High-throughput meten en indelen van organische P in milieumonsters

Het algemene doel van deze procedure is het classificeren van enzymatisch gehydrolyseerd organisch fosfor in extracten van bodem- of meststalen. Dit wordt bereikt door de monsters eerst te extraheren met een natriumhydroxide-EDTA-oplossing en de pH van de extracten aan te passen. Vervolgens worden deze aangepaste extracten geïncubeerd met twee verschillende enzymoplossingen.

Op een plaat met 96 putjes is de laatste stap het meten van het door enzymen vrijgekomen orthofosfaat met behulp van molybdeenblauw-colorimetrie. Uiteindelijk kunnen de meeste natuurlijke orthofosfaatmonoesterfosfor- en diesterfosforvormen in bodem- of meststalen worden geclassificeerd op basis van de differentiële afgifte van orthofosfaat via de enzymatische hydrolysemethode. Deze methode kan goedkoop worden uitgevoerd in elk standaardlaboratorium.

Het belangrijkste voordeel ten opzichte van bestaande methoden, zoals fosfor 31 nucleaire magnetische resonantiespectroscopie, is dat het de potentie van natuurlijke bodemenzymen kan meten om in de toekomst orthofosfaat vrij te maken uit organische erwtenverbindingen. Daarom kunnen gegevens verkregen met deze methode helpen bij het voorspellen van de bodemvruchtbaarheid of het potentieel van de bodem om schadelijke hoeveelheden algenbeschikbaar orthofosfaat vrij te geven. Voeg 30 milliliter van de 0,25 molaire natriumhydroxide-oplossing toe aan twee gram van het natte of gedroogde monster in een 50 milliliter conische buis.

Incubeer gedurende 16 uur bij kamertemperatuur onder agitatie. Centrifugeer de monsters bij 3000 ×g gedurende 30 minuten en breng vervolgens 100 µL over naar een microcentrifugebuis van 1,5 mL die reeds acetaatbuffer bevat. Het bijgestelde monster heeft een totaalvolume van 1 mL en een pH van 5,0.

Bereid twee voorraadoplossingen voor die 0,5 units per milliliter zuur fosfatase bevatten in 10 milliliter vers bereide 0,1 molar natriumacetaat pH 5. Voeg nu gereconstitueerde geliofiliseerde nuclease NP1 van Penicillium Citron toe aan een van de 10 milliliter buisjes met zuur fosfatase voorraadoplossing tot een eindconcentratie van 2,5 units NP1 per milliliter, voorzichtig gemengd door enkele malen te inverteren; centrifugeer de twee enzymoplossingen bij 3000 ×g gedurende 30 minuten. Om een kalibratielijn op te stellen, begint u met het toevoegen van 1 milliliter van een 1 millimolaire kaliumfosfaatvoorraadoplossing aan een 1,5 milliliter centrifugebuisje en voert u zeven 0,5 milliliter seriële verdunningen uit; gooi het eerste buisje weg, zodat de uiteindelijke verdunningen variëren van 20 µM tot 0,625 µM fosfor.

Breng nu de ORTHOFOSFAAT-standaarden over naar de laatste twee kolommen op de plaat, beginnend met nul NM orthofosfaat in rij A en eindigend met 20 nm orthofosfaat in rij H in de eerste drie wells van kolom 10. Voeg 40 µL PP plus GP enzymoplossing toe aan de volgende drie wells van kolom 10. Voeg 40 µL PP plus GP plus NP een-enzymoplossing toe.

Voeg ten slotte 40 µL van 100 mM acetaatbuffer toe aan alle zes de wells. Nu moet elk van de eerste zes wells in kolom 10 80 µL oplossing bevatten voor de volgende twee wells. Voeg 40 µL natriumacetaatoplossing toe die 10 M glucose en zes fosfaat bevat, en 40 µL PP plus GP enzymoplossing.

Verdeel voor elk te testen monster 40 µL van de pH-gecorrigeerde monsterextracten over wells één tot negen in maximaal acht rijen, nadat alle monsters zijn verdeeld. Gebruik een multichannelpipet om de PP plus GP-enzymoplossing over kolommen één tot drie te verdelen, PP plus GP plus NP over kolommen vier tot zes en 0,1 M natriumacetaatbuffer over kolommen zeven tot negen. Voer deze stap snel uit om te garanderen dat alle monsters een gelijkwaardige incubatietijd krijgen.

Dek de 96-wellplaat af met een deksel en incubeer de monsters, enzymoplossingen, controles en de kalibratiecurve exact één uur bij 37 °C in gedeïoniseerd water. Bereid 50 milliliters van elk van de vier stamoplossingen voor. Oplossing A moet dagelijks snel worden bereid met behulp van een multichannelpipet.

Voeg 25 µL SDS, 100 µL van oplossing a, 20 µL van oplossing B en 50 µL van oplossing C toe aan alle wells in de 96-wellplaat. Dek de plaat af en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Meet tenslotte de absorbentie bij 850 nm in een willekeurige instelbare microplaatlezer met behulp van een spreadsheetapplicatie.

Zet eerst de kalibratiecurve voor anorganisch fosfor uit met nul tot 20 nanomoles fosfor op de x-as en het gemiddelde van de dubbele absorbentiemetingen op de y-as, voer een lineaire regressie uit en bepaal de vergelijking van de best passende lijn. Bereken vervolgens het achtergrondgehalte aan anorganisch fosfor door de waarden in kolommen één tot drie te middelen en de kalibratiecurve op de dataset toe te passen. Om vervolgens het fosfor te bepalen dat afkomstig is van gehydrolyseerde fosformonoesters, middelt u de triplaat samplewaarden uit kolommen vier tot zes en trekt u de controle-enzymoplossing plus het anorganische fosfor van de achtergrond hiervan af.

Om vervolgens het fosforgehalte uit het gehydrolyseerd fosfor te berekenen, nemen de DER's het gemiddelde van de triplaat-monsterwaarden uit kolom zeven tot en met negen en trekken daar de controle-enzymoplossing plus de achtergrond van anorganisch fosfor plus het gehydrolyseerd monoesterfosfor uit kolom vier tot en met zes van af. Een typische 96-wells plaat toont resultaten voor acht monsters en een kalibratiecurve. De controles bevinden zich in kolom 10.

De toename van de kleurintensiteit tussen kolommen één tot drie en vier tot zes is te wijten aan gehydrolyseerde fosfor-monoesterverbindingen; tussen kolommen vier tot zes en zeven tot negen is deze te wijten aan gehydrolyseerde fosfor-diesterverbindingen. In dit experiment is de methode van high-throughput enzymatische hydrolyse gebruikt om met succes de distributie van fosforklassen in extracten van een Vermont-bodemmonster met 0,25 molair natriumhydroxide en 0,05 molair EDTA te analyseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u natuurlijke orthofosfaat-, monoester- en diesterfosforverbindingen in bodem- of mestextracten kunt meten met behulp van enzymatische hydrolyse.

Deze techniek kan de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van milieuchemie en nutriëntenbeheer om het gedrag van organische P in bodem- of meststelsels te onderzoeken.