Name: Thermodynamica van membraaneiwit Folding Gemeten door fluorescentiespectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Leer de thermodynamica van membraaneiwitvouwing meten door tryptofaanfluorescentie in kleine LAR-vesikels. Deze methode berekent de Gibbs-vrije energie en onthult eiwitstabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Beijing Wu voor het gebruik van haar gegevens. Dit werk werd ondersteund door een NSF LOOPBAAN award aan Jek

1. De voorbereiding van ~ 50 nm diameter Kleine unilamellaire Blaasjes (SUV's) voor het membraaneiwit Folding <ol><li> Een oplossing van 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC) lipiden in chloroform is gekocht en aliquotted in schone glazen flacons in 20 mg per flacon hoeveelheden voor opslag. Een laag van stikstof gas wordt toegevoegd aan elke flacon om lipide oxidatie te voorkomen, en de flesjes worden afgesloten met caps en parafilm. De flacons worden opgeslagen in een -20 ° C vriezer tot gebruik. </li><li> Een enkele flacon die een hoeveelheid van 20 mg lipiden in chloroform bevat wordt gebruikt voor elk experiment. De inhoud van de flacon worden gedroogd met behulp van een stroom van stikstofgas gedurende 1 uur totdat er geen oplosmiddelen blijft. </li><li> Gedroogde lipiden zijn geresuspendeerd in 1 ml van 20 mM kaliumfosfaatbuffer (pH = 7,3) met behulp van een waterbad ultrasoonapparaat voor ~ 30 seconden. Deze oplossing van de geschorste lipide zal verschijnen bewolkt, en is overgebracht naar een plastic 15-mL buis met een conische bodem. Een ander 1 ml van fosfaat buffer wordt toegevoegd aan de lege glazen flesje, dat oorspronkelijk lipide, en sonicatie wordt herhaald, de oplossing wordt dan toegevoegd aan dezelfde 15-mL buis. Dit proces wordt herhaald in totaal 4 keer tot het uiteindelijke volume in de buis is 4 mL, wat resulteert in een lipide concentratie van 5 mg / ml in dit bestand vesicle oplossing. </li><li> De 4 ml volume van de lipide bolletjes oplossing is geplaatst in een warm (~ 30 ° C) waterbad, en gesoniceerd met behulp van een ultrasonicator microtip gedurende 1 uur bij 50% inschakelduur. Het doel van het waterbad is tweeledig. Ten eerste zorgt het ervoor dat de lipide-oplossing te heet worden vanwege de ultrasoonapparaat proces. Ten tweede, de warm bad zorgt ervoor dat de temperatuur van de waterige oplossing lipide blijft boven de bilaag fase-overgang temperatuur tijdens sonicatie, want DMPC, deze overgang temperatuur is ~ 23 ° C. </li><li> De gesoniceerde oplossing wordt door een 0,22 urn spuitfilter om vuil te verwijderen uit de ultrasoonapparaat tip, en dit gefilterde oplossing is evenwicht 's nachts bij 37 ° C. </li></ol> 2. Monstervoorbereiding voor Initial Fluorescentie Unfolding Curve <ol><li> Een voorraad oplossing van 10 M ureum in 20 mM fosfaatbuffer (pH 7,3) wordt gemaakt. Het is essentieel dat het water worden toegevoegd aan de vaste (en niet vice versa), omdat de grote hoeveelheid ureum neemt een aanzienlijk volume in de oplossing. Dit ureum oplossing kan worden gemaakt door toevoeging van opgeloste stoffen naar een schone, lege fles en het toevoegen van water tot aan de beoogde uiteindelijke volume. Deze oplossing kan verlangen opwarming in een waterbad of op een hete plaat, al roerend aan de opgeloste stof te ontbinden. Ureum is hygroscopisch en daarom de feitelijke concentratie van de ureum-stockoplossing moet worden bepaald met behulp brekingsindex 1. </li><li> Een voorraad bufferoplossing van 20 mM fosfaat (pH 7,3) wordt gemaakt. </li><li> Een voorraad oplossing van ontvouwen eiwitten is voorbereid. Deze voorraad eiwitoplossing moet een concentratie van ~ 200 uM eiwit in 8 M ureum, 20 mM fosfaatbuffer. </li><li> Monsters voor fluorescentie studies worden voorbereid op de volgende manier. Voldoende hoeveelheden op voorraad eiwit (paragraaf 2.3), voorraad lipide-oplossing (5 mg / ml lipide, hoofdstuk 1), voorraad 10 M ureum-oplossing (paragraaf 2.1), en de voorraad fosfaat buffer (paragraaf 2.2) worden gecombineerd om monsters met ~ 4 maken uM eiwit, 1 mg / ml lipide, en 0 tot 8 M ureum in 1 M stappen. Het totale volume van elk monster is 200 pi. Een voorbeeld spreadsheet (tabel 1) is opgenomen dat de lijsten volumes nodig met behulp van een 200 uM voorraad eiwit-oplossing. </li><li> Blanco monsters worden gemaakt zoals beschreven in paragraaf 2.4, is echter eiwit niet toegevoegd. In plaats van eiwit, 4 mei ul van een 8 M ureum-oplossing worden toegevoegd, zodat de concentratie van andere componenten zijn identiek aan die in paragraaf 2.4. Deze blanks worden gebruikt om verstrooiing en andere achtergrond signaal dat verschijnt in de fluorescentie spectra van eiwitten af ​​te trekken. </li><li> Monsters van punten 2.4 en 2.5 mogen bij 37 ° C incuberen gedurende ten minste 2 uur vóór de meting van de fluorescentie spectra te voltooien vouwen en evenwicht te verzekeren. </li></ol> 3. Meting van Fluorescentie Spectra Tryptofaan fluorescentie van elk monster en blanco is gemeten met behulp van een steady-state fluorometer. Fluorescentie spectra te worden geregistreerd met excitatie golflengte van 290 nm tot excitatie van tyrosine residuen te voorkomen, en gescand 305 tot 500 nm. Typische in-en uitgang bandpass is 3 nm. De golflengte verhogen en de integratie tijd kan worden geoptimaliseerd voor signaal-ruisverhouding. Typische waarden voor golflengte verhogen en de integratie tijd 1 nm / stap en 0,5 sec / stap, respectievelijk. Membraaneiwitten algemeen vouwen in synthetische lipiden alleen wanneer de temperatuur boven de bilaag fase-overgang temperatuur. Daarom is in dit geval van DMPC, is de temperatuur van het monster constant gehouden bij 30 ° C. Een microvolume kwartsglas cuvet met 160 pi capaciteit wordt benut in deze exexperimenten. 4. Generatie van Initial uitvouwen Curve en de schatting van Gibbs vrije energie van membraaneiwit Unfolding <ol><li> Fluorescentie spectra in de vorm van een xy dataset worden geladen in software zoals Igor Pro, Matlab, Origin of Excel. </li><li> Signaal van de ureum en lipide bolletjes achtergrond moet worden afgetrokken met behulp van de volgende procedure: Spectrum A = rauwe fluorescentie spectrum van eiwitten in de aanwezigheid van lipide vesicles en de specifieke concentratie van ureum. Spectrum B = rauwe fluorescentie spectrum van de overeenkomstige blanco monster dat lipide blaasjes en dezelfde concentratie ureum bevat als die in spectrum A, geen eiwit is in de blanco monsters. Gecorrigeerde Spectrum Spectrum = A - C * spectrum B. C is een scalaire meestal gelijk aan 1,0. In sommige gevallen, C is minder dan of groter is dan 1,0 als gevolg van verstrooiing zaken die leiden tot over-of onder-aftrekken bij de ~ 305-320 nm. </li><li> De golflengte van de maximale fluorescentie, λ max, is een tabel van de spectra gecorrigeerd voor elke ureum concentratie. Een typische waarde voor volledig ontvouwen membraaneiwit is 350 nm, terwijl die van gevouwen eiwit is ~ 330 nm. Tabel golflengten worden omgezet fractie ontvouwen door het omzetten van het bereik van de λ max-waarden (~ 330 tot ~ 350 nm) om het bereik 0,0 tot 1,0 op de λ maximale waarde correleren met fractie van ontvouwen bevolking. Bijvoorbeeld, een λ max waarde van 330 nm komt overeen met 0,0, 350 nm komt overeen met 1,0 en 340 nm komt overeen met 0,5 in termen van fractie ontvouwde. Deze fractie van ontvouwen eiwitten wordt vervolgens uitgezet tegen de concentratie ureum. Zoals hierboven vermeld, moet de ureumconcentratie experimenteel worden bepaald door het meten van de brekingsindex. </li><li> We nemen aan dat het eiwit kan bestaan ​​in een van de twee staten: gevouwen of ongevouwen. De plot van fractie ontvouwde zich, f, versus ureumconcentratie, C, kan worden geschikt om de vergelijking: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Vergelijking 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Vergelijking 2"> De coëfficiënt m komt overeen met de mate van verandering van de vrije energie met betrekking tot denatureringsmiddel concentratie, en C m komt overeen met het midden ureum concentratie waarbij de gevouwen bevolking is gelijk aan het ontvouwen bevolking. Deze waarden zijn de fitting variabelen verkregen uit kleinste-kwadraten fitting door de data-analyse software. R (0.001987 kcal / mol • K) is het gas constante van de wet, en T is de temperatuur (303 K). </li><li> De coëfficiënten verkregen uit de fit worden gebruikt om de Gibbs vrije energie (kcal / mol) van ontvouwing in de afwezigheid van ureum te bepalen: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Vergelijking 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Vergelijking 3"> . </li></ol> 5. Geoptimaliseerd Unfolding Curve voor meer precieze meting van de Gibbs vrije energie van ontvouwen. <ol><li> Het zich ontvouwende curve hierboven beschreven onthult het bereik van de ureum concentraties dat de grootste verandering in de λ max veroorzaakt. Dit assortiment is meestal klein, en de meerderheid van ontvouwen zich voordoet binnen dit kleine bereik. Om precies de vrije energie van ontvouwen te bepalen, worden bijkomende monsters geanalyseerd in deze regio om een ​​plot dat veel datapunten die noodzakelijk zijn voor optimale kleinste-kwadraten fitting bevat te verkrijgen. Bijvoorbeeld, als het eiwit speelt zich af tussen 2 en 4 M ureum, kunnen monsters worden gemaakt die bevatten 2 - 4 m ureum in 0,2 M stappen om nauwkeuriger te onthullen de vorm van deze belangrijke regio in de zich ontvouwende curve. Het is niet nodig om lege spectra te meten bij elke ureumconcentratie, het is voldoende om een ​​lege spectrum te meten elke ~ 0.5 M stap. </li><li> De vrije energie van ontvouwen verkregen uit deze complot kunnen iets afwijken van die verkregen bij de oorspronkelijke curve ontvouwen, maar weerspiegelt een meer precieze waarde. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: <table border="1"><tbody><tr><td> Monster </td><td> definitief [Ureum], M </td><td> voorraad eiwit (pi) </td><td> voorraad lipide (pi) </td><td> voorraad 10 M ureum (pi) </td><td> voorraad buffer (pi) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0,16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Volume op voorraad oplossingen die nodig zijn om de fluorescentie monsters te maken <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Tryptofaan fluorescentie spectra van ~ 5 uM vertegenwoordiger membraaneiwit dat een tryptofaan residu bevat. (A) Raw fluorescentie spectra van eiwit (spectrum A van 4,2), (B) Raw fluorescentie spectra van blanco (spectrum B van 4,2), (C) gerectificeerd spectrum van 4,2. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Gecorrigeerd tryptofaan fluorescentie spectra van membraaneiwit uit figuur 1 voor tal van ureum concentraties. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Unfolding curve verkregen uit gegevens in figuur 2, met geschikt om vergelijking in 4.4. De Gibbs vrije energie is berekend volgens punt 4.5.

<ol><li>Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShirley%2C+BA+%22Protein+Folding+and+Stability%22">Protein Folding and Stability</a>. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li>
<li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li>
<li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li>
<li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+scene+investigation%3A+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li>
<li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li>
<li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Tryptophan+Microenvironment%2C+Soluble+Domain%2C+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding%3A+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li>
</ol>

Het huidige protocol beschrijft de generatie van ontvouwen curves van membraan-geassocieerde eiwitten en peptiden die tryptofaan residuen bevatten. Hier wordt ervan uitgegaan dat de tryptofaan fluorescentie weerspiegelt de vraag of het eiwit is gevouwen en ingevoegd in synthetisch lipide vesicles, of ongevouwen in oplossing. Aanvullende hypothesen, zoals de twee-staten-vouwen en lineaire afhankelijkheid van de vrije energie met denaturant concentratie, worden gemaakt in het huidige verslag;. Wijziging van deze aannames ...

<table><tbody><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Ureum</td><td>MP Biomedicals</td><td>04821527</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat dibasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285</td><td></td></tr></tbody></table>

thermodynamica van membraaneiwit folding gemeten door fluorescentiespectroscopie

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membraaneiwit vouwen is een opkomende onderwerp met zowel fundamenteel en gezondheid-gerelateerde betekenis. De overvloed van membraaneiwitten in cellen ligt ten grondslag aan de noodzaak van een omvattende studie van de vouwen van deze alomtegenwoordige familie van eiwitten. Daarnaast hebben ontwikkelingen in ons vermogen om ziekten die samenhangen met verkeerd gevouwen eiwitten te karakteriseren gemotiveerd belangrijke experimentele en theoretische inspanningen op het gebied van eiwitten vouwen. Snelle vooruitgang op dit belangrijke gebied is helaas gehinderd door de inherente uitdagingen in verband met membraaneiwitten en de complexiteit van het klapmechanisme. Hier schetsen we een experimentele procedure voor het meten van de thermodynamische eigenschap van de Gibbs vrije energie van ontvouwing in de afwezigheid van denaturerende, Δ G ° H 2 O, voor een representatieve integrale membraaneiwit van E. coli. Dit protocol richt zich op de toepassing van fluorescentie spectroscopie te bepalen evenwicht populaties van in-en uitklapbaar staten als een functie van de denatureringsmiddel concentratie. Experimentele overwegingen voor de bereiding van synthetische lipide vesicles, alsook de belangrijkste stappen in de data-analyse procedure worden gemarkeerd. Deze techniek is veelzijdig en kan worden nagestreefd met verschillende typen denatureringsmiddel, zoals temperatuur en pH, maar ook in diverse omgevingen vouwen van lipiden en micellen. Het huidige protocol is er een die kan worden gegeneraliseerd naar een membraan of oplosbaar eiwit dat de set van criteria die hieronder besproken voldoet.

Deze video artikel beschrijft de experimentele procedure voor het verkrijgen van de Gibbs vrije energie van membraaneiwit vouwen door tryptofaan fluorescentie.

Thermodynamica van membraaneiwit Folding Gemeten door fluorescentiespectroscopie

Membraaneiwitvouwing is een opkomend onderwerp met zowel fundamentele als gezondheidsgerelateerde betekenis. De overvloed aan membraaneiwitten in cellen ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de thermodynamica die gepaard gaat met de vouwing van membraaneiwitten te meten. Dit wordt bereikt door eerst kleine LAR-vesikels te assembleren om een vouwingsomgeving voor het membraaneiwit te bieden. Zodra deze zijn geconstrueerd, worden de vesikels gebruikt om monsters voor te bereiden die eiwit en systematisch variërende concentraties ureum bevatten.Vervolgens wordt het tryptofaan-fluorescentiespectrum van elk monster gemeten. Om de gegevens te verzamelen die nodig zijn voor het genereren van een ontvouwingscurve van membraaneiwitten, worden resultaten verkregen die aantonen hoe de Gibbs vrije energie van de ontvouwing van membraaneiwitten kan worden bepaald op basis van ontvouwingscurves gegenereerd uit tryptofaan-fluorescentiespectra. Hallo, mijn naam is Judy Kim. Ik ben assistent-professor aan de University of California in San Diego.De methode die u gaat zien onthult een belangrijke eigenschap van membraaneiwitten. Specifiek laten we zien hoe u de stabiliteit kunt meten van een eiwit dat gevouwen en ingebed is in een lipide dubbellaag. Mijn naam is Diana Ottinger en ik ben een promovendus bij de afdeling Chemie aan de uc, San Diego.Vandaag demonstreren we deze methode aan de hand van een representatief membraaneiwit. Deze techniek is echter algemeen toepasbaar en kan worden toegepast op andere biologische systemen, zoals membraangeassocieerde peptiden en oplosbare eiwitten. Laten we beginnen.Voorafgaand aan de start van dit protocol wordt een oplossing van één twee DME-olie, SN glycerol, drie fosfocholine of DMPC-lipide in chloroform ingekocht en in schone glazen vials overgebracht. Bij hoeveelheden van 20 milligram per vial wordt aan elke vial een laag stikstofgas toegevoegd om lipidoxidatie te voorkomen, waarna de vials worden afgesloten. Voor elk experiment wordt één enkele vial gebruikt die 20 milligram lipide in chloroform bevat.Om de voorraadoplossing van blaasjes te bereiden, begint u met het drogen van de inhoud van het flesje gedurende één uur onder een stroom nitrogengas, met behulp van een Teflon septum en naalden totdat er geen oplosmiddel meer overblijft. Voeg één milliliter 20 millimolair kaliumfosfaatbuffer, pH 7.3 toe aan de gedroogde lipiden en resuspendeer dit gedurende ongeveer 30 seconden in een waterbad. Breng de resulterende troebele suspensie over naar een plastic 15 milliliter buis met een conische bodempipet.Voeg nog één milliliter fosfaatbuffer toe aan het lege glazen vials waarin oorspronkelijk het lipide zat en herhaal de sonicatie. Voeg de resulterende suspensie toe aan dezelfde buis van 15 milliliter. Herhaal dit proces in totaal vier keer om een eindvolume van vier milliliter en een lipideconcentratie van vijf milligram per milliliter te verkrijgen.Plaats de suspensie van lipidevesikels in een warm waterbad en soniceren met een ultrasone microtip gedurende één uur bij een duty cycle van 50%. Het waterbad dient om te voorkomen dat de lipideoplossing te heet wordt en houdt de temperatuur van de waterige lipideoplossing boven de overgangstemperatuur van de dubbellaagfase tijdens de sonicatie.Filtreer de GEULTRAGALYSEERDE oplossing door een spuitfilter van 0,22 micron om debris van de ator-tip te verwijderen en laat de gefiltreerde oplossing een nacht equilibreren bij 37 °C. Om het monster voor te bereiden op de initiële fluorescentie-ontvouwing, wordt een stamoplossing gemaakt van 10 molar ureum in 20 millimolaire fosfaatbuffer en een stambuffersolution van 20 millimolaire fosfaat. Volgens het schriftelijke protocol moet de ureumconcentratie experimenteel worden bepaald door de brekingsindex met een refractometer te meten en deze te vergelijken met bekende waarden.Bereid vervolgens een voorraadoplossing van ontvouwen eiwit met een concentratie van ongeveer 200 micromolar eiwit in acht molar ureum en 20 millimolar fosfaatbuffer. In deze video wordt het membraaneiwit OPA A gebruikt om het protocol te demonstreren. Monsters voor fluorescentiestudies worden bereid door geschikte volumes van de voorraadoplossing van het eiwit, de voorraadlipide-oplossing, de voorraadoplossing van 10 molar ureum en de voorraadfosfaatbuffer te combineren om monsters te maken die ongeveer vier micromolar eiwit, 1 milligram per milliliter lipide en nul tot acht molar ureum in stappen van één molar bevatten, met een totaalvolume van 200 microliters. Blanco monsters worden op dezelfde wijze bereid.Echter, vier µL van een 8 M ureumoplossing wordt in de plaats van het eiwit gebruikt. Deze blanco's worden gemaakt om verstrooiing en achtergrondsignalen te kunnen aftrekken die optreden in de fluorescentiespectra van het eiwit. Incubeer de eiwitmonsters en de blanco's bij 37 °C gedurende ten minste twee uur vóór de meting van de fluorescentiespectra.Om volledige vouwing te garanderen, dient de fluorimeter een uur vóór de metingen te worden ingeschakeld. Membraaneiwitten vouwen over het algemeen alleen in synthetische lipiden wanneer de temperatuur boven de faseovergangstemperatuur van de dubbellaag ligt. Daarom wordt in het geval van DMPC de temperatuur van de monsterhouder in de fluorimeter ingesteld op 30 °C.Stel het fluorescentie-experiment in op een steady-state fluorimeter en meet de tryptofaanfluorescentie van elk monster ten opzichte van het blanco. De excitatiegolflengte moet worden ingesteld op 290 nanometers om excitatie van tyrosineresiduen te voorkomen, en de emissie moet worden verzameld van 305 tot 500 nanometers. Gebruik een ingangs- en uitgangsbanddoorlaat van drie nanometers.Het golflengte-interval en de integratietijd kunnen worden geoptimaliseerd voor de signaal-ruisverhouding. Typische waarden voor het golflengte-interval en de integratietijd zijn respectievelijk 1 nm per stap en 0,5 seconden per stap. Pipetteer 200 µL van het monster in een microvolume fuse silica Q Vet met een capaciteit van 160 µL en plaats de qve in de qve-houder van het apparaat.Ten slotte kunnen de fluorescentiemetingen beginnen door een XY-datablad van de fluorescentiespectra te laden in software zoals Igor Pro, MATLAB origin of Excel. Voor deze demonstratie wordt Igor Pro gebruikt om de achtergrond van ureum en lipidevesikels te verwijderen, het fluorescentiespectrum van het blanco monster te vermenigvuldigen met de S-scaler en dit af te trekken van het ruwe fluorescentiespectrum van de eiwit-lipide-oplossing. Tabelleer bij de overeenkomstige ureumconcentratie de golflengte van maximale fluorescentie of lambda max uit het gecorrigeerde spectrum.Voor elke ureumconcentratie. Een typische waarde voor een volledig ontvouwen membraaneiwit is 350 nanometer. Terwijl die van een gevouwen eiwit ongeveer 330 nanometer is, vertaalt u de getabelleerde golflengten naar het aandeel ontvouwen eiwit door het bereik van lambda max-waarden om te zetten naar een bereik tussen nul en één, waarbij de lambda max-waarde wordt gecorreleerd aan het aandeel van de ontvouwen populatie.Zet vervolgens de fractie ongevouwen eiwit uit tegen de ureumconcentratie. De grafiek van de fractie ongevouwen F versus de ureumconcentratie C kan worden gefit aan een vergelijking die ervan uitgaat dat het eiwit zich in ofwel de gevouwen of de ongevouwen toestand kan bevinden. De coëfficiënt M komt overeen met de verandering van de vrije energie ten opzichte van de denaturatieconcentratie, en CM komt overeen met de midpoint-ureumconcentratie waarbij de gevouwen populatie gelijk is aan de ongevouwen populatie.R is de gasconstante en T is de temperatuur in Kelvin. De fitprocedure levert waarden op voor de coëfficiënten m en cm.Deze coëfficiënten worden met elkaar vermenigvuldigd om delta G te bepalen, de vrije Gibbs-energie van ontvouwing in afwezigheid van ureum. De beschreven ontvouwingscurve onthult het bereik van ureumconcentraties dat de grootste verandering in de lambda max veroorzaakt. Dit bereik is doorgaans klein en het grootste deel van de ontvouwing vindt binnen dit kleine bereik plaats om de vrije energie van ontvouwing nauwkeurig te kunnen bepalen.Er moeten aanvullende monsters in deze regio worden geanalyseerd om een grafiek te verkrijgen die de vele datapunten bevat die nodig zijn voor een geoptimaliseerde aanpassing via de kleinste-kwadratenmethode. Als het eiwit bijvoorbeeld ontvouwt tussen twee en vier molar urea, kunnen monsters worden gemaakt tussen deze ureaconcentraties in stappen van 0,2 molar om de vorm van deze belangrijke regio in de ontvouwingscurve nauwkeuriger in kaart te brengen. Voor het beste resultaat moet er minstens bij elke stap van 0,5 molar en elke stap van 0,2 molar een blanco worden meegeleverd.De vrije energie van ontvouwing verkregen uit deze grafiek kan enigszins afwijken van die in de oorspronkelijke ontvouwingscurve verkregen waarde, maar weerspiegelt een nauwkeuriger weergegeven waarde. Hier zijn de tryptofaan-fluorescentiespectra van het representatieve membraaneiwit om a dat een enkel tryptofaanresidu bevat. De ruwe fluorescentiespectra van de blanco zijn, zoals beschreven in het protocol, afgetrokken van de ruwe fluorescentiespectra van het eiwit, wat resulteert in het gecorrigeerde spectrum.De gecorrigeerde tryptofaan-fluorescentiespectra van het membraaneiwit bij verschillende ureumconcentraties, verkregen via de beschreven methoden, worden hier weergegeven. In deze demonstratie is een ontvouwingscurve gegenereerd onder de aanname dat het eiwit ofwel gevouwen of ongevouwen is en dat er geen stabiele tussenstaat bestaat. De parameter M weerspiegelt de hoeveelheid polypeptide die bij ontvouwing aan het oplosmiddel wordt blootgesteld, terwijl CM een belangrijke waarde is die de denaturantconcentratie beschrijft die nodig is om een gelijke populatie van gevouwen en ongevouwen eiwitten te bereiken.Grote waarden voor CM en M duiden op een stabiel eiwit. De Gibbs vrije energie van ontvouwing werd berekend op 6,2 kilocalorieën per mol voor OPA a na het volgen van deze procedure. Andere methoden van ontvouwing, zoals hitte, pH en andere chemische denaturatie, kunnen worden gebruikt om analoge informatie te verschaffen over de thermodynamica van eiwitvouwing.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de stabiliteit van een eiwit kan worden gemeten op basis van de verschillende fluorescentie-eigenschappen van de gevouwen en ontvouwen toestanden. Als alternatief kunt u ook een ontvouwingscurve genereren met andere methoden, zoals circulair dichroïsme, zolang de methode informatie verschaft over de eiwitconformatie, ongeacht het analytische instrument dat u kiest. De methode van ontvouwingscurven is veelzijdig en kan worden toegepast op een breed scala aan membraan- en oplosbare eiwitten.

thermodynamics-membrane-protein-folding-measured-fluorescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

This video demonstrates the technique of fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) to study protein homo-oligomerization. Fluorescently-labeled proteins in a sample are dimerized using an agent when studying protein oligomerization using FFS. Using a confocal microscope, as the proteins move in and out of the small observation volume, the analysis of the fluctuations in the brightness of the fluorescent molecules is performed to determine the oligomeric state of the proteins.

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Homo-Oligomerization

Belangrijke stappen van eiwitfunctie, met name conformationele veranderingen in de ruggengraat en protonoverdrachtreacties, vinden vaak plaats op de microseconden tot milliseconden tijdschaal. Deze dynamische processen kunnen worden bestudeerd door middel van tijdopgeloste step-scan Fourier-transform infraroodspectroscopie, met name voor eiwitten waarvan de functie wordt geactiveerd door licht.

Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Differentiële scannen fluorimetrie is een veelgebruikt methode voor het screenen van bibliotheken van kleine moleculen op interacties met eiwitten. Hier presenteren we een eenvoudige methode om deze analyses uit te breiden om een schatting te geven van de dissociatieconstante tussen een klein molecuul en zijn eiwitpartner.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Tijd-opgeloste single-molecule eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering is een nuttige fluorescentiespectroscopische nabijheidssensor die gevoelig is voor lokale structurele veranderingen in eiwitten. Hier laten we zien dat het kan worden gebruikt om stabiele lokale conformaties in α-Synuclein te ontdekken, dat ook wel bekend staat als bolvormig ongestructureerd en onstabiel wanneer het wordt gemeten met behulp van de FRET-liniaal met een groter bereik.

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Het huidige protocol beschrijft een procedure voor het uitvoeren van fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie (FSEC) op membraaneiwitten om hun kwaliteit te beoordelen voor downstream functionele en structurele analyse. Representatieve FSEC-resultaten verzameld voor verschillende G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) onder wasmiddel-opgeloste en detergent-vrije omstandigheden worden gepresenteerd.

Snelle beoordeling van de kwaliteit van membraaneiwitten door fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie

Hier presenteren we het protocol om de lokale flexibiliteit en dynamiek van biomoleculen te bestuderen met behulp van tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie op het niveau van één molecuul in confocale microscopiemodus.

Tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie van afzonderlijke moleculen voor het karakteriseren van lokale flexibiliteit in biomoleculen

Leer de thermodynamica van membraaneiwitvouwing meten door tryptofaanfluorescentie in kleine LAR-vesikels. Deze methode berekent de Gibbs-vrije energie en onthult eiwitstabiliteit.

Thermodynamica van membraaneiwit Folding Gemeten door fluorescentiespectroscopie

Meer video's verkennen