Name: Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Leer hoe je HIV-1 geïnfecteerde CD4+ T-cellen isoleert voor NK-celcytotoxiciteitstests. Deze methode gebruikt flowcytometrie en chromium-51-release om immuunresponsen te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III%2FLAV-infected+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li>
<li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li>
<li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li>
<li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li>
<li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li>
<li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li>
<li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysis+of+endogenously+infected+CD4%2B+T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li>
<li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells%3A+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li>
<li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li>
</ol>

Wanneer correct gedaan assays beschreven in dit protocol moet een representatief beeld van NK-cellen vermogen om te degranuleren tegen en lyseren HIV-1 geïnfecteerde cellen (zie Figuur 5). NK celdegranulatie in reactie op HIV-geïnfecteerde cellen en de NK-cellen lysis HIV-geïnfecteerde cellen moet worden recht evenredig 10. Betrouwbare resultaten voor de twee NK-cel functionele assays aan cytotoxische respons te meten aan HIV-geïnfecteerde cellen zijn afhankelijk van de isolatie van zeer gezuiverde NK-cellen, evenals een sterk gezuiverde populatie van geïnfecteerde cellen. Na gezuiverd NK-cellen en HIV-1 geïnfecteerde cellen zijn van cruciaal belang voor het bereiken van een tamelijk nauwkeurig effector naar cel-verhouding doel. Ook het verwijderen van dode en apoptotische cellen van de doelcel populaties is van belang voor de 51 Cr etikettering of incubatie met de effector cellen. 51 Cr kunnen worden geïnternaliseerd door cellen die apoptose ondergaan als de aanwezigheid van dode of apoptotische cellen tijdens de isotoop labeling stap zal resulteren in een hoge spontane release en zal de berekende% specifieke lysis verstoren. Bovendien kan de aanwezigheid van dode of apoptotische cellen veroorzaken NK celdegranulatie wat resulteert in abnormaal hoge niveaus van CD107a expressie. Precieze pipetteren is noodzakelijk bij het ​​verwijderen van de cel-vrije supernatanten na de incubatie van NK-cellen en target cellen in de 51 Cr release assays, zoals de verschillen in het volume van de supernatant uit elke repliceren goed zal resulteren in een hoge standaarddeviaties. Wijzigingen kunnen worden aangebracht in deze protocollen aan de rol van specifieke NK receptoren te evalueren bij het ​​ontstaan ​​van NK-cellen lysis van HIV-geïnfecteerde cellen door het incuberen van de effectoren of doelen voorafgaand aan de co-cultuur met antagonistische antilichamen die aan specifieke receptoren of liganden 6,11. Cytokine-behandelde NK-cellen (bv. IL-2, IL-15) kan worden gebruikt om de functionaliteit van de gestimuleerde NK-cellen 12 te evalueren. Evenzo kan antilichaam-afhankelijke cel cytotoxiciteit testen worden uitgevoerd met behulp van deze protocollen. Anti-HIV-antilichamen (bijvoorbeeld anti-gp120) kunnen worden toegevoegd aan de doelcellen voor erkenning door de NK-cellen een lage affiniteit Fc-receptor CD16 13. Deze testen, hoewel opgezet om NK-cel-cytotoxische reacties maatregel om de HIV-geïnfecteerde cellen, kan ook worden aangepast om het vermogen van NK cellen om cytokines te produceren volgende HIV-geïnfecteerde cel herkenning te meten. Hoewel we beschreven in dit protocol het gebruik van in vitro geïnfecteerde cellen als doelcellen we hebben onlangs beschreven de generatie van target cellen van patiënten die geïnfecteerd zijn met HIV. Dit vereist de isolatie van CD4 + T-cellen, gevolgd door de uitbreiding van de cellen over een periode van twee weken na stimulatie met mitogenen in de aanwezigheid van interleukine-2 11. Na de periode van twee weken van expansie, zijn de protocollen beschreven in dit artikel gebruikt om de doelcellen te isoleren.

<table><tbody><tr><td>Vaccutainer-buizen (natriumheparine)</td><td>BD Biosciences</td><td>367874</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep CD4+ T-cel isolatiekit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CMF PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Medium voor lymfocytenseparatie</td><td>Cellgro</td><td>25-072-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline / Streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>T-cel expansiekit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-441</td><td></td></tr><tr><td>CMF HBSS (1x)</td><td>Hyclone</td><td>SH30588.01</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td></td><td>46-034-Cl</td><td></td></tr><tr><td>NK-cel negatieve isolatiekit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-657</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12440-046</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ positieve isolatiekit</td><td>Invitrogen</td><td>113.31D</td><td></td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PacificBlue</td><td>BD Biosciences</td><td>558117</td><td></td></tr><tr><td>CD14 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>325616</td><td></td></tr><tr><td>CD20 PacificBlue</td><td>Biolegend</td><td>302328</td><td></td></tr><tr><td>CD56 APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD69 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>CD107a FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;51&lt;/sup&gt;Chromium</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEZ030002MC</td><td></td></tr><tr><td>Gamma-tellersbuizen</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1270-401</td><td></td></tr><tr><td>2470 Automatische Gamma-teller</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>2470-0050</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FJ-9-1YR</td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding en het gebruik van hiv-1 geïnfecteerde primaire cd4 + t-cellen als doelcellen in natural killer cell cytotoxische assays

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cellen zijn een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons tegen virus-geïnfecteerde cellen. Het is belangrijk om te begrijpen het vermogen van NK-cellen te herkennen en te lyseren met HIV-1 geïnfecteerde cellen, omdat de identificatie van elke dwaling in de NK celfunctie tegen HIV-geïnfecteerde cellen zou kunnen leiden tot behandelingen die hun cytolytische activiteit te vergroten. Er is behoefte aan HIV-geïnfecteerde primaire T-cel ontploffing te gebruiken als target cellen in plaats van geïnfecteerde-T-cel-lijnen in de cytotoxiciteit assays. T-cellijnen, zelfs zonder infectie, zijn heel gevoelig voor NK-cel lysis. Bovendien, is het noodzakelijk om autologe primaire cellen te gebruiken om belangrijke histocompatibiliteitscomplex klasse I mismatch tussen het doel en effector-cel die zal resulteren in lysis te voorkomen. Vroege studies ter beoordeling van NK-cel cytolytische reacties op de primaire HIV-geïnfecteerde cellen niet significant doden van de geïnfecteerde cellen 1,2 laten zien. Echter, met behulp van HIV-1 geïnfecteerde primaire T-cellen als doelcellen in NK cel functionele testen is moeilijk geweest vanwege de aanwezigheid van contaminerende niet-geïnfecteerde cellen 3. Deze inconsistente geïnfecteerde cel naar niet-geïnfecteerde cel ratio zal leiden tot een variatie in NK celdoding tussen monsters die niet kan worden veroorzaakt door variabiliteit in de donor NK celfunctie. Zo zou het nuttig zijn om te werken met een gezuiverde geïnfecteerde cel populatie om de effector te standaardiseren naar cel ratio&#39;s tussen 3,4 experimenten doel. Hier laten we zien de isolatie van een sterk gezuiverde populatie van HIV-1 geïnfecteerde cellen door gebruik te maken van het vermogen van HIV-1 om te down-moduleren CD4 op geïnfecteerde cellen en de beschikbaarheid van commerciële kits te verwijderen dode of stervende cellen 3-6. Het gezuiverde geïnfecteerde primaire T-cel ontploffing kan vervolgens worden gebruikt als doelwit in ofwel een degranulatie of cytotoxische test met gezuiverd NK-cellen als de effector bevolking 5-7. Gebruik van NK-cellen als effectoren in een degranulatie test evalueert het vermogen van een NK-cel om de lytische inhoud van gespecialiseerde lysosomen 8 genaamd &quot;cytolytische korrels&quot; release. Door kleuring met een fluorochroom geconjugeerd antilichaam tegen CD107a, een lysosomale membraan eiwit dat wordt geuit op het NK celoppervlak als de cytolytische korrels zekering aan het plasmamembraan, kunnen we bepalen welk percentage van NK-cellen degranuleren in reactie op cel herkenning doel. Als alternatief kan NK-cel-lytische activiteit worden geëvalueerd in een cytotoxische test die het mogelijk maakt voor de bepaling van het percentage van target cellen gelyseerd door het vrijkomen van 51 Cr vanuit de doelcel in de aanwezigheid van NK-cellen.

Cytotoxiciteit assays op natural killer cellen lytische reacties maatregel om de HIV-geïnfecteerde cellen wordt beperkt door de zuiverheid van de doelcellen. Tonen we hier de isolatie van een sterk gezuiverde populatie van HIV-1 geïnfecteerde primaire T-cel ontploffing door gebruik te maken van het vermogen van HIV-1 s tot down-moduleren CD4.

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

Natural killer-cellen (NK-cellen) vormen een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons op virusgeïnfecteerde cellen. Het is belangrijk om het vermogen van NK-cellen te begrijpen...

Het algemene doel van deze procedure is om de cytotoxische respons van NK-cellen op HIV-1-geïnfecteerde cellen te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst CD4-positieve T-cellen uit veneus bloed te isoleren en te infecteren. Vervolgens worden natural killer-cellen uit dezelfde donor geïsoleerd.Vervolgens worden niet-geïnfecteerde CD4-positieve T-cellen gescheiden van de geïnfecteerde cellen. Ten slotte worden de geïnfecteerde cellen en de NK-cellen respectievelijk als targets en effectoren gebruikt in een van de twee assays om de cytotoxiciteit van de NK-cellen te beoordelen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat NK-cellen kunnen reageren op HIV-1-geïnfecteerde cellen via upregulatie van CD107a-expressie, bepaald door flowcytometrische analyse, of via chromium-51-vrijgave, gedetecteerd door een gammacounter.Deze methode kan belangrijke vragen binnen het HIV-1-veld beantwoorden, zoals of NK-cellen reageren op HIV-1-geïnfecteerde cellen, welke receptor-ligandinteracties belangrijk zijn bij NK-T-celinteracties en of HIV-1-virale eiwitten de NK-celrespons op HIV-1-geïnfecteerde cellen moduleren. Tel, na het stimuleren van CD4-positieve T-cellen die uit menselijk perifeer bloed zijn geïsoleerd en gedurende 72 uur zijn gestimuleerd met anti-CD3- en anti-CD28-gekoppelde beads, de resulterende T-celpopulatie met een hemocytometer. Verdeel de cultuur vervolgens in twee groepen: breng ongeveer 2 × 10⁶ T-cellen over naar een 15 ml conische buis voor gebruik als niet-geïnfecteerde controlegroep en plaats de rest van de CD4-positieve T-celsuspensie in een 50 ml conische buis voor de infectiegroep.Centrifugeer beide groepen bij 300 G bij 22 °C gedurende 10 minuten en aspireer vervolgens het supernatant. Resuspendeer de CD4-positieve T-cellen uit de 50 ml buis direct in kweekvloeistoffen die virionen bevatten en voeg polybrene toe tot een eindconcentratie van 10 mg/ml. Infecteer de cellen vervolgens via spin-infectie bij 1200 ×g gedurende twee uur bij 20 tot 25 °C.Hier worden de cellen geïnfecteerd met DHIV three met een multipliciteit van vijf. Verwijder na voltooiing van de spin-infectie het supernatant en resuspendeer de geïnfecteerde cellen bij een dichtheid van 3 × 10⁶ per milliliter in compleet RPMI aangevuld met 100 units per milliliter IL two.Kweek vervolgens de niet-geïnfecteerde cellen en de nieuw geïnfecteerde cellen gedurende 72 uur in een six-well plaat als er een replicatie-incompetent virus is gebruikt om de cellen te infecteren, of gedurende vijf tot zeven dagen als er een replicatie-competent virus is gebruikt. Verzamel het supernatant dat de geïnfecteerde CD4-positieve T-celculturen bevat en centrifugeer de cellen bij 300 G gedurende 10 minuten bij 22 °C met de rem ingeschakeld. Aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet in 2 mL PBS met 2% FBS en 2 mM EDTA en tel de cellen op een hemocytometer met behulp van een CD4-positieve isolatiekit.Verwijder de CD4-positieve niet-geïnfecteerde T-cellen. Volg de instructies van de fabrikant voor de isolatie van de CD4-positieve T-cellen, met uitzondering van het feit dat een A1 anti-CD4 B-per-cel ratio wordt gebruikt. Verwijder vervolgens de dode cellen uit de gezuiverde virusdragende celpopulatie met behulp van een kit voor het verwijderen van dode cellen.Verzamel de levende T-celpopulatie volgens de instructies van de fabrikant en centrifugeer de gezuiverde cellen 10 minuten lang bij 300 G. Zet de rem aan, verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 milliliter compleet RPMI en tel de cellen. Perifere bloed-NK-cellen worden eerst geïsoleerd van dezelfde donor als de CD4-positieve T-cellen.Tel na de nachtelijke kweek de NK-cellen met een hemocytometer, centrifugeer deze bij 300 G gedurende 10 minuten met de rem ingeschakeld en resuspendeer de cellen vervolgens in compleet RPMI, waarbij de uiteindelijke concentratie wordt aangepast naar 10⁶ cellen per milliliter. Verzamel daarna de gezuiverde, geïnfecteerde en controle-niet-geïnfecteerde T-cel-suspensies en centrifugeer deze bij 300 G gedurende 10 minuten. Verwijder met de rem ingeschakeld het supernatant en resuspendeer de pellets.Voor een positieve controle worden ongeveer 2 × 10⁶ NK-lyse-gevoelige K 5 62-cellen gebruikt in compleet RPMI met een concentratie van 2 × 10⁶ cellen per milliliter. Centrifugeer de K 5 62-cellen in deze video bij 300 G gedurende 10 minuten met de rem ingeschakeld, verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer het pellet in compleet RPMI bij 2 × 10⁶ cellen per milliliter.Nadat alle celpopulaties zijn gewassen en zijn resuspenderd in hun experimentele concentraties, worden de NK-cellen samengebracht met ofwel K 5 62-cellen, niet-geïnfecteerde T-cellen of HIV-geïnfecteerde T-cellen. In individuele wells van een 96-wells V-bodemplaat wordt slechts één replica per doelceltype gebruikt om de niet-specifieke degranulatie van NK-cellen te meten. Voeg in één well 100 µL NK-effectorcellen en 100 µL enkel medium toe.Voeg aan elke well een volume van 10 µL van het fluorochroom-geconjugeerde anti-CD107A antilichaam toe en centrifugeer de plaat 2 minuten bij 20 ×g met de rem aan bij 22 °C. Incubeer de plaat vervolgens vier uur bij 37 °C en 5% CO2. Centrifugeer de plaat na incubatie 5 minuten bij 400 ×g met de rem aan bij 22 °C en verwijder vervolgens het supernatant met een aspiratiepipet van 2 mL voorzien van een P200-tip.Voeg vervolgens 100 µL flowbuffer toe aan elke well en kleur de cellen vervolgens op ijs gedurende 20 minuten met anti CD 3 14 20 Pacific blue-antilichamen en anti CD 56 A PC-antilichamen. Nadat de cellen zijn gekleurd, voegt u 200 µL flowbuffer toe aan elke well en centrifugeert u de plaat gedurende vijf minuten bij 400 G. Zuig bij een temperatuur van 22 °C, met de rem ingeschakeld, voorzichtig de flowbuffer uit elke well af.Was de cellen opnieuw met een aspiratiepipet van 2 ml voorzien van een micropipetpunt van 200 µL, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet niet wordt verstoord, en resuspendeer de pellets vervolgens in 200 µL 1% paraformaldehyde in calcium- en magnesiumvrije PBS. Breng de cel-suspensies vervolgens over naar flow-buisjes en vul het totale volume in de buisjes aan tot 300 µL door aan elk buisje ongeveer 100 µL 1% paraformaldehyde in calcium- en magnesiumvrije PBS toe te voegen. Lees vervolgens 2 × 10⁴ NK-cel events via flowcytometrie met FACSDiva-software en analyseer de gegevens met FlowJo-software. Label gezuiverde HIV V1-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde T-cel targets als positieve controle met 125 µCi chromium 51 in zoutoplossing per 10⁶ cellen gedurende twee uur bij 37 °C en 5% CO2 in een conische buis van 15 ml; label daarnaast 10⁶ K562-cellen met 100 µCi chromium 51 gedurende twee uur.Onder dezelfde kweekomstandigheden. Gebruik compleet RPMI om het uiteindelijke volume van de kleuringsoplossing voor elke celpopulatie aan te vullen tot 500 microliters. Het volume chroom 51 dat aan de doelcellen wordt toegevoegd, wordt berekend met de universele radioactieve vervalcalculator op de website van PerkinElmer terwijl de doelcellen worden gelabeld.Verwijder eerder geïsoleerde NK-cellen uit de kweek en tel deze. Centrifugeer de NK-cellen bij 300 G gedurende 10 minuten met de rem ingeschakeld en resuspendeer de pellets in compleet RPMI. Verdeel de resulterende cel-suspensies over drie conische buizen van 15 milliliter. Stel de celdichtheid in op 10⁵ per milliliter in de eerste buis, 2,5 × 10⁵ per milliliter in de tweede buis en 5 × 10⁵ per milliliter in de derde buis. In de chromium 51-release assay zullen de NK-cellen worden gebruikt als effectorcellen in een ratio van respectievelijk 1:1, 2,5:1 en 5:1.Haal de nu gelabelde doelcellen uit de incubator en voeg 4,5 milliliters RPMI compleet toe aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 300 G gedurende 10 minuten. Giet vervolgens voorzichtig het supernatant in een container voor radioactief vloeibaar afval zonder de pellet te verstoren.Was de doelcellen nog twee keer om al het niet-geabsorbeerde chroom 51 te verwijderen. Het supernatant van de derde wasbeurt mag worden weggegooid in een container voor niet-radioactief vloeibaar afval. Resuspendeer de doelcellen nu in compleet RPMI tot de uiteindelijke celdichtheid van 10⁵ per milliliter, zoals getoond in een voorbeeld van een typische opstelling voor een chroom 51-release-assay.Let op dat elke groep in drievoud wordt uitgevoerd; verdeel aliquoten van 100 µL gelabelde targetcellen over de aangegeven putjes van een 96-wells V-bodemplaat voor een definitief aantal van 10⁴ targetcellen per putje. Voeg vervolgens 100 µL van de NK-suspensies toe aan de targetcellen in de overeenkomstig aangegeven effector-targetcelverhoudingen. Voeg daarna 100 µL targets toe aan de bijbehorende putjes waarin de effectorcellen ontbreken voor de groepen voor maximale en spontane release.Vul de groep voor spontane afgifte aan met nog eens 100 µL RPMI compleet, centrifugeer de plaat bij 20 ×g gedurende twee minuten met de rem ingeschakeld en incubeer de plaat vervolgens bij 37 °C en 5% CO2 gedurende vier uur. Voeg na de incubatie van vier uur aan elke put, behalve aan de putten voor maximale afgifte, 5 µL toe van een 1:10 verdunning van menselijke rode bloedcellen in RPMI compleet; voeg vervolgens 100 µL 10% natriumdodecylsulfaat toe aan de putten voor maximale afgifte en centrifugeer de plaat bij 400 ×g gedurende vijf minuten. Om de cellen te pelletteren, labelt u een gamma-tellerbuis voor elke experimentele put en controleput.Oogst 100 µL celvrije supernatant uit elke put van de 96-well plaat en breng het supernatant uit elke put over in de vooraf gelabelde buisjes. Meet de hoeveelheid chromium 51 in elk buisje in een PerkinElmer 24 70 automatische gammacounter. De volgende scatterplots tonen een typische flowcytometrische gating-strategie voor het analyseren van de resultaten van een CD 1 0 7.Een degranulatie-assay. Eerst worden individuele cellen geselecteerd (gegatet), waarbij klonten of doubletten worden uitgesloten op een plot van FSCA tegenover FSCH. Vervolgens wordt de gate voor individuele cellen, uitgezet als FSCA tegenover SSC, gegatet op de lymfocytenpopulatie, opnieuw aangegeven door de roze ovaal.De lymfocyt-gate wordt vervolgens uitgezet als CD 3 14 20 tegenover CD 56, waarbij geselecteerd wordt op de CD 56-positieve en CD 3 14 20-negatieve populatie, zoals aangegeven door de verticale roze ovaal. Hier wordt de NK GA uitgezet als CD 1 0 7 A tegenover CD 56 om NK-cellen te visualiseren die zijn gedegranuleerd; in de volgende twee figuren worden representatieve resultaten getoond van de beoordeling van de cytotoxische respons van natural killer-cellen tegen HIV-1-geïnfecteerde cellen. NK-cellen werden geëvalueerd op hun vermogen om te degranuleren zonder targets en als respons op K 5 62-cellen, primaire CD 4-positieve T-cellen en HIV-geïnfecteerde primaire T-cellen, beoordeeld op basis van het percentage NK-cellen dat oppervlakte-CD 1 0 7 A tot expressie brengt. De getallen in elk kwadrant vertegenwoordigen het percentage van de totale NK-cellen in deze figuur.NK-cellen werden geëvalueerd op hun vermogen om K 5 62-cellen, niet-geïnfecteerde CD four-positieve T-cellen en HIV one-geïnfecteerde T-cellen te lyseren in een acromium 51-release assay bij effectorcel-doelcelverhoudingen van 2,5:1, 5:1 en 7,5:1. Na de ontwikkeling van deze techniek konden onderzoekers op het gebied van HIV V one-biologie verder onderzoeken hoe natural killer-cellen reageren op HIV one-geïnfecteerde cellen bij HIV-geïnfecteerde patiënten.

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

Verschillende 2'-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek...

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

This video demonstrates performing a lactate dehydrogenase release assay to determine the cytotoxicity of natural killer (NK) cells against the target cancer cells. The assay quantifies the release of the cytoplasmic lactate dehydrogenase enzyme from cancer cells by measuring the absorbance of the red-colored product formed.

An In Vitro Assay for Evaluating Natural Killer Cell Cytotoxicity against Cancer Cells

CD4+ regulatorische T-cellen zijn krachtige immuunmodulatoren en hebben belangrijke functies in immuunhomeostase. Het gebrek aan deze cellen in perifeer bloed maakt functionele studies uitdagend, specifiek in de context van HIV-1-infectie. We beschrijven hier een methode om functionele CD4+ Tregs te isoleren en uit te breiden van perifeer bloed van HIV-1-geïnfecteerde individuen.

Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand

We ontwikkelden een in vitro assay om de rol van immuunregulerende trajecten in de regulatie van cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen te onderzoeken.

In vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire Pathways op HIV-specifieke CD4 T-cellen Effectorfunctiemanipulatie Evalueer

Unlike celvrij HIV-1 deeltjes geïnfecteerd CD4 + T-cellen effectief waargenomen door plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs). Dit manuscript beschrijft een werkwijze waarbij perifere mononucleaire cellen (PBMC's) of geïsoleerde pDCs mede gekweekt met HIV-1 geïnfecteerde T-cellen aangeboren sensing evalueren pDCs zoals bepaald door afgifte van type I IFN.

Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultuur systeem.

Het doel van deze studie was om formuleren van technologieën die het mogelijk voor succesvolle gene signaaltransductie in primaire natural killer (NK) cellen maken. De dextran-gemedieerde lentivirale transductie van mens of muis primaire NK cellen leidt tot hogere rendementen van gen expressie. Deze methode van gene transductie zal sterk verbeteren NK cel genetische manipulatie.

Dextran verbetert de efficiëntie van de lentivirale transductie van lymfkliertest en menselijke primaire NK-cellen

Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Een eenvoudige methode voor het verkrijgen van T-cel en NK klonen van CAEBV patiënten werd ontwikkeld met hoog rendement, een kleine hoeveelheid van perifeer bloed en een lage dosis van IL-2.

Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Hier beschrijven we enkele gevestigde methoden om endoplasmatisch reticulum (ER) stress en activering van ongevouwen eiwitrespons (UPR) te bepalen, met bijzondere nadruk op HIV-1-infectie. Dit artikel beschrijft ook een reeks protocollen om het effect van ER-stress/UPR op HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te onderzoeken.

Het meten van endoplasmatisch reticulumstress en ongevouwen eiwitrespons in HIV-1-geïnfecteerde T-cellen en het analyseren van de rol ervan in HIV-1-replicatie

Leer hoe je HIV-1 geïnfecteerde CD4+ T-cellen isoleert voor NK-celcytotoxiciteitstests. Deze methode gebruikt flowcytometrie en chromium-51-release om immuunresponsen te evalueren.

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays (Video) | JoVE Journal

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

Meer video's verkennen