Live-Imaging van de Cel Extrusie van de opperhuid van de ontwikkelingslanden zebravis

Onderhoud van epitheelweefsels vereist continue verwijdering van beschadigde en afstervende cellen zonder de barrièrefunctie te verstoren. Om dit te bereiken, extruderen epitheelcellen afstervende cellen door een ring van actine en myosine te vormen en samen te trekken in de cel rond de afstervende cel om deze te verdrijven, terwijl eventuele openingen die zijn ontstaan door de uitgang worden gesloten. In dit videoartikel wordt een methode geïntroduceerd om apoptotische celextrusie uit de epidermis van larvale zebravis in realtime te induceren en te beeldvormen.

Zoals getoond, wordt dit bereikt door injectie van een rood fluorescerend eiwitgelabelde F-actine sonde in eencellig transgenisch zebravis embryo dat groen fluorescerend eiwit in de epidermis tot expressie brengt om actinefilamenten in epitheelweefsels te visualiseren. Dag vier na personalisatie, worden larven die zowel GFP als RFP tot expressie brengen vervolgens behandeld met G vier 18 om apoptose in de epidermis te induceren. Actinedynamiek en veranderingen in epitheelcelvorm die optreden tijdens extrusie worden gevisualiseerd door time-lapse beeldvorming op een spinning disc confocale microscoop.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals immunokracht en analyses, is dat we snelle veranderingen en actinedynamiek kunnen observeren die optreden tijdens het extrusieproces in levend epitheelweefsel. In deze video laten we u een procedure zien voor het beeldvormen van extrusie van apoptotische cellen uit de epidermis van zich ontwikkelende zebravissen in realtime. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te begrijpen hoe cellen hun actine cytoskelet coördineren om apoptotische cellen te verwijderen terwijl de barrièrefunctie wordt gehandhaafd en hoe verstoring van het extrusieproces kan leiden tot bepaalde ziektetoestanden.

Dus laten we beginnen. Om actinedynamiek te visualiseren tijdens celextrusie in de epidermis van zich ontwikkelende zebravissen, beginnen we met het ontdooien van eerder getranscribeerd RNA op ijs. We transcriberen Mr.mRNA dat codeert voor rood fluorescerend eiwit gefuseerd met de calp in homologiedomein van utrofine en actine bindend eiwit. Voeg fenolrood toe aan het RNA in een een-op-een verhouding voor een uiteindelijke RNA-concentratie van ongeveer 30 nanogram per microliter en laad een microliter oplossing in een getrokken capillaire naald door middel van terugvullen.

Verzamel ongeveer 75 1-cellig CK-GFP embryo's in E drie buffer. Pipetteer de verzamelde embryo's in de micro-injectievorm met een vijf en drie kwart pasta pipet en oriënteer de embryo's voorzichtig in de trog met FST Dumont. Nummer vijf, pincetten werk snel om te voorkomen dat je het RNA in multi-stagiair embryo's moet injecteren onder een standaard laboratorium dissecterende stereo microscoop.

Gebruik een drukgestuurde micro-injector om het RNA in de eierdooier van de embryo's te injecteren als fossiel van fenol. Rood zou zichtbaar moeten zijn in het embryo na injectie. Zorg ervoor dat je minimaal 50 embryo's per experiment injecteert.

Sorteer de embryo's om onbevruchte of beschadigde eieren te verwijderen en incubeer alle overgebleven embryo's bij 28 graden Celsius. Na 24 uur gebruik je een fluorescerende dissectiemicroscoop om zebravis embryo's te selecteren die een hoog niveau van GFP-fluorescentie in de epidermis en RFP-gelabelde actinefluorescentie vertonen. Incubeer de geselecteerde embryo's bij 28 graden Celsius totdat je klaar bent om te beginnen met de behandeling met het medicijn om apoptose te induceren door blootstelling aan de aminoglycoside.

Antibioticum G vier 18 of medicijn veroorzaakt extrusie van apoptotische cellen uit de epidermis van zich ontwikkelende zebravislarven. Belangrijk is dat deze behandeling alleen werkt op larven die vier dagen na bevruchting en ouder zijn om celextrusie te induceren. Verzamel maximaal 25 4 dagen na bevruchting zebravislarven die zowel GFP als RFP tot expressie brengen in een 35 bij 10 millimeter kweekschaaltje dat drie milliliter E drie medium bevat.

Vervang voorzichtig het medium door drie milliliter E drie dat een milligram per milliliter G vier 18 bevat en incubeer de larve gedurende vier uur in het donker bij 28 graden Celsius. Verwijder vervolgens het medium en vervang het door voorverwarmd E drie medium dat 0,02% trica bevat en ga door met het monteren van de larven voor beeldvorming. Breng maximaal drie larven over naar een 1,5 milliliter fendor buis en verwijder het grootste deel van het E drie medium.

Gebruik een gesneden pipettip om 120 microliter van 1% low melt agar in de buis te pipetten. Pipetteer vervolgens de larven en agar-mengsel voorzichtig op het dekglas aan de onderkant van een matech kweekschaaltje. Gebruik een FST-penhouder met een inzetpen of wolfraampeentje om snel de larven te oriënteren zodat ze recht en plat tegen het dekglas liggen.

Laat de agar stollen. Vul vervolgens voorzichtig het schaaltje met E drie medium dat 0,02% trica bevat. We hebben ontdekt dat het hele proces van apoptotische celextrusie uit de epidermis van zich ontwikkelende zebravislarven ongeveer 20 minuten duurt.

Hier laten we zien hoe je een time-lapse beeldvormingsexperiment opzet met behulp van een spinning disc confocale microscoop en de and or IQ software om een serie Z-vlakken door een enkele laag van de zebravis epidermis te verzamelen. Eerst start je de argon en helium neon laser microscoopcamera en epi-fluorescentielamp binnen de and or IQ software. Maak een tijdreeksprotocol met de te beelden golflengten.

De frequentie van de intervallen tussen beeldopnames en het aantal keer dat de opname moet worden herhaald. Plaats voorzichtig het matech schaaltje met het specimen op het microscooptafel en gebruik vervolgens een 20 keer objectief met doorgelaten licht om op de larven te focussen. Beweeg het 40 keer water-immersie objectief naar de juiste positie. Met dit objectief kunnen we ongeveer 20 tot 25 cellen per veld filmen, wat ons toelaat om cellulair gedrag tijdens extrusie te volgen, terwijl we ook subcellulair actinedynamiek kunnen oplossen.

Plaats voorzichtig een druppel water op de bovenkant van het 40 keer objectief en plaats snel het matech schaaltje er