Een β-glucuronidase (GUS) Op basis Dood van de Cel Assay
6 mei 2011
Geprogrammeerde celdood assays gebruikt in zoogdieren systemen zoals DNA laddering of TUNEL testen, zijn vaak moeilijk te reproduceren in planten. In combinatie met een GUS verslaggever systeem, stellen wij voor een snelle, plant op basis van voorbijgaande test om de mogelijke dood eigenschappen van specifieke genen te analyseren.
Het algemene doel van deze procedure is om een Gus-reportersysteem te gebruiken om de potentiële dodelijke eigenschappen van specifieke genen te analyseren. Genen van belang worden gekloneerd in een Gus-cassette en gekweekt in de juiste agrobacterium-vectoren onder een 35 s-promotor. Deze vectoren worden vervolgens getransformeerd in de Agrobacterium-stam LBA 44 0 4 en gemengd met een cultuur die een Gus-expressiecassette bevat om bladeren van Nick Oceana Hamana te infiltreren.
De Gus-activiteit kan visueel worden beoordeeld via histochemische kleuring, of kwantitatief via een fluorimetrische assay. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals DNA-laddering of de tunnel-assay, die veelvuldig worden gebruikt in zoogdiersystemen maar moeilijk te reproduceren zijn in planten, is dat dit een gevoelige, snelle transient assay voor planten is die gebruikmaakt van het eenvoudige feit dat levende cellen vereist zijn voor de expressie van gas. De procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Hua RAOs.
Infiltratie door een postdoctoraal onderzoeker in ons laboratorium vereist volledig uitgevouwen gezonde bladeren van drie tot zes weken oude Nicotiana hamana planten, gekweekt bij 25 °C. Plan uit om dit protocol over acht dagen uit te voeren. Strijk op dag één glycerolstocks van Agrobacterium tumefaciens uit, die de vectoren voor de celsterfte-assay en de vector met de Gus-expressiecassette bevatten; neem altijd een lege vector op als negatieve controle of vuller wanneer meerdere cultuurcombinaties worden getest.
Incubeer de platen gedurende twee dagen bij 28 °C. Inoculeer op de derde dag twee milliliter selectief LB met een enkele kolonie van elke plaat. Incubeer elke cultuur onder schudomstandigheden bij 28 °C gedurende 24 uur bij 200 RPM totdat de maximale groeidichtheid is bereikt.
Na 24 uur incubatie wordt de cultuur, indien er klontering is opgetreden, volledig geresuspendeerd door middel van pipetteren, en wordt het totale volume van elke cultuur aangevuld tot 10 milliliter met verse selectieve LB om de virulentiegenen van agrobacterium te induceren. Voeg aceton toe tot een concentratie van 25 micromolar en incubeer elke cultuur onder schudcondities bij 28 graden Celsius gedurende nog eens 16 uur. De volgende stap is om elke cultuur te centrifugeren bij 4.000 Gs gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en de pellet te resuspenderen in 10 milliliter infiltratiemedium.
Voeg geen aceton toe en centrifugeer de culturen opnieuw, maar resuspendeer ze nu. Suspendeer elk pellet in vijf milliliter infiltratiemedium met 100 micromolair aceton. Meet nu de OD bij 600 nanometer.
Concentraties tot 0,1 zijn acceptabel, maar als deze hoger zijn dan 0,9, moet er voor de infiltratie worden verdund tot 0,9 met infiltratiemedium en aceton. Incubeer de culturen na de incubatie nogmaals drie uur bij 28 °C onder schudden. Meng de experimentele culturen en controleculturen in een verhouding van één-op-één met de cultuur die de Gus-cassette bevat.
Gebruik voor elke cultuur een naaldloze spuit van één milliliter om de ABA-afdichting of de onderzijde van nieuw uitlopende bladeren te infiltreren. Het infiltratievolume is niet van belang. Wanneer er een waterverzadigd gebied wordt gevormd, is er voldoende toegevoegd; infiltreer vervolgens zowel de negatieve controle als het te testen gen op tegenoverliggende bladeren van dezelfde plant, en infiltreer daarna nog twee planten op dezelfde wijze.
Er zijn dus drie planten in triplo voor elke cultuur. Drie dagen na de infiltratie is het tijd om de bladeren te oogsten en de expressie van het gust-eiwit te analyseren. Begin de histochemische analyse door het gehele blad via vacuüm-infiltratie te verzadigen met xlu-substraat tot het volledig is doordrenkt.
Incubeer de bladeren nu in het donker bij kamertemperatuur gedurende de nacht of totdat er een duidelijke blauwe kleuring zichtbaar is. Spoel de bladeren af met gedestilleerd water en incubeer ze gedurende de nacht in 70% ethanol totdat het chlorofyl is verwijderd. Spoel de bladeren de volgende dag af met gedestilleerd water en beoordeel de GUS-expressieniveaus.
Om de Gus-expressie te kwantificeren, wordt een substraat mug omgezet in een fluorescent product mu, dat gemeten kan worden. Begin met het vermalen van geïnfiltreerde bladschijfjes in een vijzel met vloeibare stikstof. Voeg vervolgens 100 µL GUS-extractiebuffer toe terwijl de monster op ijs wordt bewaard. Centrifugeer de suspensie nu 5 minuten bij 14.000 ×g bij 4 °C en verzamel het supernatant dat de totale oplosbare eiwitten bevat, waaronder Gus.
Meet de totale oplosbare eiwitconcentratie met een NanoDrop en stel de concentratie in op 100 micrograms totaal eiwit per monster in Gus-extractiebuffer. Voeg vervolgens mug-substraat in Gus-extractiebuffer toe aan elk monster tot een eindconcentratie van twee millimolar mug. Een totaalvolume van 100 microliters per monster moet voldoende zijn; meng dit door te pipetteren en laat de reactie een uur incuberen bij 37 degrees Celsius.
Stop na een uur de reactie door 800 µL gusts stopbuffer toe te voegen. Om de GUS-activiteit te kwantificeren, wordt 100 µL van elk monster op een microtiterplaat geladen, die in een platenlezer wordt geanalyseerd; hierbij wordt de fluorescentie gemeten bij een excitatiegolflengte van 365 nm en een emissiegolflengte van 455 nm en vergeleken met een standaardcurve. De GUS-activiteit kan vervolgens worden gerapporteerd als µmol GUS per µg totaal oplosbaar eiwit per minuut reactie. Verschillende GUS-niveaus worden gedetecteerd afhankelijk van het gebruikte construct wanneer de GUS-expressiecassette samen wordt geïnfiltreerd met een negatieve regulator van celdood of een anti-deathgen.
In vergelijking worden hoge Gus-niveaus waargenomen. De Gus-niveaus in de lege vectorcontrole zijn veel lager. Omgekeerd wordt een duidelijke afname van de Gus-expressie waargenomen wanneer een positieve regulator van celdood of een pro-death-gen wordt gebruikt, vergeleken met de lege vectorcontrole.
Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer één week worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat deze techniek wordt gebruikt als een eerste stap om het potentieel van specifieke genen te bepalen. Er is aanvullend werk nodig om deze initiële resultaten te bevestigen en om het type betrokken cel vast te stellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een snelle, op planten gebaseerde transiënte assay die gebruikmaakt van een GUS-reportersysteem om de potentiële celdood-eigenschappen van specifieke genen te analyseren. De methode pakt de uitdagingen aan bij het reproduceren van assays voor geprogrammeerde celdood in zoogdiercellen binnen plantensystemen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Plantenbiologie
- Celdeath-assays
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- Essays voor geprogrammeerde celdood zijn essentieel voor het begrijpen van cellulaire processen.
- Traditionele assays zoals DNA-laddering en TUNEL zijn moeilijk toe te passen in planten.
- GUS-reportersystemen bieden een visuele en kwantitatieve methode voor het beoordelen van genactiviteit.
- Agrobacterium-gemedieerde transformatie is een veelgebruikte techniek in plantengenetische studies.
Doel van de studie
- Om een gevoelige en snelle assay te ontwikkelen voor het analyseren van gen-geïnduceerde celdood in planten.
- Om een GUS-reportersysteem te gebruiken voor visuele en kwantitatieve beoordeling.
- Om de reproduceerbaarheid van assays voor celdood in plantsystemen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Kloneren van genen van interesse in een GUS-cassette.
- Transformeren van Agrobacterium met de GUS-expressiecassette.
- Infiltreren van Nicotiana benthamiana-bladeren met het getransformeerde Agrobacterium.
- Beoordelen van de GUS-activiteit via histochemische kleuring en fluorometrische assays.
Belangrijkste resultaten
- Het GUS-reportersysteem gaf effectief de genactiviteit in plantencellen aan.
- Histochemische kleuring zorgde voor een visuele weergave van de GUS-activiteit.
- Fluorometrische assays maakten kwantitatieve meting van genexpressie mogelijk.
- De methode vertoonde een hogere gevoeligheid in vergelijking met traditionele assays voor zoogdieren.
Conclusies
- De ontwikkelde assay is een waardevolle tool voor het bestuderen van gen-geïnduceerde celdood in planten.
- Deze methode verbetert het vermogen om plantspecifieke genfuncties te analyseren.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere studies naar geninteracties in de plantbiologie omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze op planten gebaseerde GUS-reporterassay biedt een snelle, gevoelige methode voor de initiële screening van genfuncties in celdeath-paden, waarmee een belangrijk hiaat wordt overbrugd in de vertaling van apoptosemechanismen bij zoogdieren naar plantensystemen. Door functionele analyse van pro- en anti-deathregulatoren in een vroeg stadium mogelijk te maken, ondersteunt de assay targetvalidatie en mechanistische risicoreductie binnen de discovery biology. De kwantitatieve en visuele read-outs vergemakkelijken hypothesetesten en de prioritering van genetische targets voordat er middelen worden toegewezen aan downstream preklinische modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door genexpressie te koppelen aan fenotypes van celdood in een systeem dat afhankelijk is van levende cellen.
- Operationele waarde: Biedt een snel, transient expressiesysteem voor functionele screening van genkandidaten zonder stabiele transformatie.
- Predictieve waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via kwantitatieve GUS-activiteitsmetingen die correleren met pro- of anti-apoptotische functies.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, fluorometrische read-outs van GUS-activiteit die dosis-respons- en vergelijkende analyses van genconstructen mogelijk maken.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een gestandaardiseerd Agrobacterium-gemedieerd infiltratieprotocol dat compatibel is met workflows voor high-throughput screening.
- Assay-gereedheid: Levert consistente, reproduceerbare resultaten die geschikt zijn voor het screenen van verbindingen of genetische bibliotheken in plantgebaseerde systemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen geneelfunctieanalyse in de ontdekkingsfase en preklinische validatie door geconserveerde regulatoren van celdood over verschillende koninkrijken heen te identificeren.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt analyse van proteintruncaties mogelijk om effecten van post-translationele modificaties af te leiden, wat inzicht geeft in structuur-functierelaties.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Maakt een vroege beoordeling van de genfunctie in een ziekterellevant systeem mogelijk, waardoor ambiguïteit bij de selectie van targets wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van de vroege ontdekking en ondersteunt targetvalidatie en lead-identificatie door functionele read-outs te leveren die go/no-go-beslissingen informeren voorafgaand aan investeringen in zoogdiermodellen of complexe preklinische modellen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door gen-co-expressie te koppelen aan meetbare veranderingen in GUS-activiteit als proxy voor de modulatie van celdood.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via gecontroleerde co-infiltratie van het gen van interesse en GUS-reporterconstructen, wat reproduceerbare kwantitatieve output ondersteunt.
- Analytics: Levert fluorometrische kwantificering van de GUS-activiteit (MU per µg totaal eiwit per minuut), waardoor een objectieve vergelijking van genetische condities mogelijk is.
- Translationaal onderzoek: Ondersteunt cross-kingdom extrapolatie door zowel planten- (BAG-familie) als zoogdier- (BAX) regulatoren van celdood te analyseren in een gedeeld assay-formaat.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van genetische modifiers van celdood, aanpasbaar aan meerdere doelklassen en modelsystemen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door het aantal fout-positieven te verminderen via reporter-uitlezingen die afhankelijk zijn van levende cellen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via gedefinieerde protocollen voor infiltratie, incubatie en kwantificering.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle triage van gentargets mogelijk te maken voordat men overgaat tot arbeidsintensieve validatie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door vroege functionele gegevens te leveren over gencaandidaat betrokken bij celdoodroutes.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in Agrobacterium-gemedieerde transiënte expressie en de hantering van planteweefsel.
- Is afhankelijk van toegang tot fluorometrische plaatlezers en infrastructuur voor histochemische kleuring voor GUS-detectie.
- Maakt standaardisatie van OD600- en aceton-inductiestappen over culturen heen noodzakelijk voor reproduceerbare activatie van virulentiegenen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding naar plantensystemen anders dan Nicotiana benthamiana of alternatieve reportergenen.
- Beperkt tot initiële functionele screening; vereist orthogonale validatie in zoogdier- of ziekte-relevante systemen voor translationeel vertrouwen.
