Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel
1 februari 2011
De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit kan gebruikt worden om te analyseren en te kwantificeren 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een spe cifieke locus. De kit onderscheidt vijf-mC van 5-HMC door de toevoeging van glucose aan de hydroxylgroep van 5-HMC via een enzymatische reactie gebruik te maken van β-glucosyltransferase (T4-BGT). Bij het 5-HMC vindt plaats in het kader van CCGG, deze wijziging zet een splitsbare MspI site om een niet-splitsbare site.
Het algemene doel van het volgende experiment is het analyseren en kwantificeren van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een specifieke locus van genomisch DNA. Dit wordt bereikt door de hydroxylgroep van 5-hydroxymethylcytosine te blokkeren, waardoor een kliefbare MSP1-site wordt omgezet in een niet-kliefbare site. Als tweede stap wordt het genomische DNA verteerd door de restrictie-enzymen MSP1 en HPA2, die hun differentiële methyleringsgevoeligheid gebruiken om glucosylatie-gerelateerde 5-hydroxymethylcytosine-sites te identificeren.
Vervolgens wordt PCR gebruikt om de locus te onderzoeken. De resultaten tonen de aanwezigheid van vijf-hydroxyethylcytosine aan in een specifieke locus. QPCR kan worden gebruikt om de hoeveelheid vijf-methylcytosine en vijf-hydroxyethylcytosine te kwantificeren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals bisulfietsequencing, is dat u onderscheid kunt maken tussen 5-methylcytosine en 5-hydroxyethylcytosine. De experimenten van vandaag worden uitgevoerd door Romas Vice Villa; Romas was een hoofdontwikkelaar van deze kit bij New England Biolabs. Zuiver vóór de start van dit protocol het genomische DNA uit B. Sea-hersenweefsel zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Meng in een reactiebuisje van 1,5 ml het genomische DNA, UDP-glucose, NEB-buffer 4 en voldoende nucleasevrij water om het totale volume op 310 µL te brengen.
Verdeel dit reactiemengsel over twee buisjes van elk 155 µL. Voeg vervolgens 30 units of drie µL T4 bèta-glucosyltransferase toe aan één buisje. Meng goed door voorzichtig met de pipet op en neer te zuigen.
Voeg geen T4 BGT toe aan de tweede buis, aangezien dit de controle-reactie is, maar zorg ervoor dat er 3 µL water wordt toegevoegd. Incubeer beide buizen bij 37 °C gedurende 12 tot 18 uur, waarbij de BGT glucose toevoegt aan de hydroxylgroep van 5-hydroxyethylcytosinegroepen in het monster. Om de digestie met restrictie-enzymen te starten, verdeelt u 50 µL van het reactiemengsel over drie 0,2 ml PCR-stripbuisjes, gelabeld van één tot drie.
Verdeel vervolgens aliquoten van 50 µL van het controlemengsel over drie PCR-striptuibussen, gelabeld van vier tot en met zes. Voeg 100 units msp toe aan buis één en vier. Voeg vervolgens 50 units HPA twee toe aan buis twee en vijf en meng dit goed door voorzichtig met de pipet op en neer te zuigen.
Voeg niets toe aan buis drie en zes, aangezien deze als controles dienen. Incubeer alle zes de buizen gedurende ten minste vier uur bij 37 °C. Voeg vervolgens 1 µL proteinase K toe aan elke buis en incubeer 30 minuten bij 40 °C.
Inactiveer tot slot de proteinase K door te incuberen bij 95 °C gedurende 10 minuten. Deze procedure wordt gedemonstreerd met behulp van NEB LongAmp Taq voor endpoint PCR. Andere PCR-reagentia en procedures kunnen echter worden gesubstitueerd in een PCR-reactiebuisje van 0,2 ml op ijs.
Voeg vijf x long amp TAC reactiebuffer, DN NTPs, forward- en reverse-primers, het eerder verkregen template-DNA, long AMP TDNA-polymerase en voldoende nucleasevrij water toe om een eindvolume van 50 µL te bereiken. Meng de reactie voorzichtig en centrifugeer de buis kort om alle vloeistof naar de bodem te brengen. Verplaats de PCR-buisjes van het ijs naar een thermocycler waarvan het blok is voorverwarmd tot 94 °C en start het cyclingschema voor een routineuze drie-staps PCR.
Er moet één initiële denaturatiestap plaatsvinden bij 94 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door 30 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 15 seconden, annealing tussen 55 en 65 °C gedurende 30 seconden en een extensie bij 65 °C gedurende 20 seconden of 50 seconden per kb. Dit dient te worden gevolgd door één finale extensie bij 65 °C gedurende vijf minuten. Realtime PCR kan ook worden uitgevoerd om de hoeveelheden 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine te kwantificeren.
Raadpleeg de producthandleiding op nb. com voor specifieke informatie. Een vergelijking van vijf hoeveelheden hydroxyethyl aine op Locus 12 werd uitgevoerd met behulp van endpoint PCR en real-time PCR, waarbij vier verschillende muis BSY-weefselmonsters werden geanalyseerd, waaronder hersenen, lever, hart en milt.
De variatie in vijf-hydroxyethylcytosine is zichtbaar in de omkaderde gellijn van de endpoint PCR-monsters voor vergelijkingsdoeleinden. Real-time PCR-gegevens werden genormaliseerd ten opzichte van ongesneden DNA en een standaardcurve werd gebruikt om het kopie-aantal te bepalen. De monsters werden genormaliseerd door het kopie-aantal van de monsters te delen door het kopie-aantal van de onverteerde controle.
Hier kan de variatie in vijf-hydroxyethylcytosine worden waargenomen door de gele balken te vergelijken. Enkele opmerkingen over het uitvoeren van de techniek: het is cruciaal dat alle enzymatische reacties volledig worden voltooid. Voor de BGT is het belangrijk dat u dit overnacht doet, zodat u alle DNA-plaatsen voor Ms.P one en HEPA two kunt isoleren; voor die reacties is het belangrijk dat u minstens vier uur aanhoudt om er zeker van te zijn dat de voltooiing is bereikt.
En tot slot leveren we DNA-controles en primercontroles, zodat u controle-reacties naast elkaar kunt uitvoeren.
Overzicht
De EpiMark 5-hmC en 5-mC Analysis Kit maakt het mogelijk om 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine te analyseren en te kwantificeren op specifieke genomische loci. Deze methode maakt gebruik van enzymatische reacties om onderscheid te maken tussen deze twee modificaties, wat inzicht biedt in DNA-methyleringspatronen.
Belangrijkste componenten van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genomics
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- 5-methylcytosine (5-mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) zijn belangrijke epigenetische modificaties.
- Inzicht in hun distributie in het genoom is cruciaal voor het bestuderen van genregulatie.
- De EpiMark-kit biedt een betrouwbare methode om onderscheid te maken tussen deze modificaties.
- Enzymatische reacties faciliteren de analyse van specifieke DNA-loci.
Doel van de studie
- Om 5-mC en 5-hmC binnen specifieke genomische regio's te analyseren en te kwantificeren.
- Om de EpiMark-kit te gebruiken voor verbeterde detectie van deze modificaties.
- Om de efficiëntie van deze methode te vergelijken met traditionele technieken.
Gebruikte methoden
- Enzymatische omzetting van 5-hmC naar een niet-kliefbare site met behulp van β-glucosyltransferase.
- Digestie van genomisch DNA met restrictie-enzymen MspI en HpaII.
- Polymerasekettingreactie (PCR) om doelregio's te amplificeren.
- Kwantitatieve PCR (qPCR) voor het meten van de niveaus van 5-mC en 5-hmC.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie tussen 5-mC en 5-hmC op specifieke loci.
- Kwantitatieve gegevens die de aanwezigheid van 5-hmC in diverse weefselmonsters aantonen.
- Vergelijking van resultaten van endpoint PCR en real-time PCR.
- Variatie in 5-hmC-niveaus waargenomen in verschillende muisweefsels.
Conclusies
- De EpiMark-kit is effectief voor het analyseren van DNA-methyleringsmodificaties.
- Deze methode biedt een significant voordeel ten opzichte van traditionele bisulfietsequencing.
- Verdere studies kunnen deze techniek inzetten voor diepere inzichten in epigenetische regulatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Nauwkeurige locus-specifieke detectie van 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) ondersteunt de epigenetische targetvalidatie bij de ontdekking van geneesmiddelen voor neurowetenschappen door functionele hydroxymethylering te onderscheiden van methyleringsruis. Deze enzymatische methode maakt kwantitatieve beoordeling van epigenetische toestanden op gedefinieerde genomische locaties mogelijk, wat het voorspellend vertrouwen in studies naar target-engagement en pathway-modulatie verbetert. Het vult een kritisch gat in de ontwikkeling van epigenetische biomarkers waar bisulfietgebaseerde benaderingen er niet in slagen om 5-hmC te onderscheiden van 5-methylcytosine (5-mC).
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van epigenetische hypothesen mogelijk door 5-hmC te onderscheiden van 5-mC op specifieke loci, waardoor mechanistische rollen in genregulatie worden verduidelijkt.
- Operationele waarde: Biedt locus-specifieke resolutie zonder dat sequencing vereist is, wat de complexiteit bij epigenetische screening in een vroeg stadium vermindert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij targetidentificatie door epigenetische modificatiestaten te bevestigen die gekoppeld zijn aan transcriptionele activiteit in weefsels die relevant zijn voor de ziekte.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, op amplificatie gebaseerde resultaten (endpoint of qPCR) die een vergelijkende analyse van 5-hmC-niveaus over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van standaard PCR-infrastructuur, wat standaardisatie van de assay en schaalbaarheid tussen laboratoria mogelijk maakt.
- Reproduceerbaarheidswaarde: Interne controlereacties (mock-glucosylated) normaliseren voor de digestie-efficiëntie, waardoor de betrouwbaarheid van de gegevens wordt verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: De aangetoonde toepasbaarheid in weefsels van de muizenhersenen, lever, het hart en de milt ondersteunt de exploratie van biomarkers in verschillende weefsels.
- Preklinische continuïteit: Maakt longitudinale monitoring van 5-hmC-dynamiek in ziektemodellen mogelijk, waarbij epigenetische veranderingen worden gekoppeld aan fenotypische uitkomsten.
- Mechanistische risicoreductie: Helpt bij het correleren van locus-specifieke hydroxymethylering met pathway-activatie, waardoor ambiguïteit in het doelmechanisme wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de workflow voor epigenetische ontdekking na de targetidentificatie en voorafgaand aan de functionele validatie, waardoor moleculaire fenotypering van epigenetische toestanden op kandidaatloci mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door vast te stellen of een CpG-plaats van belang 5-hmC bevat, wat de doelselectie op basis van epigenetische activiteit informeert.
- Screening: Levert kwantitatieve, locus-specifieke resultaten die compatibel zijn met medium-throughput screening van epigenetische modulatoren.
- Analytics: De qPCR-output maakt schatting van het kopiegetal en normalisatie mogelijk, wat statistische vergelijking tussen behandelingsgroepen faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Weefselspecifieke detectie in de hersenen en perifere organen ondersteunt de beoordeling van de relevantie van biomarkers in preklinische modellen.
- Enterprise Reuse: Het protocol maakt gebruik van standaard reagentia en apparatuur voor moleculaire biologie, waardoor brede adoptie mogelijk is door teams op het gebied van epigenetica, neurowetenschappen en functionele genomica.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in epigenetische studies door het bieden van een eenduidige discriminatie tussen 5-mC en 5-hmC.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor bisulfietconversie of sequencing, waardoor de workflow wordt vereenvoudigd en de doorlooptijd wordt verkort.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen in epigenetische targetprogramma's door het leveren van betrouwbare, kwantitatieve modificatiegegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde epigenetische interactie in ziekterelevante loci.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologische technieken, waaronder restrictiedigestie en PCR.
- Afhankelijk van de toegang tot glucosyltransferase (T4-BGT) en methylatiesensitieve isoschizomeren (MspI/HpaII).
- Vereist zorgvuldig primerontwerp flankerend aan CCGG-sites om specifieke amplificatie te waarborgen.
- Optimale prestaties vereisen volledige enzymatische reacties (overnacht glucosylering, ≥4 uur digestie).
- Beperkt tot loci die CCGG bevatten; niet toepasbaar voor genoombrede analyse of analyse van niet-CCGG sites.
