Thermodynamica van membraaneiwit Folding Gemeten door fluorescentiespectroscopie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de thermodynamica die gepaard gaat met de vouwing van membraaneiwitten te meten. Dit wordt bereikt door eerst kleine LAR-vesikels te assembleren om een vouwingsomgeving voor het membraaneiwit te bieden. Zodra deze zijn geconstrueerd, worden de vesikels gebruikt om monsters voor te bereiden die eiwit en systematisch variërende concentraties ureum bevatten.

Vervolgens wordt het tryptofaan-fluorescentiespectrum van elk monster gemeten. Om de gegevens te verzamelen die nodig zijn voor het genereren van een ontvouwingscurve van membraaneiwitten, worden resultaten verkregen die aantonen hoe de Gibbs vrije energie van de ontvouwing van membraaneiwitten kan worden bepaald op basis van ontvouwingscurves gegenereerd uit tryptofaan-fluorescentiespectra. Hallo, mijn naam is Judy Kim. Ik ben assistent-professor aan de University of California in San Diego.

De methode die u gaat zien onthult een belangrijke eigenschap van membraaneiwitten. Specifiek laten we zien hoe u de stabiliteit kunt meten van een eiwit dat gevouwen en ingebed is in een lipide dubbellaag. Mijn naam is Diana Ottinger en ik ben een promovendus bij de afdeling Chemie aan de uc, San Diego.

Vandaag demonstreren we deze methode aan de hand van een representatief membraaneiwit. Deze techniek is echter algemeen toepasbaar en kan worden toegepast op andere biologische systemen, zoals membraangeassocieerde peptiden en oplosbare eiwitten. Laten we beginnen.

Voorafgaand aan de start van dit protocol wordt een oplossing van één twee DME-olie, SN glycerol, drie fosfocholine of DMPC-lipide in chloroform ingekocht en in schone glazen vials overgebracht. Bij hoeveelheden van 20 milligram per vial wordt aan elke vial een laag stikstofgas toegevoegd om lipidoxidatie te voorkomen, waarna de vials worden afgesloten. Voor elk experiment wordt één enkele vial gebruikt die 20 milligram lipide in chloroform bevat.

Om de voorraadoplossing van blaasjes te bereiden, begint u met het drogen van de inhoud van het flesje gedurende één uur onder een stroom nitrogengas, met behulp van een Teflon septum en naalden totdat er geen oplosmiddel meer overblijft. Voeg één milliliter 20 millimolair kaliumfosfaatbuffer, pH 7.3 toe aan de gedroogde lipiden en resuspendeer dit gedurende ongeveer 30 seconden in een waterbad. Breng de resulterende troebele suspensie over naar een plastic 15 milliliter buis met een conische bodempipet.

Voeg nog één milliliter fosfaatbuffer toe aan het lege glazen vials waarin oorspronkelijk het lipide zat en herhaal de sonicatie. Voeg de resulterende suspensie toe aan dezelfde buis van 15 milliliter. Herhaal dit proces in totaal vier keer om een eindvolume van vier milliliter en een lipideconcentratie van vijf milligram per milliliter te verkrijgen.

Plaats de suspensie van lipidevesikels in een warm waterbad en soniceren met een ultrasone microtip gedurende één uur bij een duty cycle van 50%. Het waterbad dient om te voorkomen dat de lipideoplossing te heet wordt en houdt de temperatuur van de waterige lipideoplossing boven de overgangstemperatuur van de dubbellaagfase tijdens de sonicatie.

Filtreer de GEULTRAGALYSEERDE oplossing door een spuitfilter van 0,22 micron om debris van de ator-tip te verwijderen en laat de gefiltreerde oplossing een nacht equilibreren bij 37 °C. Om het monster voor te bereiden op de initiële fluorescentie-ontvouwing, wordt een stamoplossing gemaakt van 10 molar ureum in 20 millimolaire fosfaatbuffer en een stambuffersolution van 20 millimolaire fosfaat. Volgens het schriftelijke protocol moet de ureumconcentratie experimenteel worden bepaald door de brekingsindex met een refractometer te meten en deze te vergelijken met bekende waarden.

Bereid vervolgens een voorraadoplossing van ontvouwen eiwit met een concentratie van ongeveer 200 micromolar eiwit in acht molar ureum en 20 millimolar fosfaatbuffer. In deze video wordt het membraaneiwit OPA A gebruikt om het protocol te demonstreren. Monsters voor fluorescentiestudies worden bereid door geschikte volumes van de voorraadoplossing van het eiwit, de voorraadlipide-oplossing, de voorraadoplossing van 10 molar ureum en de voorraadfosfaatbuffer te combineren om monsters te maken die ongeveer vier micromolar eiwit, 1 milligram per milliliter lipide en nul tot acht molar ureum in stappen van één molar bevatten, met een totaalvolume van 200 microliters. Blanco monsters worden op dezelfde wijze bereid.

Echter, vier µL van een 8 M ureumoplossing wordt in de plaats van het eiwit gebruikt. Deze blanco's worden gemaakt om verstrooiing en achtergrondsignalen te kunnen aftrekken die optreden in de fluorescentiespectra van het eiwit. Incubeer de eiwitmonsters en de blanco's bij 37 °C gedurende ten minste twee uur vóór de meting van de fluorescentiespectra.

Om volledige vouwing te garanderen, dient de fluorimeter een uur vóór de metingen te worden ingeschakeld. Membraaneiwitten vouwen over het algemeen alleen in synthetische lipiden wanneer de temperatuur boven de faseovergangstemperatuur van de dubbellaag ligt. Daarom wordt in het geval van DMPC de temperatuur van de monsterhouder in de fluorimeter ingesteld op 30 °C.

Stel het fluorescentie-experiment in op een steady-state fluorimeter en meet de tryptofaanfluorescentie van elk monster ten opzichte van het blanco. De excitatiegolflengte moet worden ingesteld op 290 nanometers om excitatie van tyrosineresiduen te voorkomen, en de emissie moet worden verzameld van 305 tot 500 nanometers. Gebruik een ingangs- en uitgangsbanddoorlaat van drie nanometers.

Het golflengte-interval en de integratietijd kunnen worden geoptimaliseerd voor de signaal-ruisverhouding. Typische waarden voor het golflengte-interval en de integratietijd zijn respectievelijk 1 nm per stap en 0,5 seconden per stap. Pipetteer 200 µL van het monster in een microvolume fuse silica Q Vet met een capaciteit van 160 µL en plaats de qve in de qve-houder van het apparaat.

Ten slotte kunnen de fluorescentiemetingen beginnen door een XY-datablad van de fluorescentiespectra te laden in software zoals Igor Pro, MATLAB origin of Excel. Voor deze demonstratie wordt Igor Pro gebruikt om de achtergrond van ureum en lipidevesikels te verwijderen, het fluorescentiespectrum van het blanco monster te vermenigvuldigen met de S-scaler en dit af te trekken van het ruwe fluorescentiespectrum van de eiwit-lipide-oplossing. Tabelleer bij de overeenkomstige ureumconcentratie de golflengte van maximale fluorescentie of lambda max uit het gecorrigeerde spectrum.

Voor elke ureumconcentratie. Een typische waarde voor een volledig ontvouwen membraaneiwit is 350 nanometer. Terwijl die van een gevouwen eiwit ongeveer 330 nanometer is, vertaalt u de getabelleerde golflengten naar het aandeel ontvouwen eiwit door het bereik van lambda max-waarden om te zetten naar een bereik tussen nul en één, waarbij de lambda max-waarde wordt gecorreleerd aan het aandeel van de ontvouwen populatie.

Zet vervolgens de fractie ongevouwen eiwit uit tegen de ureumconcentratie. De grafiek van de fractie ongevouwen F versus de ureumconcentratie C kan worden gefit aan een vergelijking die ervan uitgaat dat het eiwit zich in ofwel de gevouwen of de ongevouwen toestand kan bevinden. De coëfficiënt M komt overeen met de verandering van de vrije energie ten opzichte van de denaturatieconcentratie, en CM komt overeen met de midpoint-ureumconcentratie waarbij de gevouwen populatie gelijk is aan de ongevouwen populatie.

R is de gasconstante en T is de temperatuur in Kelvin. De fitprocedure levert waarden op voor de coëfficiënten m en cm.

Deze coëfficiënten worden met elkaar vermenigvuldigd om delta G te bepalen, de vrije Gibbs-energie van ontvouwing in afwezigheid van ureum. De beschreven ontvouwingscurve onthult het bereik van ureumconcentraties dat de grootste verandering in de lambda max veroorzaakt. Dit bereik is doorgaans klein en het grootste deel van de ontvouwing vindt binnen dit kleine bereik plaats om de vrije energie van ontvouwing nauwkeurig te kunnen bepalen.

Er moeten aanvullende monsters in deze regio worden geanalyseerd om een grafiek te verkrijgen die de vele datapunten bevat die nodig zijn voor een geoptimaliseerde aanpassing via de kleinste-kwadratenmethode. Als het eiwit bijvoorbeeld ontvouwt tussen twee en vier molar urea, kunnen monsters worden gemaakt tussen deze ureaconcentraties in stappen van 0,2 molar om de vorm van deze belangrijke regio in de ontvouwingscurve nauwkeuriger in kaart te brengen. Voor het beste resultaat moet er minstens bij elke stap van 0,5 molar en elke stap van 0,2 molar een blanco worden meegeleverd.

De vrije energie van ontvouwing verkregen uit deze grafiek kan enigszins afwijken van die in de oorspronkelijke ontvouwingscurve verkregen waarde, maar weerspiegelt een nauwkeuriger weergegeven waarde. Hier zijn de tryptofaan-fluorescentiespectra van het representatieve membraaneiwit om a dat een enkel tryptofaanresidu bevat. De ruwe fluorescentiespectra van de blanco zijn, zoals beschreven in het protocol, afgetrokken van de ruwe fluorescentiespectra van het eiwit, wat resulteert in het gecorrigeerde spectrum.

De gecorrigeerde tryptofaan-fluorescentiespectra van het membraaneiwit bij verschillende ureumconcentraties, verkregen via de beschreven methoden, worden hier weergegeven. In deze demonstratie is een ontvouwingscurve gegenereerd onder de aanname dat het eiwit ofwel gevouwen of ongevouwen is en dat er geen stabiele tussenstaat bestaat. De parameter M weerspiegelt de hoeveelheid polypeptide die bij ontvouwing aan het oplosmiddel wordt blootgesteld, terwijl CM een belangrijke waarde is die de denaturantconcentratie beschrijft die nodig is om een gelijke populatie van gevouwen en ongevouwen eiwitten te bereiken.

Grote waarden voor CM en M duiden op een stabiel eiwit. De Gibbs vrije energie van ontvouwing werd berekend op 6,2 kilocalorieën per mol voor OPA a na het volgen van deze procedure. Andere methoden van ontvouwing, zoals hitte, pH en andere chemische denaturatie, kunnen worden gebruikt om analoge informatie te verschaffen over de thermodynamica van eiwitvouwing.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de stabiliteit van een eiwit kan worden gemeten op basis van de verschillende fluorescentie-eigenschappen van de gevouwen en ontvouwen toestanden. Als alternatief kunt u ook een ontvouwingscurve genereren met andere methoden, zoals circulair dichroïsme, zolang de methode informatie verschaft over de eiwitconformatie, ongeacht het analytische instrument dat u kiest. De methode van ontvouwingscurven is veelzijdig en kan worden toegepast op een breed scala aan membraan- en oplosbare eiwitten.