Name: Imaging glycanen in zebravis embryos door metabole Labeling en Bioorthogonal Klik Chemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Leer glycanen labelen in zebravis embryo's via metabole labeling en bioorthogonale klikchemie. Deze methode maakt snelle, niet-invasieve visualisatie van gefucoseerde glycanen tijdens ontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (GM093282 naar PW; 3U54AI057158-06S1 tot RDS) en het opstarten van fondsen van Albert Einstein College of Medicine.

1. Ei Verzamelen en Dechorionation <ol><li> Verzamelen en zebravis eieren tot 35mm petrischaal overdracht, verwijder zoveel mogelijk water en voeg dan 1 mg / ml Pronease E in E3 embryo medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) aan de chorion verteren. </li><li> Na 3-5 minuten, het samenvoegen van de schotel in een bekerglas gevuld met vis water (60 mg "instant Ocean" per liter gedestilleerd H 2 O), en voorzichtig de eieren over te dragen aan de beker en laat de eieren 'vallen' in het water. </li><li> Spoel de eieren met vis water drie keer. De meeste eieren worden vrijgelaten uit hun chorion. </li><li> Met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet de dechorionated eieren agarose-gecoate petrischalen gevuld met E3 embryo medium. </li></ol> 2. Micro-injectie met een BBP-FucAl <ol><li> Bereid de injectie gerechten volgend op de verslagperiode protocol 7. </li><li> Overdracht dechorionated eieren in gerechten injectie gevuld met E3 embryo medium. </li><li> De voorbereiding van de naald, en de belasting met 2 pl oplossing voor injectie. Deze oplossing bevat 20 mM GDP-FucAl chemoenzymatically 8 gesynthetiseerd en ofwel Alexa Fluor 594-dextraan (5% w / v) als een tracer of fenol rood laden kleurstof (0,1% w / v) in 0,2 M KCl. Als een negatieve controle, vervang het BBP-FucAl het BBP-fucose in oplossing voor injectie. </li><li> De naald breken en stel de injectiedruk en duur om een 1 nL druppel 9 opleveren. </li><li> Injecteer de eieren met een nL van een van beide oplossing. </li><li> Breng de eieren in agarose-coated petrischalen gevuld met E3 embryo medium. </li><li> Incubeer de eieren bij 28 ° C en verwijder de onbevruchte eitjes binnen drie tot vier uur na de bevruchting. </li></ol> 3. BTTES-Cu (I)-gekatalyseerde Klik Chemie Reaction <ol><li> Als de embryo's te bereiken gewenste ontwikkelingsstadia (bijv. laat gastrula, weefsel segmentatie en vroege larve), coat de basis van een 96-wells plaat met agarose. </li><li> Voeg 92 uL E3 embryo medium aan elk putje, gevolgd door toevoeging van 4 pi Alexa Fluor-488 azide (van een 2,5 mM voorraad in H 2 O), 2 pi BTTES-CuSO 4 06:01 complex, en schud voorzichtig om te mengen. </li><li> Transfer embryo's in de put met de klik chemie reagens met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet. Elk goed moeten bevatten minder dan vijf embryo's. </li><li> Voeg 2,5 ul vers bereide natriumascorbaat (uit een 100 mM voorraad in H 2 O) om de klik reactie 3 te starten. Uiteindelijke concentratie van elk reagens: Alexa Fluor-488 azide: 100 uM, CuSO 4: 50 pM; BTTES: 300 micrometer, natriumascorbaat: 2,5 mM. </li><li> Na 3 minuten, voeg 2 pl bathocuproine sulfonaat (50 mM voorraad in H 2 O), een biocompatibel koper chelator, om de reactie te blussen dan direct verdunnen met 100 ul E3 embryo medium. </li><li> Overdracht van de embryo's op een glazen petrischaal en was het behandelde embryo's twee keer met 15 ml E3 embryo medium. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Plaats een druppel van Ultra-smeltpunt agarose (1,2% (w / v) in E3 embryo medium) op een MatTek met glazen bodem microwell schaal en leg een embryo in de agarose laten vallen. </li><li> Plaats de embryo's dorsaal of lateraal en plaats de schotel op ijs gedurende 5 minuten naar het agarose laten vallen stollen. Voorzichtig toe te voegen E3 embryo medium om de schotel tot hij dekt de agarose te laten vallen. </li><li> Fluorescentie en helderveld beelden werden achter elkaar met behulp van een confocale microscoop. Alle embryo beelden worden verkregen met behulp van een 5 um stap interval. Composiet cijfers zijn opgesteld volgens ImageJ software. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Figuur 1 toont de workflow van onze twee-staps labeling strategie. Figuur 2 toont de etikettering van de zebravis embryo's via BTTES-gemedieerde CuAAC van 9,5 uur na de bevruchting (HPF). BTTES is een tris (triazolylmethyl) amine gebaseerde ligand. Het versnelt CuAAC dramatisch bij de coördinatie van de in situ gegenereerde Cu (I), en bevordert de cycloadditiereactie snel in levende systemen zonder duidelijke toxiciteit. Onmiddellijk na een 3-min op reactie, we zijn in staat om robuuste etikettering van het BBP-FucAl behandelde embryo's (figuur 2, links panelen) te detecteren. Alleen achtergrond fluorescentie wordt gedetecteerd voor controle embryo's gemicroinjecteerd het BBP-fucose (figuur 2, rechts panelen). <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. De strategie van de etikettering gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van zebravis embryo's. <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. In vivo beeldvorming van gefucosyleerde glycanen tijdens de zebravis embryogenese via BTTES-Cu (I)-gekatalyseerde klik chemie. One-cellig stadium zebravis embryo's zijn gemicroinjecteerd met een enkele dosis van het BBP-FucAl en mag ontop tot 9,5 hpf. De embryo's worden vervolgens reageren met Alexa Fluor 488-azide gekatalyseerd door BTTES-Cu (I). Reageerde embryo's worden afgebeeld met behulp van confocale microscopie. Maximumsterkte z-projectie beelden van Alexa Fluor 488 fluorescentie (bovenste paneel), Bright veld (onderste paneel). Schaal bar: 100 urn. Het oplossen van problemen <table border="1"><tbody><tr><td> Probleem </td><td> Veroorzaken </td><td> Remedie </td></tr><tr><td> De embryo's kijken ongezond </td><td> De gemicroinjecteerd oplossing bevat verontreinigingen </td><td> De zuiverheid van de nucleotide suikers moet groter zijn dan 85%. Controleer uw bron. </td></tr><tr><td> Er is geen etiket na de reactie </td><td> Koper concentratie onder de 30 uM </td><td> Wees voorzichtig dat u de reactie-oplossing te verdunnen door het toevoegen van overtollige embryo's E3 medium bij het toevoegen van de embryo's, zoals de reactiesnelheid daalt aanzienlijk wanneer de koper concentratie onder de 30 uM. </td></tr><tr><td> De embryo's sterven na de reactie </td><td> Onjuiste behandeling van de embryo's </td><td> Zorg ervoor dat de pipet is vuur-gepolijst en het reactievat is bekleed met een zeer dunne laag van 0,5% agarose. </td></tr><tr><td> De beelden zien spotty </td><td> De reagentia zijn niet goed gemengd voor het toevoegen van de embryo's </td><td> Volg de aanbevolen volgorde van toevoeging van de reagentia, en zorg ervoor dat de klik chemie reagentia goed zijn gemengd voor het toevoegen van de embryo's. </td></tr><tr><td> De beelden tonen de embryo's zijn beschadigd </td><td> Krachtig schudden schade de embryo's tijdens de reactie </td><td> Schud voor minder dan 10 seconden nadat de embryo's worden in de oplossing. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol><li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li>
<li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+Covalent+labeling+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Qsar+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li>
<li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+copper%28I%29+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li>
<li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li>
<li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li>
<li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%2C+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Imaging biomoleculen<em&gt; In vivo</em&gt; Biedt kritische inzichten van hun biologische activiteiten in hun eigen omgeving. In deze video laten we zien hoe de etikettering van gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van de zebravis embryo&#39;s is gerealiseerd door microinjecting een-cellig stadium embryo&#39;s met een BBP-FucAl en een tweede voor-stap fluorofoor conjugatie via BTTES-gemedieerde biocompatibel CuAAC<sup&gt; 3</sup&gt;. Robuuste de etikettering kunnen worden bereikt binnen 2-3 minuten, en de ge...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Koper (II) sulfaat pentahydraat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azide </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dextran, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+)-Natrium-L-ascorbaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic zuur </td><td> Acros Organics </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Glazen bodem microwell schaal </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

imaging glycanen in zebravis embryo&#39;s door metabole labeling en bioorthogonal klik chemie

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycanen in vivo is onlangs ingeschakeld met een bioorthogonal chemische verslaggever strategie door het behandelen van cellen of organismen met een azide-of alkyn-tagged monosachariden 1, 2. De gewijzigde monosacchariden, verwerkt door de glycan biosynthetische machines, worden opgenomen in het celoppervlak glycoconjugaten. De bioorthogonal azide of alkyn labels laat vervolgens covalente conjugatie met fluorescerende probes voor visualisatie, of met affiniteit probes voor verrijking en glycoproteomic analyse. Dit protocol beschrijft de procedures doorgaans gebruikt voor niet-invasieve beeldvorming van de gefucosyleerde glycanen in zebravis embryo&#39;s, waaronder: 1) micro-injectie van een-cellig stadium embryo&#39;s met een BBP-5-alkynylfucose (BBP-FucAl), 2) de etikettering gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van zebravis embryo&#39;s met azide-geconjugeerde fluoroforen via biocompatibel Cu (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC), en 3) beeldvorming door confocale microscopie 3. De hier beschreven methode kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere klassen van glycanen, bv. glycanen bevat sialinezuur 4 en N-acetylgalactosamine 5, 6, bij de ontwikkeling van de zebravis en in andere levende organismen te visualiseren.

Een klik-chemie gebaseerde methode die het mogelijk maakt voor de snelle, niet-invasieve, en robuuste etikettering van alkyn-tagged glycanen in zebravis embryo&#39;s wordt beschreven. Gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van de zebravis embryo&#39;s in de late gastrulatie stadium waren afgebeeld in deze studie.

Imaging glycanen in zebravis embryo&#39;s door metabole Labeling en Bioorthogonal Klik Chemie

Het in vivo beelden van glycanen is recent mogelijk gemaakt met behulp van een bio-orthogonale chemische reporterstrategie door cellen of organismen te behandelen met azide- of ...

Recente demonstraties van in vivo imaging van glycanen maken gebruik van een bio-orthogonale chemische reporterstrategie, waarbij cellen of organismen worden behandeld met alkyn- of azide-getagde monosachariden. Gemodificeerde monosachariden die worden verwerkt door de biosynthetische machinerie van glycanen, worden ingebouwd in glycoconjugaten op het celoppervlak als bio-orthogonale alkyn- of azide-tags. Vervolgens wordt covalente conjugatie mogelijk gemaakt met fluorescentie-sondes voor visualisatie of met affiniteitssondes voor verrijking en glycoproteomische analyse.Deze methode op basis van click-chemie maakt een snelle, niet-invasieve en robuuste labeling van alkyn- of azid-detecteerbare glycanen in zebravisembryo's mogelijk en kan eenvoudig worden uitgebreid om andere klassen glycanen in ontwikkelende organismen te visualiseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals lectine- of antilichaamgebaseerde glycaandetectiemethoden, is dat deze kan worden toegepast voor dynamische in vivo imaging. Lectine- en antilichaamgebaseerde imagingmethoden bieden slechts een momentopname van de glycanen op een specifiek tijdstip.Ze zijn moeilijk te implementeren in de context van dynamische studies. Daarnaast vereist het labelen van glycanen met lectines of antilichamen het verwijderen van de betreffende cellen of weefsels uit hun natuurlijke omgeving en het fixeren ervan vóór de analyse. In tegenstelling hiermee overwint het labelen van glycanen met behulp van de bio-orthogonale chemische reporterstrategie deze beperkingen en kan dit direct worden toegepast voor niet-invasieve beeldvorming van glycanen in levende systemen, zoals zebravisembryo's en C. elegans-embryo's.Met behulp van BTT Es-gemedieerde Azi Aine Cyclo-editie, een biocompatibele versie van Qlik-chemie, kan een robuuste labelling binnen één tot vijf minuten worden bereikt. Tijdens het uitvoeren van de procedure zullen de gegevens afkomstig zijn uit mijn laboratorium. Verzamel zebravis-eitjes en breng deze over naar een Petri-schaal van 35 millimeter. Verwijder zoveel mogelijk water en voeg vervolgens 1 mg/mL pronase E in embryo-medium toe om het chorion te verteren. Na drie tot vijf minuten, wanneer er bellenvorming bij het chorion kan optreden, wordt de schaal in een bekerglas gevuld met viswater geplaatst.Breng de eitjes voorzichtig over naar het bekerglas door ze in het water te laten vallen. Spoel de eitjes uitgebreid met viswater, zodat de meeste eitjes uit hun chorion worden vrijgemaakt. Breng de gecoate eitjes vervolgens met een vuurgepolijste pipet over naar agaros-gecoate petrischalen die zijn gevuld met E3-embryomedium. Vul de voorbereide injectieschalen met E3-embryomedium en breng de gecoate eitjes hierin over.Bereid vervolgens de naald voor en vul deze met twee µL injectieoplossing bestaande uit 20 mM GDP Fuk all en ofwel 5% lor, 5 94 dextrine als tracer, of 0,1% fenolrood laadkleurstof in 0,2 M kaliumchloride als negatieve controle. Vervang GDP FUCA door GDP Fuco in de injectieoplossing. Breek nu de naald af en stel de injectiedruk en -duur in tot er een druppel van één nL wordt gevormd.Inject vervolgens de eieren met één nanoliter van de oplossing. Breng de geïnjecteerde eieren tenslotte over naar met agar gecoate petrischalen gevuld met E3-embryomedium en incubeer deze bij 28 °C binnen drie tot vier uur na bevruchting. Verwijder de onbevruchte eieren wanneer de embryo's de gewenste ontwikkelingsstadia hebben bereikt, zoals de late gastrula-weefselsegmentatie en vroege larve.Coat de bodem van een 96-wells plaat met aros. Voeg 92 µL embryo-medium toe aan elke well, gevolgd door de toevoeging van vier µL 4 88 azide uit een 2,5 mM voorraadoplossing in water en twee µL B-T-T-E-S kopersulfaat 6:1 complex met een vuurgepolijste glazen pasteurpipet. Breng minder dan vijf embryo's over naar de well.Voeg, ter voortzetting van de click-chemie-reagentia, 2,5 µL vers bereid 100 mM natriumascorbaat toe. Laat het mengsel drie minuten reageren om de click-reactie te initiëren. Voeg nu 2 µL 50 mM bathocuproïnedisulfonaat toe, een biocompatibele koperchelator, om de reactie te stoppen, en verdun onmiddellijk met 100 µL embryomedium.Breng de embryo's over naar een glazen petrischaal en was de behandelde embryo's twee keer met 15 milliliters embryo.Medium. Plaats een druppel ultra low melting point agar op een matte tech glass bottom micro well dish en breng een embryo over in de agar-druppel. Positioneer het embryo en plaats de schaal gedurende vijf minuten op ijs.Om de agros-druppel te verstevigen, voegt u voorzichtig embryo-medium toe aan de schaal totdat de agros bedekt is. Voeg dit stapsgewijs toe. Neem fluorescentie- en brightfield-beelden op met een confocale microscoop met stappenintervallen van vijf micron en stel samengestelde figuren op.Gebruik van afbeelding. J-B-T-T-E-S is een amine-gebaseerd ligand dat de oxidatie van koper(I) naar koper(II) dramatisch versnelt wanneer het coördineert met het gegenereerde koper(I), en de cycloadditiereactie in levende systemen snel bevordert zonder duidelijke toxiciteit. Hier worden zebravis-embryo's gelabeld via B-T-T-E-S-gemedieerd koper.Een C op 9,5 uur na bevruchting, direct na een clickreactie van drie minuten. Zoals verwacht wordt een robuuste labeling van alle behandelde GDPF-embryo's gedetecteerd. Voor controle-embryo's die zijn gemicro-injecteerd met GDP wordt alleen achtergrondfluorescentie gedetecteerd. Labeling en imaging kunnen op elk moment tussen 2,5 en 96 uur na bevruchting worden uitgevoerd.Deze beelden zijn verkregen op 24 en 48 uur na de bevruchting. Pulse chase. Met deze strategie kan de dynamische biosynthese van gesialyleerde glycanen worden gemonitord, waarbij Alcon fuco die op verschillende tijdstippen zijn geproduceerd, worden gelabeld met fluoroforen van verschillende kleuren.Deze procedure kan worden gecombineerd met genetische mutanten of morph-gebaseerde genetische suppressietechnieken om de specifieke rollen van individuele glycaansynthese-enzymen tijdens de embryogenese van de zebravis te ontleden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de glycosynthese, kan deze ook worden toegepast op andere post-translationele modificaties, zoals acylering en liquidatie.Het kan ook worden toegepast op de studie van nieuw gesynthetiseerde eiwitten.

imaging-glycans-zebrafish-embryos-metabolic-labeling-bioorthogonal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij rapporteren de ontwikkeling van een systeem voor geautomatiseerde beeldvorming en analyse van transgene zebravis embryo's in multiwell platen. Dit toont de mogelijkheid om dosisafhankelijke effecten van een klein molecuul, BCI, meten op fibroblast groeifactor reporter-gen expressie en leveren van technologie voor de oprichting van high-throughput zebravis chemische schermen.

Ontwikkeling van geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de zebravis chemische schermen.

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

This video demonstrates an antibody uptake assay to image Notch/DeltaD signaling in zebrafish radial glia progenitors. It involves mounting agarose-embedded dechorionated zebrafish embryos, injecting a dye solution targeting DeltaD ligands on RGPs, and imaging under a fluorescence microscope for asymmetric cell division confirming Notch/DeltaD signaling activation.

An Antibody Uptake Assay for Imaging Notch/DeltaD Signaling in Zebrafish Radial Glia Progenitors

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Een nieuwe techniek voor de detectie van lage abundantie endogeen receptoren aanwezig in zebravis embryo's wordt beschreven. We hebben het AFLIP genoemd omdat het bestaat uit affiniteitslabeling van de receptor door zijn ligand gekoppeld aan immunoprecipitatie.

Affiniteit Labeling Detectie van endogene receptoren van zebravis embryo&#39;s

Dit werk beschrijft methodes om acute en chronische hyperglycemie modellen in zebravis te bepalen. Het doel is om de invloed van hyperglycemie op fysiologische processen te onderzoeken, zoals constitutieve en schade-geïnduceerde neurogenese. Het werk benadrukt ook het gebruik van zebravis om radioactieve gelabelde moleculen te volgen (hier, [ 18 F] -FDG) met behulp van PET / CT.

Acute en chronische modellen van hyperglycemie bij zebravis: een methode om de impact van hyperglycemie op neurogenese te beoordelen en de biodistributie van radiolabelde moleculen

Hier stellen we een eenvoudig protocol voor dat metabole oligosacharide-engineering, klikchemie en expansiemicroscopie combineert en dat bioimaging van intracellulaire gesialyleerde N-glycoproteïnen met verbeterde resolutie mogelijk maakt met behulp van routinematige microscopieapparatuur.

Visualisatie van intracellulaire sialylering met klikchemie en expansiemicroscopie

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Leer glycanen labelen in zebravis embryo's via metabole labeling en bioorthogonale klikchemie. Deze methode maakt snelle, niet-invasieve visualisatie van gefucoseerde glycanen tijdens ontwikkeling mogelijk.

Imaging glycanen in zebravis embryo's door metabole Labeling en Bioorthogonal Klik Chemie

Meer video's verkennen