Name: Karakteriseren Bacteriële Vluchtige stoffen met behulp van secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie (Sesi-MS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer hoe je bacteriële vluchtige stoffen karakteriseert met secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie zonder voorbehandeling. Deze methode detecteert unieke vingerafdrukken in minder dan vijf minuten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt gefinancierd door NIH subsidie ​​P20 RR021905-01, CF RPD verlenen STANTO07R0, en de NASA-subsidie ​​NNH09ZNE002C.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische voor Sesi-MS analyse van bacteriële vluchtige stoffen. De kopruimte van de bacteriële cultuur is verdrongen door CO 2 (1) in de Sesi reactie kamer (2). Omdat de vluchtige stoffen doorkruisen de Sesi reactiekamer ze door de electrospray wolk en worden geïoniseerd (3). Eenmaal geïoniseerd worden de vluchtige stoffen getrokken in de massaspectrometer voor analyse (4). Overtollige draaggas en ongereageerd bacteriële vluchtige stoffen worden doorgegeven door een 0,22 um filter (5), als een aanvullende maatregel van bescherming, en geventileerd om een ​​chemische kap. Inzet: De Sesi electrospray naald is een silica capillair (40 um ID) met een scherpe naald. Als een demonstratie van het gebruik van Sesi-MS voor de karakterisering van bacteriële vluchtige stoffen, E. coli K12 en P. aeruginosa PAO1 aëroob gekweekt gedurende 24 uur in 50 ml LB-Lennox bij 37 ° C en de Sesi-MS spectra van de headspace vluchtige stoffen worden verzameld in 2 minuten. Kooldioxide (99,99%) bij een debiet van 2 l / min wordt gebruikt als draaggas voor vluchtige levering aan de reactie kamer. De reactie Sesi kamer werd op maat gebouwd en gemonteerd op een API-3000 (Sciex), ter vervanging van de oorspronkelijke electrospray ionenbron. De spectra worden verzameld in de positieve ion-modus met 0,1% mierenzuur, 5,0% methanol, en 94,9% water (v / v) als de electrospray-oplossing, geleverd op 5 nL / s via een niet-geleidende silica capillair met een geslepen naald (40 um ID). De aangelegde spanning is 2,5 kV. Analist 1.4.2 software (Applied Biosystems) wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens met de volgende parameters: 20 - 500 Da, MCA-modus, 40 scans, 3 s / scan, en 2 min totale analyse tijd. 1. Het kweken van het systeem <ol><li> Choose het juiste schip voor de teelt van uw culturen, gezien de groei eisen van de soort in uw experiment (bijvoorbeeld, beluchting, licht, temperatuur, enz.), alsmede de efficiënte levering van vluchtige stoffen naar de massaspectrometer. De cultuur flessen we kiezen om te gebruiken zijn standaard 100 ml Pyrex media flessen voorzien van doppen met schroefdraad dat ten minste twee luer-poorten te hebben. Een toevoer lijn wordt ingebracht via een luer-poort voor het draaggas levering aan de monsterfles en een uitlaat lijn wordt ingebracht via een andere poort voor de VOC levering aan het instrument (figuur 1). Eventuele extra poorten zijn aangesloten. </li><li> Voorafgaand aan het kweken van de monsters, onder druk van de schepen en onderdompelen in water om te controleren op lekkages. Gaslekken zijn een primaire oorzaak van atypische resultaten in de vorm van zwakke of afwezige vluchtige ion signalen. </li></ol> 2. Biologische experiment: set-up-en veiligheidsoverwegingen <ol><li> Kweek je culturen in de voorwaarden die geschikt is voor uw hypothese. Het wordt aanbevolen dat ten minste twee biologische replica, elk met twee technische herhalingen, worden gebruikt voor elke variabele. </li><li> Bereid een blanco voor elke cultuur staat (medium, antibiotica, enz.) en incubeer de lege onder dezelfde voorwaarden als uw monsters. </li><li> Gebruiken veiligheidsmaatregelen die geschikt zijn voor de biologische agentia die u gebruikt, rekening houdend met de bioveiligheidsniveau (s) van de soort. </li><li> Om te voorkomen dat besmetting van uw instrument en het gas overdracht lijnen met levensvatbare biologische agentia, installeren filters van de juiste poriegrootte in het draaggas lijn. De filters zullen niet interfereren met de overdracht van vluchtige stoffen naar de Sesi reactie kamer, maar kan enigszins invloed hebben op de efficiëntie van aerosol overdracht. 6 </li><li> Gebruik secundaire containment of een kast bioveiligheid bij het bevestigen van het gas overdragen dop om je cultuur fles om de juiste insluiting te verzekeren in het geval van morsen biologische agentia. </li><li> Initiëren en beëindigen draaggasstroom om uw monsterfles op een manier die niet zal bouwen druk in de fles. </li></ol> 3. Instrument optimalisatie LET OP: Sesi-MS is speciaal ontworpen om te proeven van vluchtige stoffen, zo beperk het gebruik van geurige persoonlijke verzorging (bijvoorbeeld, de cologne, mondwater, lotions, wasverzachter), gom, sigaretten, etc. voordat u het instrument. Strak cap alle vluchtige chemicaliën in het lab, en controle luchtstromen zoveel mogelijk tijdens het testen. De volgende instrumentele parameters, die alle van invloed op het signaal intensiteit en stabiliteit, zal moeten worden geoptimaliseerd voor uw instrument en experiment. <ol><li> Electrospray oplossing en debiet: Kies de juiste electrospray oplossing voor de klasse van moleculen die u wilt targeten, rekening houdend met de operationele instrument polariteit (positief of negatief-ion-modus) en moleculaire karakter van het doel verbindingen. In dit experiment de electrospray-oplossing is 0,1% mierenzuur, 5,0% methanol, 94,9% water (v / v), die het signaal intensiteit van minder polaire moleculen vergroot while het verstrekken van goed signaal stabiliteit. De oplossing wordt geleverd met een debiet van 5 nL / s. </li><li> Draaggasstroom rate: De vervoerder gasstroom kan de electrospray stabiliteit en de intensiteit van het signaal beïnvloeden. CO 2 (≥ 99,99%) bij een debiet van 2 l / min wordt hier gebruikt. </li><li> Naald vorm en functie: De naald vorm en positie sterk beïnvloeden het signaal intensiteit en stabiliteit. Bij het installeren van een nieuwe naald, moet de positie van de naald worden geoptimaliseerd om een ​​evenwicht te vinden tussen lage achtergrond, hoge analyt signaal intensiteit, en het signaal stabiliteit te creëren. Met het oog op Sesi spectra te reproduceren na een naald te veranderen, is het noodzakelijk om periodiek verzamelen van spectra als u de naald positie totdat u in staat zijn om de waargenomen spectrum af te stemmen op uw administratie. De afstand van electrospray naald om massa spec opening zal worden 1 - 5 mm. </li><li> Aangelegde spanning: De spanning die wordt toegepast op het systeem van invloed op de signaal-ion intensiteit en de stabiliteit van de electrospray Taylor kegel. Daarnaast is de optimale spanning is afhankelijk van uw electrospray oplossing en de naaldpunt vorm. Aan het begin van de reeks experimenten, bepalen de spanning die de optimale spectrum en signaal stabiliteit opbrengst voor uw systeem, en gebruik dan deze spanning voor alle volgende experimenten. Voor ons systeem, toegepast voltages van 2,0 tot 5,0 kV zorgen voor een optimale signaal intensiteit en electrospray stabiliteit. Voor dit experiment 2,5 kV wordt gebruikt. </li></ol> 4. Het inschakelen van en afstemming van de Sesi-MS voor analyse <ol><li> Begin door ervoor te zorgen dat de spanning is uitgeschakeld en dat het systeem wordt geloosd van elektriciteit. Doe dit door 1) het waarborgen van de indicatielampjes op de voedingsspanning worden uitgeschakeld, 2) zorgen voor de spanning op de multimeter is nul, en 3) aarding van de elektrische leidingen. </li><li> Installeer de juiste electrospray oplossing voor uw experiment. </li><li> Zet op de drager gas en zet de stroom naar het tarief geschikt is voor uw experiment. </li><li> Druk op de electrospray reservoir om de levering van de electrospray oplossing om de reactie te kamer te initiëren. </li><li> Schakel de voedingsspanning en stel de spanning naar een geschikte waarde voor uw experimenten. </li></ol> NB: Op dit punt van de metalen oppervlakken van de ionisatie bron kunnen leveren van een gevaarlijke schok. Oefening grote voorzichtigheid bij het werken rond het instrument zodra de voedingsspanning is ingeschakeld. <ol start="6"><li> Stel een tuning methode voor het toezicht op de Sesi-MS spectrum, terwijl het maken van fijne afgestemd aanpassingen aan de aangelegde spanning. Gebruik de acquisitie parameters die je hebt geoptimaliseerd voor uw systeem en uw experiment. Zo duidelijk de Multiple Channel Acquisition (MCA) in te schakelen (indien van toepassing) dat elke scan een onafhankelijke spectrum produceert, stelt de overname de tijd tot 10 - 15 min, en start de acquisitie. Spectra van het draaggas achtergrond moet nu worden genomen. </li><li> Maak afgestemd aanpassingen aan de aangelegde spanning om een stabiel totaal ion chromatogram (TIC) en reproduceerbare scans dat de CO 2-scans voor uw vorige experimenten passen te verkrijgen. Zodra de spanning aanpassingen zijn gemaakt, blijven spectra en een TIC in te zamelen voor vijf minuten om ervoor te zorgen het instrument is gestabiliseerd. </li><li> Zodra instrumentale stabiliteit is gewaarborgd, het opzetten van de overname methode geschikt is voor uw monsters, het aanpassen van de overname tijd, gegevensbereik en MCA selectie als dat nodig is. Verzamel een draaggas achtergrond spectrum voor uw administratie. </li></ol> 5. Het verkrijgen van een vluchtige vingerafdruk van je bacteriecultuur <ol><li> Voor het verzamelen van een leeg spectrum, direct de vervoerder gasstroom door de bypass lijnen, en bevestig vervolgens het blanco monster (kleppen gesloten) om het gas overdracht lijnen van het instrument. </li><li> Open de kleppen aan de monsterfles, en sluit de kleppen van de bypass lijnen. </li><li> Laat het systeem equilibreren gedurende 30 seconden, gedurende welke tijd de luchtvochtigheid in de reactie kamer stabiliseert. Deze periode van evenwicht is essentieel voor het verkrijgen van reproduceerbare spectra. Om ervoor te zorgen dat het systeem in evenwicht is, kan u de TIC, die zal veranderen tijdens de periode evenwicht bewaken, en te stabiliseren daarna. </li><li> Zodra het systeem is in evenwicht gebracht, initiëren spectrum collectie. </li><li> Nadat het spectrum wordt verzameld, verwijdert u de monsterfles door eerste opening van de vervoerder gas bypass lijnen, daarna sluiten van de kleppen monster, en tenslotte het verwijderen van de monsterfles. Spoel het systeem met de draaggas voor 2 - 4 minuten, het verwijderen van het vocht en geadsorbeerd vluchtige stoffen uit de overdracht lijnen, het voorkomen van sample-to-sample overdracht. </li><li> Herhaal de stappen 5,2 tot 5,5 voor elke bacteriële monster, met tussenpozen het verzamelen van extra lege spectra een grondige blanco aftrekken te verzekeren. Onvolledige blanco aftrekken zal leiden tot deverschijning van chemische achtergrond pieken in uw verwerkte spectrum die gemeenschappelijk zijn voor atmosferische druk ionisatie technieken (bijvoorbeeld ftalaten, siliconen, etc.). 9 </li><li> Bij het verzamelen van uw spectra, ervoor zorgen dat de signalen niet ion de lineaire detectielimieten van uw instrument, zoals bepaald door de TIC en de maximale intensiteit van individuele pieken van meer dan. Ionen overschrijding van de bovenste grenzen van de detector van uw instrument kan genereren artefact pieken die niet representatief zijn voor uw monster. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Als een voorbeeld van de Sesi-MS spectra die verkregen kan worden voor bacteriële vluchtige stoffen, het positieve ion-modus vluchtige vingerafdrukken ten behoeve van E. coli en P. aeruginosa aëroob gekweekt in LB-Lennox gedurende 24 uur bij 37 ° C worden weergegeven (afb. 2). De E. coli vluchtige spectrum wordt gedomineerd door de indool bij m / z = 118, waardoor E. coli culturen hun karakteristieke geur, terwijl het spectrum van P. aeruginosa bevat een grotere variëteit van protoneerbare pieken. Houdt u er rekening mee dat de relatieve intensiteiten van de pieken in de vluchtige spectrum zijn afhankelijk van de instrumentale parameters beschreven in hoofdstuk 3. Deze parameters moeten goed worden bediend vanaf experiment om te experimenteren met het oog op reproduceerbare spectra te verkrijgen. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 Blanco-gecorrigeerde positieve ion-modus Sesi-MS spectra (20 - 150 m / z). Van E. coli K12 en P. aeruginosa PAO1 vluchtige stoffen na 24 uur aërobe groei in de LB-Lennox bij 37 ° C. Voor meer details over de pieken waargenomen in de Sesi spectra, verwijzen wij u naar Zhu, et al.. 8.

<ol><li>Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. ESI-MS in the analysis of trace species in gases. Proceedings of the 47th ASMS Conference on Mass Spectrometry Allied Topics, Dallas, TX, , (1999).</li>
<li>Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+electrospray+ionization+ion+mobility+spectrometry%2Fmass+spectrometry+of+illicit+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs.</a> Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).</li>
<li>Tam, M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+electrospray+ionization-ion+mobility+spectrometry+for+explosive+vapor+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection.</a> Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).</li>
<li>Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+electrospray+ionization+%28SESI%29+of+ambient+vapors+for+explosive+detection+at+concentrations+below+parts+per+trillion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).</li>
<li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+detection+of+human+skin+vapors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">On-line detection of human skin vapors.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).</li>
<li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+of+volatiles+in+breath%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization of volatiles in breath.</a> Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).</li>
<li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+fatty+acid+vapors+in+breath+by+electrospray+ionization+and+atmospheric+pressure+ionization-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).</li>
<li>Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+typical+chemical+background+interferences+in+atmospheric+pressure+ionization+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).</li>
<li>Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRudzinski%2C+CM+%22Pathogen+detection+using+headspace+analysis%22">Pathogen detection using headspace analysis</a>. , Department of the Air Force. 16-16 (2004).</li>
<li>Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+bacteria+in+vitro+by+mass+spectrometric+fingerprinting%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study.</a> Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).</li>
<li>Schulz, S., Dickschat, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+volatiles%3A+The+smell+of+small+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacterial volatiles: The smell of small organisms.</a> Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).</li>
<li>Ligor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+breath+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for breath investigation.</a> Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).</li>
<li>Cao, W. Q., Duan, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breath+analysis%3A+Potential+for+clinical+diagnosis+and+exposure+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment.</a> Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).</li>
<li>Law, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+complex+viscous+liquids+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+analytes+from+cheese+products+for+fast+detection+using+neutral+desorption+extractive+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).</li>
<li>Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+organic+compounds+in+foods%3A+A+five+year+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Volatile organic compounds in foods: A five year study.</a> J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).</li>
<li>Calkins, C. R., Hodgen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+meat+flavor%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A fresh look at meat flavor.</a> Meat Sci. 77, 63-80 (2007).</li>
</ol>

Bacteriën produceren verschillende combinaties van vluchtige stoffen, die gebruikt kunnen worden voor bacteriële identificatie 10-12 en de evaluatie van de metabole status. De Sesi-MS hier beschreven methode is een middel om snel het karakteriseren van bacteriële vluchtige stoffen (in twee minuten of minder) zonder monstervoorbereiding, het genereren van een bacteriële &quot;vingerafdruk&quot; voor de identificatie van de soort. 8 In de afgelopen decennia andere atmosferische druk ionisatie MS-technieken zijn toegepast op de karakterisering van vluchtige verbindingen, inclusief selectieve ionenstroom buis (SIFT) en proton overdracht reactie (PTR) massaspectrometrie. De onderscheidende voordeel dat Sesi biedt meer dan deze andere ionisatie methodes is dat het mogelijk is om specifieke fragment pieken (op voorwaarde dat het juiste type van de massa-spectrometer is aangepast voor Sesi), dat is een belangrijk instrument voor samengestelde identificatie. We hadden geen adres piek fragmentatie in het protocol vermeld hierboven, maar voor voorbeelden van hoe fragmentatie informatie kan worden gebruikt in de karakterisering van bacteriële vluchtige stoffen, verwijzen wij u naar Zhu, et al.. 8 Sesi-MS heeft directe toepassing op de in situ detectie van bacteriële longinfecties via adem-analyse, maar kan ook worden toegepast op een instelling in die vluchtige steekproef mogelijk is. Bijvoorbeeld, de analyses van de vluchtige stoffen in de urine, bloed en adem, die relevant zijn voor de diagnose van metabole aandoeningen, zijn Maagdarm en vaatziekten, kanker, en de blootstelling van het milieu, goed geschikt voor Sesi-MS. 13,14 Sesi-MS heeft ook een breed scala van niet-klinische VOC fingerprinting toepassingen, waaronder snelle analyse van voedingsmiddelen voor de karakteristieke vluchtige stoffen geassocieerd met rijping, veroudering, of verwennen. 15-18

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaal Naam </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> API-3000 Triple Quadrupole </td><td> Instrument </td><td> Sciex </td><td></td><td> Gekocht met de Analist 1.4.2 (Applied Biosystems) </td></tr><tr><td> Sesi Ion Bron </td><td> Instrument </td><td></td><td></td><td> Custom-made; Zie referentie 6 </td></tr><tr><td> Gasstroom meter </td><td> Uitrusting </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> Kooldioxide </td><td> Uitrusting </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ 99,99% zuiver </td></tr><tr><td> Stikstof </td><td> Uitrusting </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> Ultra hoge zuiverheid </td></tr><tr><td> 100 ml glazen flessen media </td><td> Uitrusting </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45 schroefdraad </td></tr><tr><td> Doppen met Luer-poorten </td><td> Uitrusting </td><td> Bio Chem vloeistofcomponenten </td><td> 00945T-3 </td><td> Sluitdopsamenstel </td></tr><tr><td> Luerpoort stekkers </td><td> Uitrusting </td><td> Bio Chem vloeistofcomponenten </td><td> 009LP </td><td> Sluitdopsamenstel </td></tr><tr><td> Tubing 1 / 4 &quot;(OD) x 1 / 8&quot; (ID) </td><td> Uitrusting </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-95875-02 </td><td> Cap montage &amp; gas transferstraten </td></tr><tr><td> Tubing 1 / 8 &quot;(OD) x 1 / 16&quot; (ID) </td><td> Uitrusting </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-06605-27 </td><td> Sluitdopsamenstel </td></tr><tr><td> Twee-weg kleppen </td><td> Uitrusting </td><td> Cole-Parmer </td><td> 07391-04 </td><td> Sluitdopsamenstel </td></tr><tr><td> Filter, Grade AAQ </td><td> Uitrusting </td><td> Balston Filters </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> Mierenzuur, LC / MS graad </td><td> Reagens </td><td> Visser </td><td> A117-05AMP </td><td> Electrospray oplossing </td></tr><tr><td> Methanol, LC / MS graad </td><td> Reagens </td><td> Visser </td><td> A456-500 </td><td> Electrospray oplossing </td></tr><tr><td> Water, LC / MS graad </td><td> Reagens </td><td> Visser </td><td> W6-500 </td><td> Electrospray oplossing </td></tr></tbody></table>

karakteriseren bacteriële vluchtige stoffen met behulp van secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie (sesi-ms)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secundaire electrospray ionisatie massa spectrometrie (Sesi-MS) is een methode ontwikkeld voor de snelle detectie van vluchtige verbindingen, zonder de noodzaak voor monstervoorbehandeling. De methode werd voor het eerst beschreven door Fenn en collega&#39;s 1 en is toegepast op de opsporing van illegale drugs en ​​explosieven 2 3-4, de karakterisering van de huid vluchtige stoffen 5, en de analyse van de adem 6-7. Sesi ionisatie gebeurt door proton overdracht reacties tussen de electrospray oplossing en de vluchtige analyt, en is daarom geschikt voor de analyse van hetero-organische moleculen, net zoals bij de traditionele electrospray ionisatie (ESI). Echter, in tegenstelling tot de standaard ESI, de proton overdracht proces van Sesi vindt plaats in de dampfase in plaats van in oplossing (fig. 1), en daarom Sesi is het meest geschikt voor het opsporen van organische vluchtige stoffen en aërosolen. We breiden het gebruik van Sesi-MS voor de detectie van bacteriële vluchtige stoffen als een methode voor bacteriële identificatie en karakterisering 8. We hebben aangetoond dat Sesi-MS vluchtige fingerprinting, gecombineerd met een statistische analyse methode, kan worden gebruikt om bacteriële geslachten, soorten, en gemengde culturen onderscheiden in een verscheidenheid van groei media. 8 Hier hebben we de stappen voor het verkrijgen van bacteriële vluchtige vingerafdrukken met behulp van Sesi bieden -MS, waaronder de instrumentele parameters die moeten worden geoptimaliseerd om robuuste bacteriële identificatie en karakterisatie te verzekeren.

Secundaire electrospray ionisatie massa spectrometrie (Sesi-MS) kan de detectie van vluchtige organische stoffen (VOS), zonder de noodzaak voor een monstervoorbehandeling. Dit protocol bevat instructies voor het snel (binnen minuten) karakterisering van bacteriële VOS met behulp van Sesi-MS.

Karakteriseren Bacteriële Vluchtige stoffen met behulp van secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie (Sesi-MS)

Secundaire electrospray-ionisatiemassaspectrometrie (SESI-MS) is een methode die is ontwikkeld voor de snelle detectie van vluchtige verbindingen, zonder dat er behoefte is aan ...

Secundaire electrospray-ionisatie massaspectrometrie of CS EMS maakt de analyse van bacteriële vluchtige stoffen mogelijk zonder dat er een monsterbehandeling vooraf vereist is. De headspace van de bacteriële cultuur wordt met kooldioxide in de cssi-reactiekamer verplaatst. Terwijl de vluchtige stoffen door de SSI-reactiekamer bewegen, passeren ze de electrospray-wolk en worden ze geïoniseerd.Zodra ze geïoniseerd zijn, worden de vluchtige stoffen in de massaspectrometer getrokken voor analyse. Overtollig dragergas en niet-reactieve bacteriële vluchtige stoffen passeren een filter van 0,22 micron om eventuele bacteriële agentia te verwijderen als aanvullende beschermingsmaatregel voordat ze naar een chemische zuigkast worden afgevoerd. Uiteindelijk biedt dit CSI MS-protocol bacteriële vluchtige vingerafdrukken binnen enkele minuten.We verwachten dat deze technologie in veel toepassingen kan worden ingezet, waaronder uitademings- en ademanalyse voor infectieziekten, of zelfs toegepast kan worden op voedselsystemen waarbij we mogelijk pathogenen die op of in ons voedsel zitten snel kunnen detecteren. Er zijn verschillende belangrijke voordelen aan deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals GCMS, sift, MS en PT, RM S; ten eerste vereisen de vluchtige stoffen geen enkele voorbehandeling voorafgaand aan de analyse.Ten tweede is het mogelijk om specifieke ionen in het vluchtige mengsel te fragmenteren, wat de identificatie van verbindingen vergemakkelijkt. En ten derde is het snel. Meestal duurt het minder dan vijf minuten.Om elk monster te analyseren, kiest u het juiste vat voor het kweken van uw cultuur, rekening houdend met de groei-eisen van de soort, evenals de efficiënte toevoer van vluchtige stoffen naar de massaspectrometer. In deze demonstratie hebben we standaard pyrex-mediabottels van 100 milliliter geselecteerd. De bacteriële vluchtige stoffen worden door een stroom dragersgas naar de massaspectrometer getransporteerd om de drager te assembleren.Sluit gasleidingen aan op de kweekflessen met schroefdoppen die ten minste twee luer-poorten hebben. Voer de gasinlaat- en uitlaatleidingen door de luer-poorten en sluit alle overige poorten af voordat u uw monsters kweekt. Zet de vaten onder druk en dompel ze onder in water om op lekken te controleren.Gaslekken zijn een primaire oorzaak van atypische resultaten in de vorm van zwakke of afwezige vluchtige ionensignalen die gedurende de nacht ontstaan. Culturen van e coli, K 12, en pseudomonas aerogen, PAO one in LB Lennox, waarbij twee biologische replicaten voor elke soort worden voorbereid.Bereid negen steriele kweekflessen voor met 50 milliliters LB Lennox en één niet-geïnoculeerde fles om als blanco te dienen. Inoculeer elke overnight-cultuur in twee monsterflessen. Maak hiermee technische replica's en incubeer de culturen en de blanco gedurende 24 uur bij 37 degrees Celsius. Aangezien de CEMS specifiek is ontworpen voor het bemonsteren van vluchtige stoffen, dient het gebruik van geurende persoonlijke verzorgingsproducten vlak voor het gebruik van het instrument strikt te worden beperkt.Sluit alle vluchtige chemicaliën in het laboratorium af en beperk luchtstromen zoveel mogelijk tijdens het testen om contaminatie van uw instrument en de gasoverdrachtsleidingen te voorkomen. Installeer bij gebruik van levensvatige biologische agentia filters met de juiste poriegrootte in de transportgasleiding. De filters zullen de overdracht van vluchtige stoffen naar de sesi-reactiekamer niet hinderen, maar kunnen de efficiëntie van de aerosoloverdracht wel enigszins beïnvloeden.Om te verifiëren dat de spanningsvoeding is uitgeschakeld en dat het systeem elektrisch ontladen is, dient u te controleren of de indicatielampjes op de spanningsvoeding uitstaan. Controleer of de spanning op de multimeter nul is en aard de elektrische leidingen. Installeer op dit moment de electrospray-oplossing voor analyse.In positieve ionmodus gebruiken we een electrospray-oplossing van 0,1% mierenzuur, 5% methanol en 94,9% water. Om een optimale signaalintensiteit en stabiliteit te bereiken, schakelt u het kooldioxidedragergas in en stelt u de stroomsnelheid in op twee liter per minuut. Zet druk op het electrospray-reservoir om de toevoer van de electrospray-oplossing naar de reactiekamer te starten met een stroomsnelheid van vijf nanoliter per seconde. Schakel vervolgens de spanningsvoeding in en stel de spanning in op 2,5 kilovolt.De aangelegde spanning beïnvloedt de signaalintensiteit van de ionen en de stabiliteit van de electrospray Taylor-cone; voor ons systeem bieden spanningen tussen twee en vijf kilovolt de beste resultaten in de positieve ionmodus. Wees voorzichtig, aangezien de metalen oppervlakken van de ionisatiebron op dit punt een gevaarlijke schok kunnen veroorzaken. Stel nu een tuningsmethode in voor het monitoren van het SEMS-spectrum.Vink het vakje voor multiple channel acquisition of MCA uit. Stel de acquisitietijd in op 10 tot 15 minuten en start de data-acquisitie. Observeer de spectra van de achtergrond van het dragergas en voer fijne aanpassingen uit aan de aangelegde spanning om een stabiel totaal ionenchromatogram en reproduceerbare scans te verkrijgen.Ga door met het verzamelen van spectra en een TIC gedurende vijf minuten om er zeker van te zijn dat het instrument is gestabiliseerd en dat de instrumentbeveiliging is gewaarborgd. Voer de acquisitieparameters in die geschikt zijn voor uw experiment. Registreer een achtergrondspectrum van het dragergas voor toekomstige experimenten.Om een blanco spectrum te verzamelen: Leid de stroom van het dragergas door de bypassleidingen en bevestig vervolgens het blanco monster, met de kleppen gesloten, aan de overdrachtsleidingen van het instrument. Open de kleppen naar de monsterfles en sluit de kleppen van de bypassleidingen.Voor reproduceerbare spectra. Laat het systeem 30 seconden equilibreren, terwijl de vochtigheid in de reactiekamer stabiliseert. Om te controleren of het systeem geëquilibreerd is, dient de TIC te worden gemonitord; deze zal veranderen tijdens de equilibratieperiode en vervolgens stabiliseren.Zodra het systeem is geëquilibreerd, start u met de verzameling van het spectrum. Nadat het spectrum is verzameld, verwijdert u de monsterfles door eerst de bypassleidingen van het dragergas te openen en vervolgens de monsterventielen te sluiten.En tot slot het verwijderen van het monsterflesje. Spoel het systeem twee tot vier minuten door met het dragergas om het vocht en de geabsorbeerde vluchtige stoffen uit de transportleidingen te verwijderen en om carry-over tussen monsters te voorkomen. Verzamel vluchtige vingerafdrukgegevens voor elk bacterieel monster, waarbij tussentijds extra blanco spectra worden verzameld om een grondige blanco-subtractie te waarborgen.De vluchtige vingerafdrukken in de positieve ionmodus voor E. coli en P. aerogen, aeroob gekweekt in LB Lennox gedurende 24 uur bij 37 °C, zijn verschillend. Het vluchtige spectrum van E. coli wordt gedomineerd door indu bij een massa-ladingsverhouding van 118, terwijl het spectrum van Pseudomonas aerogen een grotere variëteit aan toevoegbare eiwitpieken bevat.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk dat u de instrumentele parameters noteert die u voor uw analyse heeft geoptimaliseerd, zoals de aangelegde spanning, de samenstelling van de electrospray-oplossing en de stroomsnelheid van het dragergas. Het is daarnaast belangrijk dat u verslagen bijhoudt van uw representatieve spectra, zodat u uw analyses in de toekomst kunt reproduceren. Vergeet niet dat het werken met pathogene bacteriën en hoge spanning uiterst gevaarlijk kan zijn.Daarom moeten er altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het beperken van de toegang tot het css CMS tijdens het experiment. Je zou nu in staat moeten zijn om reproduceerbare CSS- en EMS-spectra te verkrijgen voor de bacteriële vluchtige stoffen in je systeem. Veel succes.

characterizing-bacterial-volatiles-using-secondary-electrospray

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie (DESI-MS) is een ambient methode waarbij monsters, met inbegrip van biologische weefsels, kunnen worden afgebeeld met een minimale monstervoorbereiding. Door rastering het monster onder de ionisatie-elektrode, deze spray-gebaseerde techniek voldoende ruimtelijke resolutie om moleculaire kenmerken van belang te onderscheiden binnen coupes.

Beeldvorming van biologische weefsels door desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie

Deze video geeft een protocol voor de massaspectrometrische analyse van de vluchtige en oxidatie gevoelige verbindingen met elektronimpactionisatie ionisatie. De voorgestelde techniek is bijzonder interessant voor anorganische chemici werken met metaal organyls, silanen of fosfanen die moeten worden behandeld met inerte omstandigheden, zoals de Schlenk-techniek.

Analyse van vluchtige en oxidatie gevoelige verbindingen met behulp van een Cold Inlaat Systeem en Electron Impact Massaspectrometrie

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

Fizzy extractie is een nieuwe laboratorium techniek voor de analyse van vluchtige en semivolatiele verbindingen. Een draaggas wordt opgelost in het vloeibare monster door overdruk toe te passen en het monster te roeren. De monsterkamer wordt dan gedecomprimeerd. De analysesoort wordt bevrijd aan de gasfase door bruising.

Fizzy Extractie van vluchtige organische verbindingen gecombineerd met atmosferische druk Chemische ionisatie Quadrupole Mass Spectrometry

Een protocol voor het karakteriseren van de chemische samenstelling van uitgeademde adem in real-time met behulp van ionisatie van de secundaire nanoelectrospray gekoppeld aan hoge resolutie massa spectrometrie wordt aangetoond.

Real-time adem analyse met behulp van secundaire Nanoelectrospray ionisatie gekoppeld aan massaspectrometrie voor hoge resolutie

Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van de bloemige geur vluchtige stoffen uit bloeiende bloemen, met behulp van een niet-destructieve bemonsteringsprocedure.

Snelle verzameling van bloemige geur volatiles met een headspace vluchtige collectie techniek voor GC-MS thermische desorptie bemonstering

Hier presenteren we een protocol om de volledige biomoleculaire corona, eiwitten en metabolieten te karakteriseren, verkregen door nanomaterialen uit biofluïden met behulp van een capillaire elektroforese - massaspectrometriebenadering.

Capillaire elektroforese massaspectrometrie benaderingen voor karakterisering van het eiwit en metaboliet corona verworven door nanomaterialen

Dit protocol beschrijft de extractie van vluchtige organische stoffen uit een biologisch monster met de vacuümondersteunde sorptiemiddelextractiemethode, gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie met behulp van de Entech Sample Preparation Rail en data-analyse. Het beschrijft ook de kweek van biologische monsters en stabiele isotooponderzoek.

Het vastleggen van actief geproduceerde microbiële vluchtige organische stoffen uit mens-geassocieerde monsters met vacuümondersteunde sorptie-extractie

Dit protocol beschrijft enkelcel massaspectrometrie beeldvorming van OVCAR-8-cellen met behulp van desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan Orbitrap-massaspectrometers voor metabolomische analyse met hoge ruimtelijke resolutie.

Single-cell massaspectrometriebeeldvorming met desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan orbitrap-massaspectrometers

Leer hoe je bacteriële vluchtige stoffen karakteriseert met secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie zonder voorbehandeling. Deze methode detecteert unieke vingerafdrukken in minder dan vijf minuten.

Karakteriseren Bacteriële Vluchtige stoffen met behulp van secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie (Sesi-MS)

Meer video's verkennen