Immunocytochemie: menselijke neurale stamcellen
24 augustus 2007
Immunocytochemie is een krachtige methode om de aanwezigheid, subcellulaire lokalisatie, en relatieve rijkdom van een antigeen van belang in gekweekte cellen te bepalen. Dit protocol biedt een makkelijk te volgen serie van stappen die in staat zal stellen een om antistoffen te behouden en het meeste uit je vlekken krijgen.
Hallo, ik ben Steve. Ik werk in het lab van Dr. Flanagan in het Department of Pathology aan UC, Irvine. En vandaag ga ik je laten zien hoe je immunochemie kunt doen van humane neurale precursorcellen.
Dit protocol omvat het plaatsen van cellen op met laminine gecoate dekglasjes en het blokkeren en incuberen van cellen in primaire antilichamen gedurende een nacht, en vervolgens het doen van meerdere wasbeurten en het aanbrengen van secundair antilichaam bij kamertemperatuur. En tenslotte, het monteren van de dekglasjes op microscoopvlakken. Laten we beginnen.
Dus eerst ga ik drie steriele Duitse glazen dekglasjes plaatsen die 12 millimeter breed zijn in een 24-wellsplaat om ze te coaten met laminaat. Dus nu heb ik mijn dekglasjes in de plaat, en eerst ga ik een oplossing van PDL poly-lysine toevoegen, en ik ga de dekglasjes vijf minuten in PDL incuberen bij kamertemperatuur. Dus nu aan het einde van vijf minuten ga ik PDL verwijderen en laminine aanbrengen, en ik ga de dekglasjes minimaal vier uur of beter nog een nacht in laminaat incuberen.
Dus ik heb de plaat een nacht in laminaat geïncubeerd, en nu ga ik de dekglasjes spoelen met PBS en humane neurale precursorcellen plateren die ik al heb geteld. Dus ik heb net de laminaat-oplossingen verwijderd en nu ga ik de dekglasjes met PBS spoelen. Dus nu ga ik PBS verwijderen en de media-oplossing aanbrengen.
En tenslotte ben ik klaar om de cellen te zien. Dus ik ga de cellen zien bij een honderdduizend cellen per milliliter, wat betekent dat voor een 24-wellsplaat ik 50.000 cellen per putje ga toevoegen, omdat elke put een halve milliliter bevat. Dus ik ga de plaat van links naar rechts kantelen om ervoor te zorgen dat de cellen zich gelijkmatig over het oppervlak van het dekglas verspreiden.
En nu ga ik ze in de incubator leggen gedurende ten minste 24 uur om ze te laten bezinken en zich te verspreiden voor immunochemie. Dus de cellen zijn 24 uur aan het groeien en ik heb ze bekeken en ze zijn gehecht en mooi verspreid. Dus nu ga ik ze fixeren met 4% perfor hoogte gedurende vijf minuten.
Maar eerst ga ik het media verwijderen en ik wil niet dat de cellen uitdrogen. Dus ik ga het media verwijderen en tegelijkertijd fixatief toevoegen. Dus het wordt een tweedehandstechniek genoemd.
Dus nu ga ik de cellen gedurende vijf minuten in fixatief incuberen bij kamertemperatuur. Dus het is vijf minuten geweest. Ik ga PFA verwijderen en het in de PFA-afvalcontainer plaatsen en tegelijkertijd PBS toevoegen terwijl ik PFA verwijder, zodat de cellen niet uitdrogen.
Dus ik ga een van deze plastic zuigpijpen gebruiken om PFA op te trekken en ik ga de timer op vijf minuten zetten. Dus terwijl mijn cellen in PBS-was zitten, ga ik een perme visualisatie-oplossing bereiden met Triton X 100. Het is een niet-ionogene detergent en het is erg, erg stroperig.
Dus het is belangrijk om te wachten tot alle oplossing in de pijp komt. Dus ik ga een 0,3%-oplossing in PBS bereiden, ik ga 10 milliliters PBS toevoegen. En aan deze 10 milliliters PBS ga ik 30 microliters tri next 100 toevoegen.
Dus ik ga 30 microliters tri next 100 toevoegen aan 10 milliliters PBS. Dus ik ga ongeveer 10 seconden toevoegen om alle oplossing in de punt te laten komen. Dus ik heb hier mijn perme utilitzatie-oplossing.
Ik zet het op de rotator gedurende 10 minuten, en dan vortex ik het om ervoor te zorgen dat de stroperige tritton volledig is opgelost. Dus nu ben ik klaar om de perme visualisatie-stap te doen. En dus ga ik vijf minuten lang permwise doen bij kamertemperatuur.
Dus het zijn vijf minuten geweest. Ik ga nu drie vijf minuten durende PBS-wasbeurten doen om ervoor te zorgen dat al het triton wordt weggespoeld. Dus nogmaals, ik ga de klok op vijf minuten zetten.
Dus ik heb net al mijn wasbeurten voltooid, dus ik ben klaar om de blokkeringsstap te doen. Dus voor de blokkeringsstap heb ik een 5% BSA-oplossing in PBS bereid. En net als bij alle wasbeurten, ga ik het PBS verwijderen en de blokkeringsoplossing tegelijkertijd toevoegen.
En de blokkeringsstap gaat gedurende een uur bij kamertemperatuur. Dus terwijl mijn cellen in blokkering zijn, ga ik de plaat voorbereiden voor primaire antilichaam-incubatie. Dus ik ga beginnen met deze glazen plaat, en ik ga een stukje parafilm snijden dat ongeveer zo groot is.
En wat ik ga doen, is ik ga het omwikkelen en ik heb wat tape nodig, dus ik heb vier stukken tape nodig. Dus ik ga ze allemaal voorbereiden. Dus ik ga dit stukje parafilm nemen en ik ga het rechttrekken zodat het oppervlak mooi en glad is.
En dan ga ik elk uiteinde nemen en het met tape aan de achterkant van de glazen plaat plakken. Dus nu ga ik dit andere uiteinde trekken om ervoor te zorgen dat de oppervlakken recht zijn, en ik ga het andere uiteinde aan de achterkant plakken. Dus nu heb ik nog een stukje paarfilm nodig met dezelfde grootte als het eerste.
En eigenlijk ga ik hetzelfde doen. Dus ik heb een tweede stukje parafilm bovenop het eerste geplakt, net zoals het eerste, behalve dat ik een uiteinde van het tweede stukje parafilm los heb gelaten omdat ik de antilichaam-oplossing en dekglasjes op het eerste stukje ga plaatsen. En dan ga ik het tweede stukje erop leggen, waardoor het een sandwich wordt.
Maar nu ga ik de plek labelen waar ik de antilichaam-oplossing en het dekglas ga plaatsen. Dus de cellen zijn nu een uur in de blokkeringsoplossing geweest, en ik
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de immunocytochemische methode voor het analyseren van humane neurale precursorcellen. Het biedt een stapsgewijze handleiding om het gebruik van antilichamen en de kleurefficiëntie te optimaliseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Immunocytochemie is essentieel voor het bestuderen van cellulaire componenten.
- Het helpt bij het identificeren van de lokalisatie en abundantie van specifieke antigenen.
- Humane neurale precursorcellen zijn cruciaal voor het begrijpen van de neuro-ontwikkeling.
- Het optimaliseren van kleuringsprotocollen kan de experimentele resultaten verbeteren.
Doel van de studie
- Om de immunocytochemische techniek te demonstreren.
- Om een betrouwbaar protocol voor onderzoekers te bieden.
- Om de efficiëntie van het antilichaamsgebruik bij kleuring te maximaliseren.
Gebruikte methoden
- Celpreparatie op gecoate dekglasjes.
- Blokkeren en incuberen van cellen met primair antilichaam gedurende de nacht.
- Wasstappen om ongebonden antilichamen te verwijderen.
- Toevoegen van secundair antilichaam en monteren voor microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle lokalisatie van antigenen in menselijke neurale precursorcellen.
- Geoptimaliseerd protocol vermindert het verbruik van antilichamen.
- Duidelijke visualisatie van de kleuring onder de microscoop.
- Protocol kan worden aangepast voor diverse celtypen.
Conclusies
- Immunocytochemie is een waardevol instrument in neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het volgen van het protocol kan leiden tot reproduceerbare resultaten.
- Efficiënt gebruik van antilichamen kan de kosten verlagen en studies verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Immunocytochemie van menselijke neurale stamcellen maakt precieze detectie en lokalisatie van eiwitdoelen mogelijk, wat vroege doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie ondersteunt bij geneesmiddelenonderzoek gericht op de neurobiologie. Het antilichaambesparende ontwerp van het protocol verbetert de reproduceerbaarheid en kostenefficiëntie, wat de schaalbare ontwikkeling van assays voor translationeel onderzoek faciliteert. Deze benadering versterkt het voorspellende vertrouwen op kritieke inflection points bij de verdere ontwikkeling van CNS-portfolio's.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om de eiwitexpressie en lokalisatie in ziekterelevante humane neurale stamcellen te onderzoeken.
- Ondersteunt functionele target-validatie door de aanwezigheid en subcellulaire distributie van antigenen te visualiseren.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door middel van reproduceerbare, kwantitatieve resultaten van immunovleiking.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor het verder ontwikkelen van CNS-targets in discovery-pipelines.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde neurale cellsystemen voor voor downstream compound screening-workflows.
- Standaardiseert immunostainingscondities om reproduceerbaarheid en kwantitatieve vergelijkbaarheid te waarborgen.
- Vermindert het antilichaamsverbruik, wat kosteneffectieve ontwikkeling van high-content assays mogelijk maakt.
- Levert robuuste, schaalbare protocollen voor de betrouwbare evaluatie van kandidaatmoleculen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro neurale stamcelmodellen uit met translationele biomarkerstrategieën.
- Handhaaft continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie in CZS-programma's.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door het leveren van hoogwaardige, kwantitatieve beelduitslagen.
- Maakt mechanistische inzichten mogelijk die de selectie van preklinische modellen en de afstemming van biomarkers informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit immunocytochemieprotocol is geïntegreerd van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van R&D-pipelines gericht op het centrale zenuwstelsel.
- Ontdekkingsbiologie: Biedt robuuste hypotheseondersteuning en verduidelijking van signaalpaden in menselijke neurale stamcellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve immunostaining-resultaten voor assay-gereedheid.
- Analytiek: Maakt nauwkeurige meting van antigeenovervloed en lokalisatie mogelijk voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische biomarkerstrategieën in onderzoek naar het centraal zenuwstelsel.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Biedt een schaalbaar, aanpasbaar protocol voor diverse celtypen en doelwitten over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij doelwitvalidatie.
- Operationele waarde: Standardiseert workflows voor immuunkleuring en minimaliseert reagenskosten.
- Strategische waarde: Ondersteunt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt beheer van het CNS-portfolio.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van neurobiologische activa mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celkweek, immunokleuring en fluorescentiemicroscopie.
- Toegang tot weefselkweekfaciliteiten, hoogwaardige antilichamen en imaging-infrastructuur is noodzakelijk.
- Standaardisatie van kleurings- en imagingprotocollen tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan verschillende celtypen, maar optimalisatie kan nodig zijn voor verschillende antigenen of modellen.
- Beperkt door de specificiteit van antilichamen en de imagingresolutie zoals ondersteund door het protocol.
