Een β-glucuronidase (GUS) Op basis Dood van de Cel Assay
6 mei 2011
Geprogrammeerde celdood assays gebruikt in zoogdieren systemen zoals DNA laddering of TUNEL testen, zijn vaak moeilijk te reproduceren in planten. In combinatie met een GUS verslaggever systeem, stellen wij voor een snelle, plant op basis van voorbijgaande test om de mogelijke dood eigenschappen van specifieke genen te analyseren.
Het algemene doel van deze procedure is om een Gus reportersysteem te gebruiken om de potentiële dode eigenschappen van specifieke genen te analyseren. Genen van belang worden gekloond in een Gus cassette en gekweekt in de juiste Agrobacterium vectoren onder een 35 s promotor. Deze vectoren worden vervolgens getransformeerd in Agrobacterium-stam LBA 44 0 4 en gemengd met een cultuur die een Gus expressie cassette bevat om Nick Oceana Hamana-bladeren te infiltreren.
Gus-activiteit kan visueel worden beoordeeld door histochemische kleuring, of kwantitatief door fluorimetrische mug-assays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals DNA laddering of tunnel assay, die vaak worden gebruikt in zoogdiersystemen, maar moeilijk te reproduceren zijn in planten, is dat dit een gevoelige, snelle, plantaardige, voorbijgaande test is die profiteert van het simpele feit dat levende cellen nodig zijn voor gasexpressie. Het demonstreren van de procedure vandaag zal door Hua RAOs worden gedaan.
Infiltratie vereist een post-doc onderzoeksmedewerker in ons lab Gezonde, volledig ontvouwde bladeren van drie tot zes weken oude nicotiana hamana planten die worden gekweekt bij 25 graden Celsius. Plan om dit protocol gedurende acht dagen uit te voeren. Op dag een, besmeur platen met glycerolstocks van Agrobacterium tumor fassan die de vectoren voor de celdood-assay bevatten en de vector met de Gus expressie cassette. Voeg altijd een lege vector toe als negatieve controle of als vulling wanneer meerdere cultuurcombinaties worden getest.
Incubeer de platen gedurende twee dagen bij 28 graden Celsius. Op de derde dag, inoculeer twee milliliter selectieve LB met een enkele kolonie van elke plaat. Incubeer elke cultuur door te schudden bij 28 graden Celsius gedurende 24 uur bij 200 RPM tot de maximale groei-dichtheid is bereikt.
Na 24 uur incubatie, hersuspendeer de cultuur volledig door te pipetteren als er clumping is, en verhoog het totale volume voor elke cultuur tot 10 milliliter met verse selectieve LB om Agrobacterium virulentiegenen te induceren. Voeg aceton toe tot 25 micromolair en incubeer elke cultuur met schudden bij 28 graden Celsius gedurende nog eens 16 uur. De volgende stap is om elke cultuur te centrifugeren bij 4.000 Gs gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en het pellet op te schorsen in 10 milliliter infiltratiemedium.
Voeg geen aceton toe, centrifugeer de culturen opnieuw, maar schud nu op. Schud elk pellet op in vijf milliliter infiltratiemedium dat 100 micromolair aceton bevat. Meet nu de OD bij 600 nanometer.
Concentraties zo laag als 0,1 zijn acceptabel, maar als ze hoger zijn dan 0,9, verdun ze dan tot 0,9 met infiltratiemedium en aceton voorafgaand aan de infiltratie. Incubeer de culturen nog een keer gedurende drie uur bij 28 graden Celsius met schudden na de incubatie. Meng de experimentele culturen en controleculturen in een een-op-een verhouding met de cultuur die de Gus cassette bevat.
Gebruik voor elke cultuur een naaldloze spuit van één milliliter om de ABA-seal of de onderkant van net uitkomende bladeren te infiltreren. Het infiltratievolume is niet belangrijk. Wanneer een waterige inslikking zich vormt, is er genoeg toegevoegd. Infiltreer zowel de negatieve controle als het te testen gen op tegenoverliggende bladeren op dezelfde plant, en infiltreer vervolgens nog twee planten op dezelfde manier.
Dus er zijn driemaal planten voor elke cultuur. Drie dagen na infiltratie is het tijd om de bladeren te verzamelen en de gust-eiwitexpressie te meten. Begin de histochemische analyse door het hele blad met xlu-substraat vacuüminfiltratie te laten doordrenken totdat het volledig doordrenkt is.
Incubeer nu de bladeren in het donker bij kamertemperatuur overnacht of totdat duidelijke blauwe kleuring verschijnt wanneer blauwe kleuring duidelijk wordt. Spoel de bladeren in gedestilleerd water en incubeer ze in 70% ethanol overnacht totdat hun chlorofyl is verwijderd. De volgende dag, spoel de bladeren af met gedestilleerd water en beoordeel de GUS-expressieniveaus.
Om Gus-expressie te kwantificeren, wordt een substraatmug omgezet in een fluorescerend product mu, dat kan worden gemeten. Begin door geïnfiltreerde bladschijven in een mortel te malen met vloeibare stikstof. Voeg vervolgens 100 microliter GUS-extractiebuffer toe terwijl het monster op ijs wordt gehouden. Centrifugeer nu de suspensie bij 14.000 GS gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant dat de totale oplosbare eiwitten bevat, inclusief Gus.
Meet de totale oplosbare eiwitconcentratie met een NanoDrop en pas de concentratie aan tot 100 microgram totaal eiwit voor elk monster in Gus-extractiebuffer. Voeg nu mug-substraat in Gus-extractiebuffer toe aan elk monster tot een eindconcentratie van twee millimolair mug. Een totaal volume van 100 microliter per monster zou voldoende moeten zijn, vermengd door te pipetteren en incubeer de reactie gedurende een uur bij 37 graden Celsius.
Na een uur, stop de reactie door 800 microliter gusts stopbuffer toe te voegen. Om de mu te kwantificeren, worden 100 microliter van elk monster geladen op een microtiterplaat, die wordt geanalyseerd in een plaatlezer. Fluorescerende excitatie bij 365 nanometer en emissie bij 455 nanometer worden gemeten en vergeleken met een standaardcurve. Gus-activiteit kan vervolgens worden gerapporteerd als M van mu per microgram totaal oplosbaar eiwit per minuut reactie. Verschillende gust-niveaus worden gedetecteerd afhankelijk van de gebruikte construct wanneer de GUS-expressiecassette wordt geco-infiltreerd met een negatieve regulator van celdood of een anti-dood gen.
Hoge gust-niveaus worden waargenomen in vergelijking. Gus-niveaus in de lege vectorcontrole zijn veel lager. Omgekeerd, wanneer een positieve regulator van celdood of een pro-dood gen wordt gebruikt, wordt een duidelijke vermindering van Gus-expressie waargenomen in vergelijking met de lege vectorcontrole.
Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer een week worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat deze techniek wordt gebruikt als een eerste stap om het potentieel van specifieke genen te bepalen. Aanvullen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een snelle, op planten gebaseerde transiënte assay die gebruikmaakt van een GUS-reportersysteem om de potentiële celdood-eigenschappen van specifieke genen te analyseren. De methode pakt de uitdagingen aan bij het reproduceren van assays voor geprogrammeerde celdood in zoogdiercellen binnen plantensystemen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Plantenbiologie
- Celdeath-assays
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- Essays voor geprogrammeerde celdood zijn essentieel voor het begrijpen van cellulaire processen.
- Traditionele assays zoals DNA-laddering en TUNEL zijn moeilijk toe te passen in planten.
- GUS-reportersystemen bieden een visuele en kwantitatieve methode voor het beoordelen van genactiviteit.
- Agrobacterium-gemedieerde transformatie is een veelgebruikte techniek in plantengenetische studies.
Doel van de studie
- Om een gevoelige en snelle assay te ontwikkelen voor het analyseren van gen-geïnduceerde celdood in planten.
- Om een GUS-reportersysteem te gebruiken voor visuele en kwantitatieve beoordeling.
- Om de reproduceerbaarheid van assays voor celdood in plantsystemen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Kloneren van genen van interesse in een GUS-cassette.
- Transformeren van Agrobacterium met de GUS-expressiecassette.
- Infiltreren van Nicotiana benthamiana-bladeren met het getransformeerde Agrobacterium.
- Beoordelen van de GUS-activiteit via histochemische kleuring en fluorometrische assays.
Belangrijkste resultaten
- Het GUS-reportersysteem gaf effectief de genactiviteit in plantencellen aan.
- Histochemische kleuring zorgde voor een visuele weergave van de GUS-activiteit.
- Fluorometrische assays maakten kwantitatieve meting van genexpressie mogelijk.
- De methode vertoonde een hogere gevoeligheid in vergelijking met traditionele assays voor zoogdieren.
Conclusies
- De ontwikkelde assay is een waardevolle tool voor het bestuderen van gen-geïnduceerde celdood in planten.
- Deze methode verbetert het vermogen om plantspecifieke genfuncties te analyseren.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere studies naar geninteracties in de plantbiologie omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze op planten gebaseerde GUS-reporterassay biedt een snelle, gevoelige methode voor de initiële screening van genfuncties in celdeath-paden, waarmee een belangrijk hiaat wordt overbrugd in de vertaling van apoptosemechanismen bij zoogdieren naar plantensystemen. Door functionele analyse van pro- en anti-deathregulatoren in een vroeg stadium mogelijk te maken, ondersteunt de assay targetvalidatie en mechanistische risicoreductie binnen de discovery biology. De kwantitatieve en visuele read-outs vergemakkelijken hypothesetesten en de prioritering van genetische targets voordat er middelen worden toegewezen aan downstream preklinische modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door genexpressie te koppelen aan fenotypes van celdood in een systeem dat afhankelijk is van levende cellen.
- Operationele waarde: Biedt een snel, transient expressiesysteem voor functionele screening van genkandidaten zonder stabiele transformatie.
- Predictieve waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via kwantitatieve GUS-activiteitsmetingen die correleren met pro- of anti-apoptotische functies.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, fluorometrische read-outs van GUS-activiteit die dosis-respons- en vergelijkende analyses van genconstructen mogelijk maken.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een gestandaardiseerd Agrobacterium-gemedieerd infiltratieprotocol dat compatibel is met workflows voor high-throughput screening.
- Assay-gereedheid: Levert consistente, reproduceerbare resultaten die geschikt zijn voor het screenen van verbindingen of genetische bibliotheken in plantgebaseerde systemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen geneelfunctieanalyse in de ontdekkingsfase en preklinische validatie door geconserveerde regulatoren van celdood over verschillende koninkrijken heen te identificeren.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt analyse van proteintruncaties mogelijk om effecten van post-translationele modificaties af te leiden, wat inzicht geeft in structuur-functierelaties.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Maakt een vroege beoordeling van de genfunctie in een ziekterellevant systeem mogelijk, waardoor ambiguïteit bij de selectie van targets wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van de vroege ontdekking en ondersteunt targetvalidatie en lead-identificatie door functionele read-outs te leveren die go/no-go-beslissingen informeren voorafgaand aan investeringen in zoogdiermodellen of complexe preklinische modellen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door gen-co-expressie te koppelen aan meetbare veranderingen in GUS-activiteit als proxy voor de modulatie van celdood.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via gecontroleerde co-infiltratie van het gen van interesse en GUS-reporterconstructen, wat reproduceerbare kwantitatieve output ondersteunt.
- Analytics: Levert fluorometrische kwantificering van de GUS-activiteit (MU per µg totaal eiwit per minuut), waardoor een objectieve vergelijking van genetische condities mogelijk is.
- Translationaal onderzoek: Ondersteunt cross-kingdom extrapolatie door zowel planten- (BAG-familie) als zoogdier- (BAX) regulatoren van celdood te analyseren in een gedeeld assay-formaat.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van genetische modifiers van celdood, aanpasbaar aan meerdere doelklassen en modelsystemen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door het aantal fout-positieven te verminderen via reporter-uitlezingen die afhankelijk zijn van levende cellen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via gedefinieerde protocollen voor infiltratie, incubatie en kwantificering.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle triage van gentargets mogelijk te maken voordat men overgaat tot arbeidsintensieve validatie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door vroege functionele gegevens te leveren over gencaandidaat betrokken bij celdoodroutes.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in Agrobacterium-gemedieerde transiënte expressie en de hantering van planteweefsel.
- Is afhankelijk van toegang tot fluorometrische plaatlezers en infrastructuur voor histochemische kleuring voor GUS-detectie.
- Maakt standaardisatie van OD600- en aceton-inductiestappen over culturen heen noodzakelijk voor reproduceerbare activatie van virulentiegenen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding naar plantensystemen anders dan Nicotiana benthamiana of alternatieve reportergenen.
- Beperkt tot initiële functionele screening; vereist orthogonale validatie in zoogdier- of ziekte-relevante systemen voor translationeel vertrouwen.
