Nauwkeurige en eenvoudige meting van de pro-inflammatoire cytokine IL-1β met behulp van een volbloed stimulatie Assay

Het algemene doel van deze procedure is het meten van pro-inflammatoire cytokinen die worden geproduceerd in een stimulatie-assay met volbloed. Eerst worden de cellulaire componenten van het volbloed door middel van centrifugatie uit het plasma geïsoleerd, waarna de witte bloedcellen worden geteld met behulp van eine-oranje kleuring. Vervolgens worden de cellen uitgeplaat en gestimuleerd met LPS, gevolgd door een TP, om cytokineproductie op te wekken door cellen die microbiële patroonherkenningsreceptoren dragen. De kweeksupernatanten worden vervolgens verzameld op specifieke tijdstippen na het begin van de stimulatie.

Ten slotte worden de cytokinenconcentraties in de supernatanten gemeten met een multiplex-assay in een 96-wells plaat. Met deze eenvoudige methode kunnen variaties in de concentraties van pro-inflammatoire cytokinen, geproduceerd door gestimuleerde cellen van verschillende donoren, snel worden beoordeeld. Deze methode is bijzonder nuttig voor het identificeren van cytokine-gemedieerde inflammatoire ziekten bij patiënten die pathologisch anti-inflammatoire manifestaties vertonen, in het bijzonder in situaties waarin het verkrijgbare bloedvolume beperkt is.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden bij het meten van cytokinenconcentraties is dat de Luminex-gebaseerde technologie gelijktijdige metingen van meerdere cytokinen mogelijk maakt met behulp van slechts een klein monstervolume. Verzamel monsters met 10 milliliter of meer veneus bloed van getroffen personen, evenals van gezonde controles die qua leeftijd en geslacht overeenkomen; zorg ervoor dat de monsters worden verzameld in Vacutainer-bloedafnamebuizen met natriumheparine, en voeg geen EDTA of andere anticoagulantia toe, aangezien deze de assay zullen verstoren. Verwerk de monsters zo snel mogelijk na afname. Indien nodig kunnen de monsters tot 24 uur worden bewaard bij kamertemperatuur onder gedimde lichtomstandigheden.

Centrifugeer de bloedmonsters gedurende 10 minuten bij 3000 RPM bij kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld. Verwijder na centrifugatie het plasma van de bovenkant van de buisjes, waarbij u voorzichtig bent om de buffy coat-laag met mononucleaire cellen niet te verstoren. Resuspendeer de buffy coat en het onderliggende pellet van rode bloedcellen in serumvrij RPMI-medium bij kamertemperatuur om de cellen te wassen door het mengsel voorzichtig te pipetteren.

Breng vervolgens de cellen van de opvangbuis over naar een conische buis van 50 milliliter. Vul het volume aan tot 50 milliliter met RPMI en keer elke buis voorzichtig om om te mengen. Centrifugeer de cellen nogmaals bij 3000 RPM gedurende 10 minuten.

Suctor vervolgens het supernatant af, waarbij u er goed op let het celpellet niet te verstoren. Herhaal deze wasstap twee tot vier keer om contaminanten te verwijderen en celgebonden cytokinen te elimineren. Nadat de cellen zijn gewassen, resuspendeert u deze in serumvrij RPMI tot een totaalvolume van 20 milliliters. Om de cellen te tellen, brengt u 20 microliters van een één-op-één mengsel van monster en acridine orange aan in een wegwerpsoter vision chamber. Acridine orange, gebruikt in een eindconcentratie van 1 microgram per milliliter, kleurt uitsluitend kernhoudende witte bloedcellen, waardoor deze kunnen worden onderscheiden van rode bloedcellen.

Tel alleen de D-positieve cellen zodra er een celgetal is verkregen. Resuspendeer de monsters in serumvrij RPMI om een uiteindelijke concentratie van 2 miljoen cellen per milliliter te bereiken. Label voor elk monster dubbele putjes van een 24-wells plaat met de te testen experimentele condities.

In dit geval zijn de condities ongestimuleerd, alleen LPS, alleen a TP en LPS plus a TP. Voeg één milliliter verdunde cellen toe aan elke well en voeg LPS toe aan de betreffende wells tot een eindconcentratie van één microgram per milliliter. Incubeer de monsters gedurende twee uur en 40 minuten bij 37 °C in een incubator met 5% koolstofdioxide. Voeg na deze initiële incubatieperiode a TP toe tot een eindconcentratie van twee millimolair in de wells met alleen a TP en LPS plus a TP. Incubeer de platen vervolgens nog 20 minuten bij 37 °C.

Zodra de tweede incubatie is voltooid, brengt u de cellen uit elke put over naar een aparte, vooraf gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de monsters 2 minuten bij 10.000 RRP M bij kamertemperatuur en breng vervolgens het supernatant uit elke buis over naar een nieuwe, vooraf gelabelde EOR-buis. Het supernatant kan direct op cytokines worden geanalyseerd of bevroren worden bewaard om de concentraties van IL one beta of andere cytokines te bepalen. In de monsters gebruiken we de bio plex pro, human cytokine X plex met het Bio Plex 200-systeem.

Volgens de instructies van de fabrikant. In deze figuuranalyse van de productie van IL-1β na stimulatie van normale cellen uit volbloed met LPS, ATP of beide stimuli samen, is een respons op LPS plus ATP zichtbaar, waarvan de omvang afhankelijk is van het aantal gestimuleerde cellen. In tegenstelling tot gezonde controles onthullen volbloedassays van patiënten met autoinflammatoire pathologieën een verhoogde productie van IL-1β na LPS-stimulatie, zelfs zonder de exogene toevoeging van ATP. Vergeet niet dat het werken met menselijke lichaamsvloeistoffen zoals bloed uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd universele voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.