Name: Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-01T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer hoe je 5-hydroxymethylcytosine detecteert in Balb/C hersenweefsel met het EpiMark-kit. Deze methode gebruikt enzymatische reacties en qPCR voor nauwkeurige kwantificatie van epigenetische modificaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Gyeong Chin, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, Steven E. Jacobsen s laboratorium, UCLA. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH 1R44GM095209-01.

1. DNA Glucosylation en Control Reacties <ol><li> In een 1,5 milliliter reageerbuis op ijs, meng 5-10 microgram van genomisch DNA (voor een uiteindelijke concentratie van 30 microgram / ml), 12,4 microliter van UDP-glucose (voor een uiteindelijke concentratie van 80 micromolair), 31 microliter van NEBuffer 4 en tot 310 microliter nuclease-vrij water om het totale volume tot 310 microliter te brengen. </li><li> Split deze reactie mengsel in twee buizen van 155 microliter per stuk. </li><li> Voeg vervolgens 30 eenheden, of 3 microliter, van de T4-β-glucosyltransferase aan een buis. Meng alles goed door zachtjes en neer te pipetteren. De tweede buis is de controle-reactie, dus het is aan 3 microliter van het water, in plaats van T4-BGT. </li><li> Incubeer beide buizen bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 18 uur, gedurende welke tijd de T4-BGT zal glucose toe te voegen aan de hydroxylgroep van 5-hydroxymethylcytosine groepen in de steekproef. </li></ol> 2. Restrictie-enzym digestie <ol><li> Label drie 0,2 milliliter PCR-strip buizen nummers 1 tot en met 3. Aliquot 50 ul van het reactiemengsel in elk. </li><li> Label drie 0,2 milliliter PCR-strip buizen nummers 4 tot en met 6. Aliquot 50 ul van de controle-mengsel in elk. </li><li> Voeg 100 eenheden, of een microliter, van MspI in de buizen 1 en 4. Meng alles goed door zachtjes en neer te pipetteren. </li><li> Voeg 50 eenheden, of een microliter, van HpaII in de buizen 2 en 5. Meng alles goed door zachtjes en neer te pipetteren. </li><li> Doe niets toe aan buizen 3 en 6, zoals ze zijn controles. </li><li> Incubeer alle 6 buisjes bij 37 graden Celsius gedurende ten minste 4 uur. </li><li> Voeg 1 microliter van proteïnase K in elke buis en incubeer bij 40 graden Celsius gedurende 30 minuten. </li><li> Inactiveren het proteïnase K door incuberen bij 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. </li></ol> 3. Analyseren van DNA door PCR / qPCR Dit protocol maakt gebruik van NEB's LongAmp Taq voor end-point PCR waarvan is aangetoond dat om goed te presteren. Andere PCR-protocollen kan worden vervangen. <ol><li> Voeg de volgende componenten tot een 0,2 ml PCR-reactie buis op ijs: 10 microliter van 5x LongAmp Taq reactiebuffer, 1,5 microliter van 10 millimolaire dNTPs, een microliter van 10 micromolair Forward Primer, een microliter van 10 micromolair omgekeerde primer, 3 microliter van template DNA uit de vorige stappen, een microliter van LongAmp Taq DNA-polymerase, en nuclease-vrij water tot 50 microliter. Deze volumes kunnen veranderen afhankelijk van de gebruikte PCR-protocol. </li><li> Meng de reactie. Indien nodig, verzamel alle vloeistof op de bodem van de buis door een snelle spin. </li><li> Overlay van het monster met minerale olie als met behulp van een thermocycler zonder een verwarmde deksel. </li><li> Overdracht van de PCR-buisjes van ijs tot een thermocycler met het blok voorverwarmd tot 94 graden Celsius en start het fietsprogramma. Voor een routine drie-staps PCR, moet er een eerste denaturatie stap bij 94 graden Celsius gedurende 30 seconden gevolgd door 30 cycli van 94 graden Celsius denaturatie gedurende 15 seconden, 55 tot 65 graden Celsius gloeien gedurende 30 seconden, en 65 graden Celsius uitbreiding 20 seconden, of 50 seconden per kb. Dit moet worden gevolgd door een laatste verlenging bij 65 graden Celsius gedurende 5 minuten. Real-time PCR kan ook worden uitgevoerd om bedragen van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine kwantificeren. Raadpleeg de handleiding product, gevonden op neb.com voor specifieke informatie. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2661/2661fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vergelijking van de 5-hydroxymethylcytosine bedragen op locus 12 verschillende muis Balb / C weefselmonsters. (A), End-point PCR. (B), Real-time PCR. DNA van vier muis weefsels werd geanalyseerd. Voor vergelijkingsdoeleinden zijn real-time PCR data genormaliseerd tot onversneden DNA. Een standaard curve werd gebruikt om het aantal kopieën te bepalen. De monsters kunnen worden genormaliseerd door te delen het aantal kopieën van monsters geen 1-6 door het aantal kopieën van de controle die is onverteerd (nr. 5). Boxed gel laan shows variatie in 5-HMC aanwezig.

<ol><li>Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).</li>
<li>Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).</li>
<li>Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).</li>
</ol>

Zowel Ted en Romas, auteurs van dit artikel, zijn medewerkers van NEB, Roma is de belangrijkste ontwikkelaar van de kit, met Ted zijnde de directeur van de Applications &amp; Development afdeling die de ontwikkeling van deze kit toezag.

Er zijn een aantal kritische dingen te overwegen bij het opzetten van dit experiment. Ten eerste is het belangrijk dat de glucosylation van genomisch DNA overgaat tot voltooiing. De volgorde specificiteit van T4-BGT is niet bekend, en het lijkt geen andere keus hebben voor de ondergrond volgorde. Daarom kan in sommige gevallen kan langere incubatietijd nodig zijn. Ten tweede, MspI en HpaII spijsvertering moet volledig zijn om achtergrond signaal te voorkomen. Voor deze restrictie-enzymen, adviseren wij een incubatietijd van 4 uur, maar langer incubaties kan worden uitgevoerd wanneer onvolledig decollete wordt waargenomen. Ten derde kan invoeren DNA bedrag worden aangepast, afhankelijk van de beschikbaarheid, sinds 20 NGS van DNA kan gebruikt worden voor end-point PCR. Tot slot adviseren wij het gebruik van de bijgeleverde controle DNA die kunnen parallel met genomisch DNA worden uitgevoerd voor 5-MC en 5-HMC kwantificering.

<table><tbody><tr><td>EpiMark&amp;#8482; 5-hmC en 5-mC Analyse Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3317</td><td></td></tr><tr><td>Locus-specifieke primers, flankerend aan een CCGG-site van belang</td><td></td><td></td><td>Maatwerk per experiment; verstrekt door de gebruiker</td></tr><tr><td>LongAmp&amp;#174; &lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0323</td><td></td></tr><tr><td>dNTP's</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>water van moleculaire biologie-kwaliteit</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine detection in balb / c hersenweefsel

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is een lang bekend modificatie van DNA, maar is sinds kort een focus in epigenetisch onderzoek. Zoogdier DNA is enzymatisch gewijzigd op de 5 e positie van de koolstof-cytosine (C) residuen 5-MC, voornamelijk in het kader van CpG dinucleotiden. 5-mC vatbaar is voor enzymatische oxidatie tot 5-HMC door het Tet-familie van enzymen, die worden verondersteld om worden betrokken bij ontwikkeling en ziekte. Momenteel wordt de biologische rol van 5-HMC niet volledig begrepen, maar is het genereren van veel belangstelling vanwege zijn potentieel als een biomarker. Dit is te wijten aan een aantal baanbrekende studies te identificeren 5-hydroxymethylcytosine in muis embryonale stamcellen (ES) en neuronale cellen. Onderzoekstechnieken, waaronder bisulfiet sequencing methoden, zijn niet in staat om op eenvoudige wijze tussen de vijf-mC en 5-HMC. Een paar protocollen bestaan ​​die kunnen globale bedragen van 5-hydroxymethylcytosine te meten in het genoom, met inbegrip van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie-analyse of dunne laag chromatografie van enkele nucleosiden verteerd uit genomisch DNA. Antilichamen die zich richten op vijf-hydroxymethylcytosine bestaan ​​ook, die kan worden gebruikt voor dot-blot-analyse, immunofluorescentie, of precipitatie van hydroxymethylated DNA, maar deze antilichamen hebben geen enkele basis resolution.In Daarnaast resolutie is afhankelijk van de grootte van de immunogeprecipiteerd DNA en voor microarray experimenten, afhankelijk van de probe design. Omdat het onbekend is precies waar 5-hydroxymethylcytosine bestaat in het genoom of haar rol in de epigenetische regulatie, zijn nieuwe technieken nodig die locus specifieke hydroxymethylation zich kunnen identificeren. De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit biedt een oplossing voor het onderscheid tussen deze twee wijzigingen op specifieke loci. De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit is een eenvoudige en robuuste methode voor de identificatie en kwantificatie van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een specifieke DNA-locus. Deze enzymatische benadering maakt gebruik van de differentiële methylatie gevoeligheid van de isoschizomers MspI en HpaII in een eenvoudige drie-stappen-protocol. Genomic DNA van belang wordt behandeld met T4-BGT, het toevoegen van een glucose moeity tot 5-hydroxymethylcytosine. Deze reactie is sequentie-onafhankelijk, dus alle 5-HMC zal worden glucosylated, ongemodificeerd of 5-MC met daarin DNA zal niet worden aangetast. Dit glucosylation wordt dan gevolgd door restrictie-endonuclease spijsvertering. MspI en HpaII herkennen dezelfde volgorde (CCGG), maar zijn gevoelig voor verschillende methylatie toestanden. HpaII splitst alleen een volledig ongewijzigde site: elke wijziging (5-mC, 5-HMC of 5-ghmC) op een van beide cytosine blokken decollete. MspI erkent en splitst 5-mC en 5-HMC, maar geen 5-ghmC. Het derde deel van het protocol is ondervraging van de locus met PCR. Zo weinig als 20 ng van de input-DNA kan worden gebruikt. Versterking van de experimentele (glucosylated en verteerd) en controle (mock glucosylated en verteerd) target-DNA met de primers flankeren een CCGG plaats van belang (100-200 bp) wordt uitgevoerd. Als de CpG-site bevat 5-hydroxymethylcytosine, is een band ontdekt na glucosylation en de spijsvertering, maar niet in de non-glucosylated controle reactie. Real time PCR geeft een benadering van hoeveel hydroxymethylcytosine is in deze specifieke site. In dit experiment zullen we de 5-hydroxymethylcytosine hoeveelheid te analyseren in een muis Babl / C hersenen monster door eindpunt PCR.

De EpiMark 5-HMC en 5-mC Analysis Kit kan gebruikt worden om te analyseren en te kwantificeren 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een spe cifieke locus. De kit onderscheidt vijf-mC van 5-HMC door de toevoeging van glucose aan de hydroxylgroep van 5-HMC via een enzymatische reactie gebruik te maken van β-glucosyltransferase (T4-BGT). Bij het 5-HMC vindt plaats in het kader van CCGG, deze wijziging zet een splitsbare MspI site om een ​​niet-splitsbare site.

Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel

DNA-hydroxymethylering is een al lang bekende modificatie van DNA, maar is recentelijk een focuspunt geworden in epigenetisch onderzoek. Mammaliaal DNA wordt enzymatisch ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het analyseren en kwantificeren van 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine binnen een specifieke locus van genomisch DNA. Dit wordt bereikt door de hydroxylgroep van 5-hydroxymethylcytosine te blokkeren, waardoor een kliefbare MSP1-site wordt omgezet in een niet-kliefbare site. Als tweede stap wordt het genomische DNA verteerd door de restrictie-enzymen MSP1 en HPA2, die hun differentiële methyleringsgevoeligheid gebruiken om glucosylatie-gerelateerde 5-hydroxymethylcytosine-sites te identificeren.Vervolgens wordt PCR gebruikt om de locus te onderzoeken. De resultaten tonen de aanwezigheid van vijf-hydroxyethylcytosine aan in een specifieke locus. QPCR kan worden gebruikt om de hoeveelheid vijf-methylcytosine en vijf-hydroxyethylcytosine te kwantificeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals bisulfietsequencing, is dat u onderscheid kunt maken tussen 5-methylcytosine en 5-hydroxyethylcytosine. De experimenten van vandaag worden uitgevoerd door Romas Vice Villa; Romas was een hoofdontwikkelaar van deze kit bij New England Biolabs. Zuiver vóór de start van dit protocol het genomische DNA uit B. Sea-hersenweefsel zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Meng in een reactiebuisje van 1,5 ml het genomische DNA, UDP-glucose, NEB-buffer 4 en voldoende nucleasevrij water om het totale volume op 310 µL te brengen.Verdeel dit reactiemengsel over twee buisjes van elk 155 µL. Voeg vervolgens 30 units of drie µL T4 bèta-glucosyltransferase toe aan één buisje. Meng goed door voorzichtig met de pipet op en neer te zuigen.Voeg geen T4 BGT toe aan de tweede buis, aangezien dit de controle-reactie is, maar zorg ervoor dat er 3 µL water wordt toegevoegd. Incubeer beide buizen bij 37 °C gedurende 12 tot 18 uur, waarbij de BGT glucose toevoegt aan de hydroxylgroep van 5-hydroxyethylcytosinegroepen in het monster. Om de digestie met restrictie-enzymen te starten, verdeelt u 50 µL van het reactiemengsel over drie 0,2 ml PCR-stripbuisjes, gelabeld van één tot drie. Verdeel vervolgens aliquoten van 50 µL van het controlemengsel over drie PCR-striptuibussen, gelabeld van vier tot en met zes. Voeg 100 units msp toe aan buis één en vier. Voeg vervolgens 50 units HPA twee toe aan buis twee en vijf en meng dit goed door voorzichtig met de pipet op en neer te zuigen.Voeg niets toe aan buis drie en zes, aangezien deze als controles dienen. Incubeer alle zes de buizen gedurende ten minste vier uur bij 37 °C. Voeg vervolgens 1 µL proteinase K toe aan elke buis en incubeer 30 minuten bij 40 °C.Inactiveer tot slot de proteinase K door te incuberen bij 95 °C gedurende 10 minuten. Deze procedure wordt gedemonstreerd met behulp van NEB LongAmp Taq voor endpoint PCR. Andere PCR-reagentia en procedures kunnen echter worden gesubstitueerd in een PCR-reactiebuisje van 0,2 ml op ijs.Voeg vijf x long amp TAC reactiebuffer, DN NTPs, forward- en reverse-primers, het eerder verkregen template-DNA, long AMP TDNA-polymerase en voldoende nucleasevrij water toe om een eindvolume van 50 µL te bereiken. Meng de reactie voorzichtig en centrifugeer de buis kort om alle vloeistof naar de bodem te brengen. Verplaats de PCR-buisjes van het ijs naar een thermocycler waarvan het blok is voorverwarmd tot 94 °C en start het cyclingschema voor een routineuze drie-staps PCR.Er moet één initiële denaturatiestap plaatsvinden bij 94 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door 30 cycli van denaturatie bij 94 °C gedurende 15 seconden, annealing tussen 55 en 65 °C gedurende 30 seconden en een extensie bij 65 °C gedurende 20 seconden of 50 seconden per kb. Dit dient te worden gevolgd door één finale extensie bij 65 °C gedurende vijf minuten. Realtime PCR kan ook worden uitgevoerd om de hoeveelheden 5-methylcytosine en 5-hydroxymethylcytosine te kwantificeren.Raadpleeg de producthandleiding op nb. com voor specifieke informatie. Een vergelijking van vijf hoeveelheden hydroxyethyl aine op Locus 12 werd uitgevoerd met behulp van endpoint PCR en real-time PCR, waarbij vier verschillende muis BSY-weefselmonsters werden geanalyseerd, waaronder hersenen, lever, hart en milt.De variatie in vijf-hydroxyethylcytosine is zichtbaar in de omkaderde gellijn van de endpoint PCR-monsters voor vergelijkingsdoeleinden. Real-time PCR-gegevens werden genormaliseerd ten opzichte van ongesneden DNA en een standaardcurve werd gebruikt om het kopie-aantal te bepalen. De monsters werden genormaliseerd door het kopie-aantal van de monsters te delen door het kopie-aantal van de onverteerde controle.Hier kan de variatie in vijf-hydroxyethylcytosine worden waargenomen door de gele balken te vergelijken. Enkele opmerkingen over het uitvoeren van de techniek: het is cruciaal dat alle enzymatische reacties volledig worden voltooid. Voor de BGT is het belangrijk dat u dit overnacht doet, zodat u alle DNA-plaatsen voor Ms.P one en HEPA two kunt isoleren; voor die reacties is het belangrijk dat u minstens vier uur aanhoudt om er zeker van te zijn dat de voltooiing is bereikt.En tot slot leveren we DNA-controles en primercontroles, zodat u controle-reacties naast elkaar kunt uitvoeren.

high-sensitivity-5-hydroxymethylcytosine-detection-balbc-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Beschreven is een twee stappen proces labeling met β-glucosyltransferase (β-GT) een azide-glucose dragen aan 5-HMC, gevolgd door een klik chemie biotine linker gemakkelijk en dichtheid onafhankelijk verrijking brengen. Deze efficiënte en specifieke etiketteringsvoorschriften methode maakt het mogelijk verrijking van 5-HMC met extreem lage achtergrond en high-throughput epigenomisch mapping vinden plaats via next-generation sequencing.

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

This video describes the technique of dot-blot to determine the level of DNA methylation in human chondrocytes in vitro via the blotting of DNA samples on a nylon membrane and the subsequent visualization using monoclonal antibodies. This helps to determine the chondrocytes' phenotype at various stages in culture.

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Dit protocol beschrijft qPCR-detectie van cytomegalovirus in formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed biopsieweefsel, wat snel, gevoelig, specifiek is en nuttig voor het interpreteren van twijfelachtige hematoxyline en eosine of immunohistochemische kleuringspatronen.

qPCR is een gevoelige en snelle methode voor de detectie van Cytomegaloviral DNA in formaline gefixeerde, paraffine-ingebedde biopsieweefsel

Hier beschrijven we een gevoelige immunochemische methode voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van 5mC-oxidatiederivaten op basis van het gebruik van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen en tyramide-signaalversterking.

Detectie van gemodificeerde vormen van cytosine behulp Sensitive Immunohistochemie

Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

Het doel van dit verslag is om te beschrijven van het protocol voor robuuste immunohistochemische detectie van epigenetische markers, 5-methylcytosine (5mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) bij de ontwikkeling en postmitotic muis netvlies.

Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van 5-hydroxymethylcytosine in cellen en hersenweefsels, met behulp van immunofluorescentie kleuring en DNA dot-Blot-methoden.

De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo's.

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

De omkeerbare toevoeging van palmitaat aan eiwitten is een belangrijke regulator van intracellulaire eiwitten mensenhandel. Dit is van bijzonder belang in neuronen waar veel synaptische eiwitten gepalmitoyleerd. We gebruiken een eenvoudige biochemische methode gepalmitoyleerd eiwitten in gekweekte neuronen, die kunnen worden aangepast voor meerdere celtypes en weefsels.

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

De neurochemie van het zoogdierbrein verandert bij vele neurologische en systemische ziekten. Karakteristieke profielen van cerebrale metabolieten kunnen efficiënt worden verkregen op basis van ruwe extracten van hersenweefsel. Hiervoor wordt hoge-resolutie NMR-spectroscopie gebruikt, wat een gedetailleerde kwantitatieve analyse van metabolietenconcentraties (metabolomics) mogelijk maakt.

Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten

Leer hoe je 5-hydroxymethylcytosine detecteert in Balb/C hersenweefsel met het EpiMark-kit. Deze methode gebruikt enzymatische reacties en qPCR voor nauwkeurige kwantificatie van epigenetische modificaties.

Hoge gevoeligheid 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb / C hersenweefsel

Meer video's verkennen