Karakteriseren Bacteriële Vluchtige stoffen met behulp van secundaire electrospray ionisatie massaspectrometrie (Sesi-MS)
8 juni 2011
Secundaire electrospray ionisatie massa spectrometrie (Sesi-MS) kan de detectie van vluchtige organische stoffen (VOS), zonder de noodzaak voor een monstervoorbehandeling. Dit protocol bevat instructies voor het snel (binnen minuten) karakterisering van bacteriële VOS met behulp van Sesi-MS.
Secundaire elektrospray-ionisatie, massaspectrometrie of CS EMS maakt de analyse van bacteriële vluchtige stoffen mogelijk zonder dat er een monster voor nodig is. Pre-behandeling. De headspace van de bacteriecultuur wordt verplaatst door koolstofdioxide naar de CSSI-reactiekamer. Terwijl de vluchtige stoffen door de SSI-reactiekamer trekken, passeren ze door de elektrospraywolk en worden geïoniseerd.
Eenmaal geïoniseerd, worden de vluchtige stoffen naar de massaspectrometer getrokken voor analyse. Overtollig dragergas en niet-reactieve bacteriële vluchtige stoffen worden door een 0,22 micronfilter gevoerd om eventuele bacteriële agentia te verwijderen als een extra beschermingsmaatregel, geventileerd naar een chemisch afzuigkap. Uiteindelijk biedt dit CSI MS-protocol bacteriële vluchtige vingerafdrukken binnen enkele minuten.
We verwachten dat deze technologie in veel toepassingen kan worden gebruikt, inclusief uitademing, ademanalyse voor infectieziekten, of zelfs toegepast op voedselsystemen waar we mogelijk snel pathogenen kunnen detecteren die op of in ons voedsel zitten. Er zijn verschillende belangrijke voordelen aan deze techniek. In vergelijking met bestaande methoden zoals GCMS-zeef, MS en PT, RMS ten eerste, hebben de vluchtige stoffen geen voorbehandeling nodig voor analyse.
Ten tweede is het mogelijk om specifieke ionen in het vluchtige mengsel te fragmenteren, wat de identificatie van verbindingen gemakkelijker maakt. En ten derde is het snel. Het duurt meestal minder dan vijf minuten.
Om elk monster te analyseren, kies het juiste vat voor het kweken van uw cultuur, rekening houdend met de groeivereisten van de soort, evenals de efficiënte aflevering van vluchtige stoffen naar de massaspectrometer. In deze demonstratie hebben we gestandaardiseerde 100 milliliter pyre-mediaflessen geselecteerd. De bacteriële vluchtige stoffen worden naar de massaspectrometer getransporteerd door een stroom dragergas om de drager te assembleren.
Gasleidingen passen de kweekflessen met draadgebonden doppen die minstens twee aaspoorten hebben. Plaats gasinlaat- en uitlaatleidingen door de aaspoorten en sluit eventuele extra poorten af voordat u uw monsters gaat kweken. Druk de vaten onder en dompel ze onder in water om op lekken te controleren.
Gaslekken zijn een primaire oorzaak van atypische resultaten in de vorm van zwak of afwezig. Vluchtige ionsignalen groeien 's nachts. Culturen van e coli, K 12 en pseudomonas aerogen, PAO een in LB Lennox bereiden twee biologische replica's voor elke soort.
Bereid negen steriele kweekflessen met 50 milliliter LB Lennox en één niet-geïnoculeerde fles om als blanco te worden gebruikt, inoculeer elke overnachtingscultuur in twee monsterflessen. Maak technische replica's, incubeer de culturen en het blanco gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Aangezien de CEMS specifiek is ontworpen om vluchtige stoffen te bemonsteren, beperk het gebruik van geurige persoonlijke verzorgingsproducten voordat u het instrument strak gebruikt.
Dek alle vluchtige chemicaliën in het lab af en controleer luchtstromen zoveel mogelijk tijdens het testen om besmetting van uw instrument en de gasoverdrachtslijnen te voorkomen. Installeer bij levensvatbare biologische agentia filters met de juiste poriëngrootte in de dragergaslijn. De filters interfereren niet met de overdracht van vluchtige stoffen naar de SESI-reactiekamer, maar kunnen de efficiëntie van de aerosoloverdracht enigszins beïnvloeden.
Om te verifiëren dat de spanningsvoorziening is uitgeschakeld en dat het systeem ontladen is van elektriciteit, controleert u de indicatorlampjes op de spanningsvoorziening uit. Zorg ervoor dat de spanning op de multimeter nul is en aard de elektrische aansluitingen. Installeer op dit moment de elektrosprayoplossing voor analyse.
In positieve ionmodus gebruiken we een elektrosprayoplossing van 0,1% mierenzuur, 5% methanol en 94,9% water Om een optimale signaalintensiteit en stabiliteit te bereiken, zet u het koolstofdioxide-dragergas aan en stelt u de stroomsnelheid in op twee liter per minuut. Breng druk aan op het elektrospray-reservoir om de levering van de elektrosprayoplossing naar de reactiekamer te starten met een stroomsnelheid van vijf nanoliter per seconde. Zet vervolgens de spanningsvoorziening aan en pas de spanning aan op 2,5 kilovolt.
De toegepaste spanning beïnvloedt de signaal-ionintensiteit en de stabiliteit van de elektrospray. Tailor-kegel voor onze systeemspanningen tussen twee en vijf kilovolt. Bied de beste resultaten in positieve ionmodus. Wees voorzichtig, want op dit punt zijn de metalen oppervlakken van de ionisatiebron in staat om een gevaarlijke schok te leveren. Stel nu een afstelpatroon in voor het monitoren van het SEMS-spectrum.
Schakel het selectievakje Meerdere kanalen verwerven of MCA uit. Stel de verwervingstijd in op 10 tot 15 minuten en start de gegevensverwerving. Observeer de spectra van de achtergrond van het dragergas en maak fijne aanpassingen aan de toegepaste spanning om een stabiel totaal ionenchromatogram en reproduceerbare scans te verkrijgen.
Verzamel spectra en TIC gedurende vijf minuten om er zeker van te zijn dat het instrument is gestabiliseerd met verzekerd instrument. Voer de verwervingsparameters in die geschikt zijn voor uw experiment. Neem een achtergrondspectrum van het dragergas op voor toekomstige experimenten.
Om een blanco spectrum te verzamelen. Leid de stroom van het dragergas door de bypasslijnen en bevestig vervolgens het blanco monster met de kleppen gesloten aan de overdrachtslijnen van het instrument. Open de kleppen naar de monsterfles en sluit de kleppen van de bypasslijnen.
Voor reproduceerbare spectra. Laat het systeem 30 seconden gelijkwaardig worden, waarbij de luchtvochtigheid in de reactiekamer zich stabiliseert. Om ervoor te zorgen dat het systeem gelijkwaardig is, bewaakt u de TIC, die tijdens de gelijkwaardigheidsperiode zal veranderen, gevolgd door stabilisatie.
Zodra het systeem gelijkwaardig is, begint u met het verzamelen van spectra. Nadat het spectrum is verzameld, verwijdert u de monsterfles door eerst de bypasslijnen van het dragergas te openen. Sluit vervolgens de monsterkleppen.
En ten slotte, verwijder de monsterfles. Spoel het systeem ge
Overzicht
Secundaire electrospray-ionisatie-massaspectrometrie (SESI-MS) maakt de snelle detectie van vluchtige organische stoffen (VOC's) uit bacteriële culturen mogelijk zonder monstervoorbehandeling. Dit protocol beschrijft de stappen voor het efficiënt karakteriseren van bacteriële VOC's met behulp van SESI-MS.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Massaspectrometrie
- Microbiologie
- Vluchtige organische verbindingen
Achtergrond
- SESI-MS is een techniek die de analyse van bacteriële vluchtige stoffen mogelijk maakt.
- De methode elimineert de noodzaak voor monstervoorbehandeling.
- Het levert snelle resultaten op, doorgaans binnen vijf minuten.
- Toepassingen omvatten ademanalyse voor infectieziekten en de detectie van pathogenen in voedselsystemen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor de snelle karakterisering van bacteriële VOC's.
- Het aantonen van de voordelen van SESI-MS ten opzichte van traditionele methoden.
- Het faciliteren van de identificatie van bacteriële vluchtige vingerafdrukken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van bacteriële culturen in steriele media.
- Gebruik van kooldioxide om vluchtige stoffen uit de headspace naar de SESI-kamer te verplaatsen.
- Ionisatie van vluchtige stoffen in de SESI-reactiekamer.
- Massaspectrometrische analyse van de geïoniseerde vluchtige stoffen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van bacteriële vluchtige vingerafdrukken.
- Snelle analysetijd van minder dan vijf minuten.
- Mogelijkheid om specifieke ionen te fragmenteren voor een eenvoudigere identificatie van verbindingen.
- Aangetoonde betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de resultaten.
Conclusies
- SESI-MS is een waardevol instrument voor het analyseren van bacteriële vluchtige stoffen.
- De techniek biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden.
- Potentiële toepassingen strekken zich uit tot de klinische sector en het gebied van voedselveiligheid.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de sector
Snelle, labelvrije detectie van bacteriële vluchtige vingerafdrukken met behulp van SESI-MS maakt high-throughput microbiële karakterisering mogelijk zonder monstervoorbehandeling, wat de vroegfase-ontdekking en screening versnelt. Deze aanpak ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid bij microbiële identificatie en vermindert risico's in downstream translationele workflows door robuuste, reproduceerbare vluchtige profielen te leveren. De integratie van SESI-MS in R&D-pipelines verbetert de besluitvorming over portfolio's door snelle, kwantitatieve differentiatie van bacteriële soorten en gemengde culturen mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt snelle analyse van microbiële metabole routes mogelijk via vluchtige profilering.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door het onderscheiden van bacteriële genera en species op basis van vluchtige signaturen.
- Faciliteert biologische risicoreductie door middel van reproduceerbare, kwantitatieve metingen van vluchtige stoffen.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor de selectie en triage van microbiële targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gevalideerde vluchtige vingerafdrukken voor standaardisatie en reproduceerbaarheid van de analyse.
- Levert kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor high-throughput screening van microbiële culturen.
- Maakt snelle, schaalbare evaluatie van compound-effecten op het bacteriële metabolisme mogelijk.
- Ondersteunt hergebruik van het platform in diverse microbiële systemen zonder monstervoorbehandeling.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt vluchtige biomarkerprofielen af met ziekterelevante microbiële systemen, indien van toepassing.
- Garandeert continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie door robuuste vluchtige read-outs te handhaven.
- Vermindert het translationele risico door reproduceerbare, kwantitatieve gegevens te leveren voor vergelijkingen tussen studies.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling op basis van differentiatie van de vluchtige vingerafdruk.
Integratie van pipeline en workflow
SESI-MS vluchtige fingerprinting bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking, screening en translationeel onderzoek, waardoor een naadloze overgang van hypothesetoetsing naar preklinische validatie mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking via snelle analyse van vluchtige stoffen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten van vluchtige stoffen voor assay-gereedheid en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Levert massaspectra met een hoge resolutie en statistische differentiatie van bacteriële monsters.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft de continuïteit van vluchtige biomarkergegevens tijdens de ontdekkings- en preklinische fasen.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een gestandaardiseerd, herbruikbaar platform voor de analyse van microbiële vluchtige stoffen binnen R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij microbiële identificatie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt workflows met snelle, reproduceerbare en schaalbare analyse van vluchtige stoffen.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk en verbetert de kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een laat stadium te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder ontwikkelen van microbiële targets en assays.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in massaspectrometrie en het hanteren van microbiële culturen.
- Toegang tot SESI-MS-instrumentatie en analytische infrastructuur is noodzakelijk.
- Strenge standaardisatie van instrumentparameters en dataregistratie tussen teams is vereist.
- Aanpasbaar aan diverse bacteriële soorten en groeimedia, met aandacht voor contaminatiebeheersing.
- Veiligheidsmaatregelen voor het instrument en biosafety zijn essentieel vanwege de hoge spanning en pathogene agentia.
