-2 s. Een verbeterde verdeling van de schimmel deeltjes in de longen wordt bereikt door mechanisch ventileren het besmette dier gedurende 2 minuten met een klein dier ademhalingstoestel (MiniVent, Hugo Sachs, maart-Hugstetten, Duitsland) tegen een tarief van 250 ademhalingen per minuut en een inhalatie volume van 300 ul per ademhaling (aanvullende figuur 2). Na de infectie dieren terug naar hun kooi en geobserveerd om de 5 minuten tot ambulante weer. Muizen vertonen geen tekenen van pijn of ongemak tijdens de volgende incubatietijd. </li></ol> 2. Lung voorbereiding <ol><li> 7 uur na besmetting met de sporen, is het dier gedood door een overdosis van isofluraan (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Duitsland) tot de bewegingen en ademhaling hebben opgehouden voor meer dan 30 seconden. Dit wordt dan gevolgd door thoracotomie als een secundaire methode om klinisch dood te verzekeren en zorgen voor visualisatie en de toegang van de luchtpijp en longen. Dan de borst wordt zorgvuldig geopend voor de longen en de bovenste luchtwegen bloot te leggen. Dan nog een 22G inwonende veneuze katheter wordt ingebracht in de luchtpijp vanaf de blootgestelde epiglottis. Door deze tubulus de longen zijn gevuld met 1 ml voorverwarmd laagsmeltende agarose (2% w / v, Promega, Mannheim, Duitsland) met een 1 ml spuit Omnifix (B. Braun). Zodra de longen worden gevuld van de luchtpijp wordt afgebonden met een kort stukje naaigaren en het hele dier wordt in een koelkast bij 4 ° C. </li><li> 15 min later, wanneer de agarose gestold is, wordt de hele long weggesneden begin van de luchtpijp. Met behulp van een paar scherpe puntige schaar, de rechter long kwab wordt vervolgens verwijderd, wordt de onderkant kort gedroogd op een vel vloeipapier en vervolgens de hele kwab is vastgelijmd aan de voorbereiding blok van een vibratome (Campden Instruments, Verenigd Koninkrijk, 752M Vibroslice ) met behulp van een druppel weefsel lijm voor de bevestiging (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Duitsland, Roti-Coll 1). Na 1 minuut het blok is geïnstalleerd in de maaikamer van de vibratome, die gevuld is met pre-gekoeld (4 ° C) PBS. De vibratome is ingesteld op een mid-range trilling (5 van de 10 Max.) En ook een matige snelheid (5 van de 10 Max.) Zodanig dat een horizontale doorsnede van delongen wordt geproduceerd. De bovenste helft van het orgel wordt dan overgebracht naar een kleine plastic petrischaaltje (5 cm diameter) waar het wordt omgekeerd en vastgezet met een zelfgemaakte platte ring (1 cm inwendige diameter), die wordt gedekt door een reeks van parallelle nylon draden, elk 1 mm van elkaar (aanvullende figuur 3). Tenslotte wordt de petrischaal is gevuld met 10 ml PBS aangevuld met 10 ul van de DNA-kleurstof Sytox Oranje [5 mM] (Invitrogen, Duitsland), wat resulteert in een uiteindelijke kleurstof concentratie van 5 uM. </li></ol> 3. Twee-foton laser microscopie <ol><li> De petrischaal met daarin de longen monster wordt vervolgens geïnstalleerd onder de microscoop doel, zodat de buffer kan worden opgewarmd tot 37 ° C met een temperatuur sensor-gestuurde verwarming (aanvullende figuur 4). Twee-foton microscopie wordt dan uitgevoerd over de hele snijvlak met behulp van een Zeiss LSM 710 NLO microscoop op een rechtopstaande Axio Examiner podium uitgerust met een 20xNA1.0 water dompelen lens (Zeiss, Jena, Duitsland). Voor imaging, zijn verschillende gebieden langs de sectie gescand naar beneden tot 400 micrometer diepte met behulp van een verlichting golflengte van 800 nm opsporen van groen (530 nm) en rood (580 nm) fluorescentie, evenals de tweede harmonische generatie (SHG)-signaal en de blauw calcofluor fluorescentie (bij 400-470 nm emissie) met externe niet descanned detectoren (NDD). Naast de 2-D foto's en time lapse filmpjes (een beeld per 5-10 seconden), kunnen enkele of herhalingsduik 3-dimensionaal beeld stacks vervolgens worden weergegeven als voxel renderings of single uitgebreid onscherpe beelden of 4-D data (3D loop van de tijd) met behulp van verschillende software pakketten. Deze microscopisch kleine opstelling laat de observatie van cellulaire gedrag in een bijna intact milieu dat, zoals vormt de toegangspoort voor een verscheidenheid van de lucht pathogenen, is van enorme immunologische relevantie. Celbeweeglijkheid, fagocytose en NET productie door endogene neutrofielen na infectie met de schimmel Aspergillus fumigatus kan eenvoudig worden onderzocht onder deze in situ-omstandigheden. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Indien het wordt gedaan juist de beeldvorming zal genereren 2 - of 3-kleuren dia's of films. Hoewel de kleur is gedaan in een post processing procedure en is dus vrijelijk aanpasbaar, wij in het algemeen selecteert u een kleur-regeling die de natuurlijke kleur van de kleurstof / signaal, dat wordt gedetecteerd in de relatieve kanaal weerspiegelt. Zo zijn de Sytox kleurstoffen afgebeeld in het rood, de schimmel en de SHG-signaal wordt in blauw weergegeven en, indien aanwezig, EGFP-gelabelde cellen zijn gekleurd in het groen. In het eerste voorbeeld (fig. 1) het blauwe SHG-signaal geeft het weefsel vezels van een niet-geïnfecteerde longen en het rode Sytox signaal wordt geproduceerd door kernen van long-inwoner cellen te openen door de vibratome snijden. In het tweede voorbeeld (fig. 2) een besmette long wordt getoond, waar zowel, alveolaire structuren en schimmel massa's, verschijnen in het blauw, terwijl de kernen en de netten zijn gekleurd rood. Het derde voorbeeld (afb. 3) is uit een Lys-EGFP transgeen dier waar naast de blauwe en rode structuren van de groene neutrofielen ook kan worden gezien. De migratie van neutrofielen en hun fagocytose van individuele schimmels elementen in time lapse sequenties wordt weergegeven in de aanvullende film. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Het uiterlijk van een niet-besmette long slice in 2-kleuren 2-foton microscopie. Een long slice werd bereid uit een niet-geïnfecteerde C57/BL6 muis en afgebeeld, zoals beschreven in het protocol. Hier gepresenteerde zijn de SHG signaal van de alveolaire weefsel structuur (A), de Sytox signaal van celkernen opengesneden tijdens de voorbereiding van de long slice (B), en een overlay van de twee kanalen (C). De doos gebied in (C) wordt gezien vergroot (D). Let op: het vezelige weefsel aan de onderkant van de long slice ten opzichte van de duidelijk alveolaire organisatie binnen de ademhaling-actieve gebieden van de long hierboven. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. De verschijning van een long slice van een Aspergillus besmet wild type dier in twee-kleuren 2-foton microscopie. Een long slice van een C57/BL6 muis besmet 7 uur voor het met A. fumigatus was bereid en afgebeeld, zoals beschreven in het protocol. Afgebeeld is het gecombineerde schimmel structuur en de SHG van de alveolaire weefsel (A), de Sytox signaal van DNA-NET's alsmede celkernen opengesneden tijdens de voorbereiding van de long slice (B), en een overlay van de twee kanalen (C) . De doos gebied in (C) wordt gezien vergroot (D). Let op, zijn de duidelijk verschillende gebieden van de schimmel massa's, longblaasjes, en NET-structuren gemarkeerd met de letters F, A en N, respectievelijk. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. De verschijning van een long slice van een Aspergillus geïnfecteerde Lys-EGFP dier in 3-kleuren 2-foton microscopie. Een long slice van een Lys-EGFP muis software heeft 7 uur voor het metA. fumigatus was bereid en afgebeeld, zoals beschreven in het protocol. Afgebeeld is het gecombineerde schimmel structuur en de SHG van de alveolaire weefsel (blauw), de Sytox signaal van celkernen en netten (rood), en evenals talrijke neutrofielen (groen). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Aanvullende figuur 1. Muis fixatie voor de intubatie. Onder Ketamin / Rompun anesthesie van het dier wordt bevestigd met een elastische band op zijn tanden om de intubatie te vergemakkelijken met een 22G inwoning veneuze katheter. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Aanvullende figuur 2. Mechanische ventilatie muis. Geïntubeerd De muis is geïnfecteerd door een IT-toepassing van 1x10 7 sporen geresuspendeerd in 100 ul PBS. Een verbeterde verdeling van de schimmel deeltjes in de longen wordt bereikt door mechanisch ventileren de geïnfecteerde muis met een klein dier masker. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Aanvullende figuur 3. Longkwab fixatie. Na de bereiding van de rechter long kwab het orgel is vastgesteld in een petrischaal met behulp van een laboratorium-en-klare platte ring die wordt gedekt door een reeks van parallelle nylon draden. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Aanvullende figuur 4. Twee-foton beeldvorming setup. De petrischaal met de rechter long kwab is geïnstalleerd op een mat onder de twee-foton microscoop na toevoeging van de DNA-kleurstof Sytox Orange. Aanvullende film:. Neutrofielen migratie en fagocytose schimmel Aspergillus elementen in geïnfecteerde longen zoals gezien door tijdsverloop twee-foton microscopie van een levende long slice zeven uur na infectie met de schimmel Neutrofielen zijn groen, schimmel-elementen en SHG zijn blauw, en celkernen als evenals NET-structuren zijn weergegeven in het rood. De real-time van het experiment wordt getoond op de onderste rechts. De schaal bar geeft 50 micrometer. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1%20-%20supplemental.mpg">Klik hier om video te bekijken</a>

<ol><li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li>
<li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li>
<li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CD8%28%2B%29+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li>
<li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8%28%2B%29+T+cell+responses+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li>
<li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li>
<li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li>
<li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li>
<li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li>
<li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li>
<li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li>
<li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li>
<li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li>
<li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li>
<li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li>
</ol>

Real-time twee-foton microscopie in vivo of in intacte organen heeft opgedaan grote belang in studies het omgaan met de fysiologie van de immuuncellen in de afgelopen 10 jaar. Het was met deze techniek die belangrijke gebeurtenissen, zoals de dynamiek van het T-cel activatie in de lymfeklieren werd voor het eerst zichtbaar 2-4. Meer recent hebben onderzoekers ook begonnen met specifieke cellulaire functies, zoals de eerste stappen in de vorming van effector cellen in lymfeweefsel het gebruik van deze aanpak 5 te analyseren. Echter, hoewel een aantal nieuwe biologische concepten zijn onthuld met deze methode, er zijn nog steeds uitdagende en belangrijke vragen waarvoor geen intravitale visualisatie studies zijn tot nu toe gepubliceerd. Met name geldt dit voor het zoogdier long. Het interessante aspect van dit orgel, als instap-poort voor een verscheidenheid van de lucht pathogenen, maakt het een van de meest cruciale vlakken waarop immunologische processen plaatsvinden in het lichaam van zoogdieren. Bij elke ademhaling over de gehele levensduur, worden ongewenste deeltjes ingeademd waarvan sommige hebben het potentieel om levensbedreigende infecties veroorzaken 6. Het spreekt voor zich dat op zo&#39;n gevoelig en bedreigde terrein een dicht netwerk van afweermechanismen dient aanwezig te zijn tentoonstelling van de gehele repertoire van immuunreacties. Aan de andere kant is het zeer belangrijk dat de veroorzaakte immunologische strijd tegen potentiële ziekteverwekkers op een dergelijk &quot;vuile&quot; plaats strak wordt gecontroleerd. Overdreven reacties van het immuunsysteem zijn voorzien van een hoog risico van nadelige gevolgen voor het eigen lichaam door massaal verwonden orgaanweefsel na stimulatie van de niet-specifieke immuun-cel acties 7,8. In het licht van deze gedachten zou het zeer interessant en nuttig om de mogelijkheid om te onderzoeken in cel gedrag van zoogdieren longen onder ware in vivo omstandigheden. Echter, het feit dat een dergelijk systeem heeft tot dusver niet succesvol duidelijk wijst geïmplementeerd om de enorme moeilijkheden die moeten worden opgelost bij het opzetten van een werkprotocol. De meest veeleisende uitdaging is waarschijnlijk richten stabiliteit. De longen als het orgaan die verantwoordelijk is voor de ademhaling is onder constante beweging in alle drie de richtingen van de ruimte te realiseren inademing. Deze omstandigheid alleen veroorzaakt ernstige beeldvorming problemen en kan worden beschouwd als een intravitale imagers &quot;nachtmerrie&quot;. Al een lichte beweging naar elke dimensie in de ruimte heeft een enorme verslechtering van invloed op de microscopische weergave, die moet stabiel zijn met micrometer precisie om het genereren van betekenisvolle beelden 9. Gezien de krappe inherent lokale focus 10, twee-foton microscopie is nog gevoeliger aan focal instabiliteiten, als een dislocatie van een bepaalde structuur in het bereik van slechts enkele micrometers in de Z-richting is gelijk aan een volledig verlies van focus en dus een mislukt experiment. Het protocol die in deze studie voor de observatie van de immuuncellen in de longen van muizen is nog niet een in-vivo-applicatie, maar een goede benadering van de situatie in een functioneel intacte long 11. Ex vivo benaderingen voor de beeldvorming lymfocyten, bijvoorbeeld in geëxplanteerde lymfe nodes, is aangetoond dat ze resultaten gelijkwaardig zijn aan het geval in vivo waarnemingen 12 opbrengst en zijn dus zeer relevant 5. De in-situ waarnemingen in de longen plakken, die alleen mogelijk zijn met onze aanpak, vinden plaats in een geïnfecteerde longen kort na excisie. De 3D-integriteit tijdens het snijproces wordt verzekerd door de agarose matrix, een essentiële stap om een ​​nauwkeurig gecontroleerde snijproces van de long mogelijk te maken. Hoewel het noodzakelijk is om de geëxplanteerd long voor een korte periode tot een verharding van de agarose matrix laat afkoelen, is het mogelijk om terug te keren naar de buurt van fysiologische omstandigheden voor cellen na het uitsnijden en opwarmen van het weefsel. Dit wordt duidelijk aangetoond door onze gegevens, waaruit blijkt dat onder deze omstandigheden neutrofielen zijn zeer actief en vertonen hun volledige potentieel als wendbaar fagocyten, die noodzakelijk zijn voor de effectieve klaring van een Aspergillus fumigatus infectie. Ze patrouilleren in het longweefsel passeren epitheliale barrières om de binnenste delen van de longblaasjes bereiken en bovendien zij actief nemen schimmelsporen 11. Een belangrijke conclusie van dit werk was de verschijning van de structuren die lijken op neutrofielen extracellulaire vallen (NET) in de Aspergillus geïnfecteerde orgaan. NET zijn een zeer recente bevinding van een nieuw afweermechanisme in neutrofielen 13. Echter, sinds de eerste beschrijving in 2004 is het aantal van fysiologische of pathologische omstandigheden in dierlijke modellen of mensen waar dit fenomeen is waargenomen of ontbreekt is explosief stijgende 14-16. Interessant, maar zo veel werk is besteed aan deze structuren door zo veel verschillende groepen, de meeste rapporten zijn nog steeds op een zeer beschrijvend niveau en niet veel isbekend over het mechanisme van de NET-release en de regelgeving. Met ons protocol konden we voor het eerst NET vezels in een geïnfecteerde longen te tonen. Verder konden we tonen het belang van vers aangeworven neutrofielen als moleculaire schimmel structuren voor hun optreden of remming 11. Dit toont duidelijk het potentieel van onze methode om de afzonderlijke stappen van de NET-vorming in meer detail te onderzoeken. Men zou kunnen denken om bijvoorbeeld neutrofielen gebruik van geschikte knock-out muizen hun vermogen van de NET-vorming in adoptieve overdracht experimenten te observeren. Dus, hoewel de directe waarneming van neutrofielen immigratie uit het perifere bloed is niet mogelijk met dit systeem te wijten aan het ontbreken van bloedvoorziening na orgaantransplantatie explantatie, we geloven nog steeds dat ons protocol is een waardevol en relatief gemakkelijk te hanteren aanpak die de beeldvorming van maakt vroeg of laat stappen in de immunologische afweer tegen longinfecties. Dit is dus een belangrijke stap op weg naar het onderzoeken van dit fenomeen binnen de ademende long van levende dieren.

directe observatie van fagocytose en de net-vorming door neutrofielen in infected longen met behulp van twee-foton microscopie

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Na het maagdarmkanaal, de longen is de tweede grootste oppervlak voor interactie tussen de gewervelde lichaam en het milieu. Hier moet een effectieve gasuitwisseling worden gehandhaafd, terwijl het vermijden van infectie door de vele ziekteverwekkers die worden ingeademd tijdens de normale ademhaling. Om dit te bereiken, een schitterende set van defensie strategieën te combineren humorale en cellulaire immuun mechanismen bestaat. Een van de meest effectieve maatregelen voor acute verdediging van de long is de werving van neutrofielen, die ofwel fagocyteren de ingeademde ziekteverwekkers of doden door het vrijgeven van cytotoxische stoffen. Een recente toevoeging aan het arsenaal van neutrofielen is hun explosieve afgifte van extracellulaire DNA-NET&#39;s, waardoor bacteriën of schimmels kunnen worden gevangen of geïnactiveerd zelfs na de NET loslaten van cellen gestorven zijn. We presenteren hier een methode die toelaat om direct waar te nemen neutrofielen, migreren binnen een recent geïnfecteerde longen, fagocytose schimmelpathogenen en visualiseren de uitgebreide netten die zij hebben geproduceerd door het geïnfecteerde weefsel. De methode beschrijft de bereiding van dikke levensvatbare long plakken 7 uur na intratracheale infectie van muizen met sporen van de schimmel Aspergillus fumigatus en hun onderzoek door multicolor time-lapse twee-foton microscopie. Deze aanpak maakt het mogelijk om direct te onderzoeken antifungale verdediging in de moedertaal van longweefsel en daarmee opent een nieuwe weg voor het gedetailleerd onderzoek van pulmonale immuniteit.

We laten zien, hoe twee-foton microscopie gebruikt voor de observatie van de dynamiek van neutrofiele granulocyten in de longen besmet terwijl ze fagocyteren pathogenen of produceren neutrofielen extracellulaire vallen (NET).

Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie

Na het gastro-intestinaal tract is de long het op één na grootste oppervlak voor interactie tussen het lichaam van gewervelde dieren en de omgeving. Hier vormt een ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van levende neutrofiele granulocyten en extracellulaire DNA-netten in een long die onlangs is geïnfecteerd met een schimmelpathogeen. Eerst worden muizen die positief zijn voor EGFP in hun neutrofielenpopulatie geïnfecteerd met candida die eveneens fluorescent gelabeld zijn. Vervolgens krijgt de infectie zeven uur de tijd om zich te ontwikkelen, waarna het geïnfecteerde dier wordt geofferd.Vervolgens worden de longen van het geïnfecteerde dier gevuld met laagsmeltend agarose om het snijden met een microtoom te vergemakkelijken. Tot slot wordt met een microtoom een dikke plak van het geïnfecteerde longweefsel verkregen en worden de longneutrofielen geanalyseerd. DNA-netten en schimmelelementen worden in beeld gebracht.Uiteindelijk kunnen met multicolor tweedefotonmicroscopie beelden met een hoge resolutie of filmsequenties van granulocyten in levend longweefsel worden verkregen. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande technologieën is dat de immuuncellen die verantwoordelijk zijn voor het opruimen van de infectie direct in hun natuurlijke omgeving kunnen worden waargenomen. Dit kan tijdens het proces van netvorming en het doden van schimmels, waardoor een analyse van de neutrofielenfysiologie met aanzienlijk minder artefacten mogelijk is.Ik heb deze techniek ontwikkeld toen Mathias mij lastigviel met zijn dwingende vragen over de in vivo relevantie van mijn eerdere in vitro bevindingen, en ik zal deze techniek de komende minuten presenteren. Om gezwollen kedia van de milieuschimmel Aspergilus fumigatus te genereren, voegt u vijf milliliter medium toe aan een zes-wells celkweekplaat, brengt u vervolgens 2 × 10⁷ rustende CEDIA over naar de plaat en incubeert u de sporen zeven uur lang bij 37 °C in 5% CO2 in een BSL-2 faciliteit.Na de zwelperiode werden de sporen fluorescent gelabeld door 10 µL calcior white stalk-oplossing aan elke well toe te voegen, gevolgd door voorzichtig mengen. Incubeer de plaat nogmaals 15 minuten onder dezelfde omstandigheden. Om de fluorescent gelabelde sporen te oogsten, wordt een cellzeef van 70 µm bovenop een conische buis van 50 mL geplaatst. Verzamel de sporen uit de plaat met een pipet en breng vervolgens de mediumoplossing via de cellzeef in de buis over.Centrifuge vervolgens de cellen 5 minuten bij 900 Gs op kamertemperatuur en verwijder het medium. Was de sporen daarna met 10 milliliters PBS onder dezelfde centrifugecondities. Resuspendeer de sporepellet in twee milliliters PBS en bepaal het totaal aantal gezwollen canadia met een celsteller. Centrifugeer de sporsuspensie opnieuw onder dezelfde condities als voorheen en verwijder daarna voorzichtig het supernatant.Resuspendeer het bezonken sediment tot een uiteindelijke concentratie van 10⁷ cellen per 100 µL PBS. Om de muis voor te bereiden op infectie met de sporenoplossing wordt het dier geanestheseerd en wordt de sedatie bevestigd door het ontbreken van een reactie op een knijpreflex in de teen. In deze video worden lys EGFP-muizen gebruikt, die EGFP onder de lysozym-promotor dragen en derhalve EGFP-positieve neutrofielen hebben. Vijf minuten na toediening van de anesthesie en bevestiging van de sedatie wordt de genarceerde muis met een elastiekband bij de tanden aan een rand opgehangen onder een flexlamp. Gebruik een pincet om de tong opzij te trekken en voer een 22 gauge verblijvende veneuze katheter in de trachea van het dier in.Na de succesvolle inbreng van deze slang gebruikt u een micropipet van 100 µL om 100 µL van de sporensuspensie toe te dienen. Om vervolgens de distributie van de schimmelpartikels in de longen te verbeteren, wordt het geïnfecteerde dier gedurende twee minuten mechanisch geventileerd met een respirator voor kleine dieren bij een ademhalingsfrequentie van 250 ademhalingen per minuut en een inhalatievolume van 300 µL per ademhaling. Verwijder tot slot de katheter en plaats de muis zeven uur lang terug in de kooi terwijl de infectie zich ontwikkelt.Observe het herstel van het dier elke vijf minuten totdat het opnieuw kan lopen, vlak voor het einde van de infectieperiode. Smelt 20 milliliters laagsmeltende agarose in een magnetron en houd deze warm zodat de agarose niet stolt voordat deze wordt geïnjecteerd. Koel op dit moment ook een fles PBS tot vier graden Celsius in de koelkast.Aan het einde van de infectieperiode wordt het dier geëuthanaseerd. Gebruik naalden om de muis op een siliconen preparatiemat te fixeren en open voorzichtig de borstkas met een schaar en een pincet om de longen en de bovenste luchtwegen bloot te leggen. Voer, beginnend bij de blootgelegde epiglottis, een tweede 22 gauge verblijvende veneuze katheter in de trachea in.Met een naai naald wordt een standaard naaigaren rond de trachea gewikkeld ter voorbereiding op de daaropvolgende stap van het vullen van de longen met agros. Vul vervolgens een spuit van one milliliter met de voorverwarmde aros en dien de oplossing via de katheter toe om de longen hiermee te vullen. Zodra de longen gevuld zijn, wordt de trachea dichtgebonden met het voorbereide naaigaren terwijl de katheter wordt verwijderd, waarna het gehele dier gedurende 15 minuten in een koelkast bij vier degrees Celsius wordt geplaatst.Nadat de aros is gestold, exciseer je de gehele long uit de geopende borstkas, beginnend bij de trachea, en spoel je deze met voorkoelde PBS met behulp van een scherp gepunte schaar. Verwijder de rechterlongkwab. Droog de onderkant van de kwab kort af op een vel keukenpapier en fixeer de kwab vervolgens gedurende één minuut aan een vibram-preparatieblok met een druppel weefsellijm.Plaats vervolgens het blok in de snijkamer van de vibratoom en vul de kamer daarna met het vooraf gekoelde PBS. Stel het scheermes in op een gemiddelde vibratie met een mediale aansturing en maak een horizontale dwarsdoorsnede van de long. Plaats vervolgens de bovenste helft van het gesneden longweefsel ondersteboven in een plastic Petrischaal van vijf centimeter diameter.Fixeer het longweefsel aan de petrischaal door er een platte ringplaat bovenop te plaatsen. Vul de schaal met 10 milliliters PBS en voeg 10 microliters cytoxine-kleurstof toe. Plaats ten slotte de schaal met het longweefsel onder de microscoopobjectief, zodat de buffer door een temperatuursensor-gestuurde verwarming tot 37 degrees Celsius kan worden opgewarmd voor beeldvorming.Verschillende gebieden langs de dissectie-R scan naar een diepte van 400 micrometer met een verlichtingsgolflengte van 800 nanometer, waarbij groene fluorescentie van 530 nanometer en rode fluorescentie van 580 nanometer worden gedetecteerd, evenals het signaal van de tweede harmonische generatie of SHG. In de blauwe kleur is de fluorescentie bij een emissie van 400 tot 470 nanometer met externe non-descanning detectoren of NDD; hier in het blauw wordt het SHG-signaal van de alveolaire weefselstructuur van een niet-geïnfecteerde long van een C 57 black six muis getoond. Let op het fibreuze weefsel aan de onderzijde van de longsnede in vergelijking met de duidelijk alveolaire organisatie binnen de ademactieve gebieden aan de bovenzijde van de long.In deze figuur is het cyt talk-signaal van longcelkernen, die tijdens de bereiding van de longcoupe zijn opengebroken, in rood gevisualiseerd. Deze figuur toont een overlay van de twee kanalen met een close-up van het omkaderde gebied van het weefsel dat hier wordt getoond. Het blauwe SHG-signaal geeft de alveolaire en schimmelstructuren aan die aanwezig zijn in een longcoupe van een C 57 black six-muis die zeven uur eerder is geïnfecteerd met afu tis.In deze figuur toont het rode Cyt talk-signaal niet alleen de kernen van longcellen die zijn opengebroken tijdens de preparatie van de longslice, maar ook de DNA-netten. Een overlay van de twee kanalen is te zien in deze vergrote afbeelding van het omkaderde gebied uit de vorige figuur. Duidelijke gebieden van schimmelmassa's, alveoli en netstructuren zijn respectievelijk aangegeven met de letters FA en N, en de gecombineerde schimmelstructuur en SHG van het alveolaire weefsel in het blauw.Het cytoskeletsignaal van celkernen is rood, evenals talrijke long-infiltrerende neutrofielen. Groen kan hier worden gevisualiseerd in een plakje longweefsel van een lys EGFP-muis. Zeven uur na infectie met afu goddess zijn neutrofielen in het groen te zien terwijl ze migreren en schimmelelementen in het blauw fagocyteren in aspers-geïnfecteerde longen, zoals te zien is via time-lapse.Tweefotonmicroscopie van een levende longsnede. Zeven uur na infectie zijn celkernen en netstructuren in rood afgebeeld. De werkelijke tijd van het experiment wordt rechtsonder weergegeven en de schaalbalk is indicatief voor 50 micrometers.Deze methode kan nu inzicht bieden in schimmelinfecties. Ze kan mogelijk ook worden toegepast op andere systemen, zoals virale of bacteriële infecties, en mogelijk inzicht verschaffen in de functie van andere residente immuuncellen in de long.

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een microscoopgebaseerde techniek om de vroege cascades van gebeurtenissen tijdens fagocytose van pathogenen zoals de schimmels Candida albicans en deeltjes die groter zijn dan 0,5 µm, waaronder zymosan en IgG-gecoate kralen, te visualiseren en te kwantificeren.

Het visualiseren van de vroege stadia van Phagocytosis

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige methode om de pH en phagosomal gebied en het cytoplasmatische pH van mens en muis neutrofielen via de ratiometrische indicator seminaphthorhodafluor (SNARF) -1 of S-1 te meten. Dit wordt bereikt met behulp van levende cellen confocale fluorescentie microscopie en beeldanalyse.

Beeldvorming van de neutrofielen phagosome en cytoplasma Met behulp van een Ratiometrische pH Indicator

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

Neutrofiele extracellulaire vallen (netten) zijn driedimensionale structuren gegenereerd door geprikkeld neutrofiele granulocyten. Het is in de afgelopen jaren duidelijk geworden dat netten betrokken zijn bij een grote verscheidenheid aan ziekten. Detectie van netten in weefsel kan diagnostische relevantie hebben, zodat gestandaardiseerde protocollen voor het labelen van NETTOCOMPONENTEN vereist zijn.

Immunofluorescentie-etikettering van humane en Muriene neutrofiele extracellulaire vallen in paraffine-ingesloten weefsel

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) worden in verband gebracht met verschillende ziekten en immunofluorescentie wordt vaak gebruikt voor hun visualisatie. Er zijn echter verschillende kleuringsprotocollen en in veel gevallen wordt slechts één type weefsel onderzocht. Hier stellen we een algemeen toepasbaar protocol op voor het kleuren van NET in muizen en menselijk weefsel.

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.

Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Hier presenteren we een protocol om de getransplanteerde linkerlong van de muis intravitaal in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamiek en interacties in real-time na longtransplantatie bij muizen.

Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong

Leer fagocytose en NET-vorming door neutrofielen observeren in geïnfecteerde longen met behulp van twee-foton microscopie. Deze methode maakt real-time visualisatie van immuuncelgedrag in vivo mogelijk.

Directe observatie van fagocytose en de NET-vorming door neutrofielen in Infected longen met behulp van twee-foton microscopie

Meer video's verkennen