Elastomeer PGS Steigers in Arterial Tissue Engineering
8 april 2011
Elastomeer PGS steigers met vasculaire gladde spiercellen gekweekt in een pulsatiele flow bioreactor kan leiden tot veelbelovende kleine diameter arteriële constructen met inheemse ECM productie in een relatief korte periode van cultuur.
Deze video laat zien hoe poreuze buisvormige skeletten worden gemaakt en hoe deze worden onderworpen aan dynamische mechanische conditionering voor arteriële weefsel engineering. Dit wordt bereikt door eerst de skeletten te fabriceren met behulp van een biodegradeerbare elastomere en aanvalsfusie methode. De skeletten worden vervolgens voorbereid voor celzaaien en geassembleerd in een bioreactor systeem.
In de bioreactor zaaien vasculaire gladde spiercellen de skeletten en worden gecultiveerd. Weken later wordt het weefsel geoogst en geanalyseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie, h en e kleuring en elastine autofluorescentie. De resulterende gladde spier is zowel meerlaags als loodrecht georiënteerd.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek, bestaande uit deeltjesbleken, is het gebruik van de glazen mal om het poreuze buisvormige skelet en hyaluronzuur te fabriceren. Als een mal wordt verwijderd, wordt de skeletsjablonenmal gemaakt van een stuk glasbuis. Plaats de buis in een houder en giet hyaluronzuuroplossing, bereid de dag ervoor, in de buis.
Het hyaluronzuur stroomt langzaam langs de binnenwand. Wanneer het de bodem van de mal bereikt, draai de mal om. Herhaal deze stap totdat de binnenwand van de mal gelijkmatig bedekt is met de oplossing.
Na het coaten, droog alle voorbereide glazen mallen in een vacuümoven bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Meestal worden vier mallen tegelijkertijd voorbereid terwijl de glazen mallen drogen. Bereid de zoutdeeltjes voor, maal en SVE-zoutdeeltjes tot 25 tot 32 micrometer.
De volgende dag monteert u de voorbereide glazen mal, PTFE-buis, hitteslinkhuls en PTFE-ring. Laad eerst de mal in 65 millimeter lengte van PTFE-buis en bak ze 5 minuten op 120 graden Celsius. Om de PTFE te krimpen terwijl gewacht wordt, zet een hybridisatie-incubator op 37 graden Celsius gedurende ten minste 30 minuten.
Zodra de buis de mallen heeft omhuld, duwt u de hitteslinkhuls op de mal zodat deze vrij beweegt. Plaats vervolgens de mal in de glazen mal en bevestig de A-P-T-F-E-ring aan de onderkant van de mal. Controleer of de PTFE-ring goed past op de bodem van de glazen mal.
Vervolgens voegt u zoutdeeltjespap toe aan de glazen mal met behulp van een spatel en een siliconenrubberen trechter. Tik vervolgens voorzichtig met de spatel op de mal voor een gelijkmatige verdeling van de deeltjes en schraap het overtollige zout weg. Schakel nu de verwarmde incubator uit en laad hem snel met de met zout gevulde mallen. Het zout zal de komende 30 minuten versmelten, waarna u de mallen in een vacuümoven droogt bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.
De volgende dag, na afkoeling, verwijdert u de roestvrijstalen mal uit de mallen door deze eruit te duwen terwijl u de PTFE-ring vasthoudt. Gebruik eventueel een tang. Vervolgens verwijdert u de PTFE-ring van de onderkant van de mal.
Bak vervolgens de mallen om de huls te krimpen en verwijder de gekrompen hulzen van de mallen. Laat de mallen afkoelen tot ze gebruikt worden en bewaar ze in een droge kast. Gebruik een apotheekdruppelaar om de glazen mallen onder een hoek van 45 graden te plaatsen en druppel PGS-oplossing in hun binnenste lumen terwijl u de mal langzaam draait.
Controleer of de PGS-oplossing langs de wand van de mal stroomt. Als er een droge plek is, voegt u meer PGS toe. Laat nu het THF gedurende ten minste 30 minuten verdampen in de kast. Zodra het THF verdwenen is, stelt u de mallen in een vacuümoven.
Na één dag het drogen, koelt u de mallen af tot kamertemperatuur en dompelt u ze langzaam verticaal in gedeïoniseerd water bij 24 graden Celsius. Te snel kantelen creëert luchtbellen, die het skelet scheuren. Breng de mallen voorzichtig over in het waterbad.
Positioneer ze onder een hoek met behulp van een siliconenbuis en laat de hyaluronzuur zich gedurende een uur oplossen. Als na een uur de hyaluronzuur zich nog niet van de mal heeft losgemaakt, gebruikt u met de mal nog ondergedompeld een spatel om de hyaluronzuur langzaam van beide uiteinden te duwen en schudt u vervolgens langzaam de mal. Controleer nu of de skeletten niet in de glazen mal zijn bewogen en als dat het geval is, trekt u het skelet langzaam met behulp van een pincet om het los te maken van de mal.
Leach vervolgens de zoutdeeltjes door de delicate skeletten voorzichtig over te brengen naar een gedeïoniseerd waterbad met zacht roeren. Dit duurt minimaal drie dagen en vereist dat het water dagelijks wordt ververst. Nadat het zout is uitgeleacht, brengt u elk skelet over naar een 15 milliliter centrifugeerbuis gevuld met gedeïoniseerd water en bevriest u ze een uur lang in een droog-ijskast. Plaats de bevroren centrifugeerbuizen drie dagen in een lyofilisator met open doppen.
Na het vriesdrogen, bewaart u de skeletten in een droge kast totdat ze worden gebruikt. Begin met het snijden van de skeletten in lengtes van 25 tot 30 millimeter. Bereid vervolgens twee siliconenrubberen stoppen voor door PTFE-buis door de middelste gaten van elke stopper te voeren.
Snij vervolgens anderhalve millimeter lengte van een hs-ring en schuif een lengte op één uiteinde van het skelet. Duwt u een PTFE-buis aan de stopper in hetzelfde uiteinde van het skelet met net genoeg overlapping om onder de HS-ring te zijn om het skelet stevig aan de buis te verbinden, krimpt de HS-ring in een oven en laat u de montage afkoelen tot kamertemperatuur. Nu wordt een 50 millimeter polycarbonaatbuis, die als de bioreactorkamer functioneert, over het skelet geschoven en bevestigd aan de binnenoppervlakte van de siliconenrubberen stopper.
Net als eerder worden een PTFE-buis en stopper bevestigd aan het andere uiteinde van het skelet met een hs-ring om de kamer te voltoo
Overzicht
Deze studie toont de fabricage van poreuze buisvormige scaffolds voor arteriële weefselengineering met behulp van biodegradeerbare elastomeren. De scaffolds worden gekweekt met vasculaire gladde spiercellen in een pulsatiele flow bioreactor, wat leidt tot de productie van native extracellulaire matrix in een korte kweekperiode.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Weefselengineering
- Biomaterialen
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Elastomere scaffolds zijn essentieel voor het creëren van arteriële constructies met kleine diameter.
- Dynamische mechanische conditionering verbetert de weefselontwikkeling.
- Vasculaire gladde spiercellen spelen een cruciale rol bij de integratie van scaffolds.
- Native ECM-productie is vitaal voor functionele weefselengineering.
Doel van de studie
- Om poreuze buisvormige scaffolds voor arteriële toepassingen te fabriceren en te conditioneren.
- Om de levensvatbaarheid en functionaliteit van vasculaire gladde spiercellen in geconstrueerde weefsels te beoordelen.
- Om de productie van native ECM in een bioreactoromgeving te evalueren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van scaffolds met behulp van biodegradeerbare elastomeren en zoutdeeltjesuitspoeling.
- Dynamische mechanische conditionering in een pulsatiele flow bioreactor.
- Celzaaien met vasculaire gladde spiercellen.
- Analyse van geoogst weefsel met behulp van rasterelektronenmicroscopie en histologische kleuring.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fabricage van multilaagse en georiënteerde gladde spierweefsels.
- Effectieve integratie van cellen binnen de scaffolds aangetoond.
- Scaffolds geproduceerd met significante native ECM-kenmerken.
- Betrouwbare methode vastgesteld voor het creëren van arteriële constructies met kleine diameter.
Conclusies
- De studie presenteert een veelbelovende aanpak voor arteriële weefselengineering.
- Dynamische conditionering verbetert de weefselontwikkeling aanzienlijk.
- Toekomstige toepassingen kunnen de klinische translatie voor vasculaire grafts omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Elastomeric scaffold technologies address critical limitations in small-diameter arterial graft development by improving compliance and reducing thrombotic risk. This approach supports predictive confidence in preclinical vascular models through enhanced extracellular matrix deposition and cellular alignment under physiological mechanical conditioning. The method enables mechanistic de-risking of arterial tissue constructs prior to lead identification stages in cardiovascular therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular smooth muscle cell responses to elastomeric substrates and dynamic mechanical cues.
- Operational Value: Provides reproducible porous tubular scaffolds with consistent wall thickness for standardized preclinical testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable extracellular matrix outputs including elastin autofluorescence and collagen deposition for assay readiness.
- Operational Value: Supports scalable scaffold fabrication via salt fusion method for multi-well or bioreactor-integrated screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates perfusion-conditioned smooth muscle alignment and multilayered tissue formation relevant to native artery morphology.
- Operational Value: Establishes a bioreactor-compatible workflow for longitudinal assessment of graft maturation and mechanical stability.
Pipeline & Workflow Integration
The scaffold fabrication and conditioning process integrates into early discovery workflows by providing compliant, thromboresistant vascular models for target validation and lead optimization in arterial disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of elastomeric biomaterials on vascular cell phenotype and extracellular matrix production.
- Screening: Enables standardized assessment of scaffold-cell interactions under pulsatile flow conditions for assay reproducibility.
- Analytics: Delivers quantitative readouts including elastin deposition, cell orientation, and scaffold porosity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-stage scaffold maturation to preclinical continuity through native-like tissue development under mechanical conditioning.
- Enterprise Reuse: Positions the salt fusion and bioreactor conditioning method as a reusable platform for multiple vascular tissue engineering initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in graft performance through compliance-matched elastomeric scaffolds and physiological conditioning.
- Operational Value: Standardized, reproducible scaffold fabrication with tunable porosity and thickness for cross-team consistency.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early identification of non-thrombogenic, elastogenic vascular constructs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of arterial graft candidates based on preclinical extracellular matrix maturation and cellular alignment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial synthesis, scaffold fabrication, and bioreactor operation.
- Depends on vacuum ovens, perfusion systems, and histological analysis infrastructure.
- Necessitates standardization of salt particle size, PGS solution concentration, and conditioning duration across laboratories.
- Involves adaptation considerations for different cell types or vessel diameters beyond baboon smooth muscle cells.
- Practical limitations include multi-day salt leaching and lyophilization steps affecting throughput.
