Name: Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Leer nucleïnezuren en eiwitten kwantificeren met de BioSpec-nano spectrofotometer. Deze methode biedt snelle, nauwkeurige metingen met minimale samplevolumes en uitstekende reproduceerbaarheid voor biotechnologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Procedure voor DNA Kwantificering <ol><li> Zet het instrument. </li><li> Open de BioSpec-nano-software vanaf de PC bureaublad. </li><li> Klik op de Simple Nucleic Acid-dsDNA tab (Figuur 1). </li><li> De software zal de communicatie met het instrument en het uitvoeren van een initialisatie. Dit bevestigt dat het instrument presteert volgens de specificaties. </li><li> Selecteer 0,7 of 0,2 mm op de weglengte slider. Hiermee selecteert u de weglengte en alle berekeningen zijn gebaseerd op de geselecteerde weglengte. </li><li> Volgende in BioSpec-nano-software op Setup-Autowiping setup. Selecteer 1 of 2. </li><li> Pipet 2 pi (voor 0,7 mm) H 2 O of buffer op het voetstuk. </li><li> Klik op blanco of F6 voor de blanco meting. Iedere keer dat een nieuwe weglengte is geselecteerd is het noodzakelijk om het opnemen van een blanco. </li><li> Pipetteer 2 pl van het monster op het voetstuk. </li><li> Klik op Start in de software of druk op de startknop op het instrument. Het bovenste venster beweegt om contact te maken met het monster druppel. Xenon flitsers kunnen worden waargenomen. </li><li> Herhaal hetzelfde monster drie keer om de reproduceerbaarheid te bepalen. </li><li> Opgenomen alle gegevens worden opgeslagen als. Bud-bestand. </li><li> Om op te slaan als een. Pdf of. CSV-bestand op te slaan klik op pdf / csv of F9. De resultaten kunnen ook worden opgeslagen als een. Csv-bestand met behulp van de juiste selectie in het tabblad Opslaan. </li></ol> 2. Protocol voor eiwit kwantificatie <ol><li> Kies Eiwit Kwantificering tabblad (figuur 2). </li><li> Voer de extinctiecoëfficiënt e280, indien bekend. </li><li> Als e280 is niet bekend berekenen met behulp van e280Calc. </li><li> Selecteer 0,7 of 0,2 mm op de weglengte slider. </li><li> Klik op Setup-Autowiping setup. Selecteer 2 of hoger. </li><li> Pipetteer 3 pi (voor 0,2 mm) H 2 O of buffer op het voetstuk. </li><li> Klik op blanco of F6 voor de blanco meting. </li><li> Pipetteer 3 pi van eiwitmonster op het voetstuk. </li><li> Klik op Start in de software of druk op de startknop op het instrument. </li><li> Herhaal hetzelfde monster drie keer om de reproduceerbaarheid te bepalen. </li><li> Opgenomen alle gegevens worden opgeslagen als. Bud bestand </li><li> Om op te slaan als een. Pdf of. CSV-bestand op te slaan klik op pdf / csv of F9. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: 1. Resultaten voor DNA Kwantificering Figuur 3 toont de gegevens van metingen op een typische dubbelstrengs DNA monster. De concentratie en OD berekende 260/280 verhouding worden ook getoond. Figuur 4 bevat de reproduceerbaarheid testresultaten voor DNA kwantificering. De gegevens in de figuren 3 en 4 toont de resultaten in hoge mate reproduceerbaar zoals blijkt uit de lage relatieve standaardafwijking van 0,26%. Opmerking 1: Onnauwkeurigheid in DNA kwantificatie kan voortvloeien uit de aanwezigheid van buffer componenten die kunnen absorberen in het UV gebied. Het is ook nodig om een ​​homogeen monster oplossing te gebruiken. Naarmate de hoeveelheid monster gepipetteerd is slechts 1-2 uL, een zorgvuldige pipetteren van nauwkeurige volumes zonder invoering van een bubbels is vereist. 2. Resultaten voor eiwit kwantificatie Figuur 5 geeft eiwitconcentratie analyse voor BSA. De ng / mL eiwitconcentratie is gebaseerd op de e280 waarde. Figuur 6 toont reproduceerbaarheid analyse. Het is duidelijk uit de relatieve standaarddeviatie van 0,51% dat de BioSpec-nano concentratie juist maatregelen - niet alleen voor DNA, maar ook voor eiwitten. Opmerking 2: Factoren die van invloed eiwitconcentratie Nauwkeurige bepaling van de concentratie eiwit is haalbaar als er minimale effecten van instabiliteit veroorzaakt door de pH, buffers, temperatuur, of additieven. De meeste gezuiverde eiwit doorloopt verschillende stappen van de verwerking, vandaar is het mogelijk dat het eiwit kan bevatten oppervlakteactieve stoffen of andere additieven die kunnen interfereren met druppelvorming. Voor deze monsters met behulp van de 5 mm weglengte kwarts cel wordt sterk aanbevolen. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Analyte selectievenster voor dubbelstrengs DNA kwantificering <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Analyte selectie venster voor niet-gelabelde eiwitten kwantificatie <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vertegenwoordiger van gegevens voor DNA kwantificering <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Reproduceerbaarheid van gegevens voor DNA kwantificering <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Vertegenwoordiger van gegevens voor eiwit kwantificatie <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt='"Afbeelding'> Figuur 6. Reproduceerbaarheid van gegevens voor eiwit kwantificatie

<ol><li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAisubel%2C+F+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th edition, WILEY. (1999).</li>
<li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.</li>
</ol>

Suja Sukumaran, PhD is een medewerker van Shimadzu, die maakt het instrument featured in dit artikel.

De BioSpec-nano is ontworpen om de huidige problemen die inherent zijn aan DNA kwantificering methoden, zoals inconsistente resultaten en vervelend handenarbeid op te lossen. Elke meting duurt slechts drie seconden, zodat een ervaren moleculair bioloog aan ongeveer 3-6 meerdere monsters te analyseren in een minuut. Het unieke ruitenwisser-functie verbetert niet alleen de doorvoersnelheid van de meting, maar elimineert ook de noodzaak voor het handmatig reinigen van de voetstukken, wat resulteert in verwaarloosbare overdracht tussen de metingen. Bovendien, tests met slechts twee doekjes voor DNA-monsters die 1000 ng / ul, aangegeven overdracht minder dan 2 ng / ul. De beschikbaarheid van een 5 mm weglengte cel biedt een mogelijkheid om te verdunnen nucleïnezuur en eiwit te analyseren en breidt het gebruik van dit instrument voor andere toepassingen.

<table><tbody><tr><td>BioSpec-nano</td><td>Shimadzu Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalfthymus-DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

concentratie bepaling van nucleïnezuren en eiwitten met behulp van de micro-volume bio-spec nano spectrophotometer

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid kwantificatie procedures aanzienlijk gevorderd in de laatste drie decennia. Meer en meer, moleculair biologen nodig consistente klein-volume analyse van nucleïnezuur monsters voor hun experimenten. De BioSpec-nano biedt een mogelijke oplossing voor de problemen van onjuiste, niet-reproduceerbare resultaten, die inherent zijn aan de huidige DNA kwantificering methoden, via gespecialiseerde optica en een gevoelige PDA detector. De BioSpec-nano heeft ook geautomatiseerde functionaliteit zodanig dat montage-, meet-, en het schoonmaken worden gedaan door het instrument, zodat er geen vervelende, repetitieve, en inconsistente plaatsing van de glasvezel-element en handmatige reiniging. In deze studie worden gegevens gepresenteerd over de kwantificering van DNA en eiwitten, evenals op metingen reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid. Geautomatiseerde monstervoorbereiding contact en een snelle scan kunnen de metingen in drie seconden, wat resulteert in uitstekende doorvoersnelheid. Data-analyse is uitgevoerd met behulp van de ingebouwde functies van de software. De formule voor het berekenen van DNA-concentratie is: Voorbeeld Concentratie = DF · (OD260-OD320) · federatie (1) Waar DF ​​= verdunningsfactor monster en de federatie = nucleïnezuur concentratie factor. Het nucleïnezuur concentratie factor is ingesteld in overeenstemming met de analyt geselecteerde 1. Eiwitconcentratie resultaten kunnen worden uitgedrukt in microgram / ml of in mol / L door het invoeren van e280 en waarden voor het molecuulgewicht respectievelijk. Bij het residu waarden voor Tyr, Trp en Cysteïne (SS obligatie) worden ingevoerd in de e280Calc tabblad, worden de extinctiecoëfficiënt waarden berekend als e280 = 5500 x (Trp residuen) + 1490 x (Tyr residuen) + 125 x (cysteïne SS bond) . De e280 waarde wordt gebruikt door de software voor de concentratie berekening. Naast de concentratie bepaling van nucleïnezuren en eiwitten, kan de BioSpec-nano gebruikt worden als een ultra micro-volume spectrofotometer voor veel andere analyten of als een standaard spectrofotometer met behulp van 5 mm weglengte cellen.

Deze mededeling bevat gegevens over de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de BioSpec-nano UV-VIS spectrofotometer voor dsDNA en eiwit kwantificatie. Zelfs met ultra-kleine volumes (1 tot 2 L), reproduceerbaarheid is uitstekend, terwijl de automatische vegen functie verbetert de doorvoer en resulteert in een minimale overdracht voor betere resultaten.

Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Procedures voor de kwantificering van nucleïnezuren zijn in de afgelopen drie decennia aanzienlijk gevorderd. Moleculair biologen hebben in toenemende mate behoefte aan consistente ...

Het algemene doel van deze procedure is om de concentraties van nucleïnezuren en eiwitten nauwkeurig en reproduceerbaar te bepalen met behulp van een microvolumenspectrofotometer. Dit wordt bereikt door eerst de juiste weglengte voor het te meten monster te selecteren. De tweede stap van de procedure is het meten van een blanco.Vervolgens wordt het DNA- of eiwitmonster gemeten. De laatste stap van de procedure is het opslaan van de gegevens in PDF- of CSV-formaat. Dit leidt uiteindelijk tot zeer reproduceerbare resultaten voor DNA en eiwit.Kwantificering kan met deze methode snel en nauwkeurig worden verkregen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze snel, precies en reproduceerbaar is. Om de procedure voor DNA-kwantificering te starten, schakelt u de BIOS spec nano spectrophotometer in.Open de BIOS spec nano-software vanaf het bureaublad van de pc. Klik op het tabblad simple nucleic acid D-S-D-N-A. De software zal een verbinding met het instrument tot stand brengen en een initialisatiesequentie uitvoeren.Hiermee wordt geverifieerd dat het instrument volgens de specificaties functioneert. Selecteer vervolgens de weglengte via de schuifregelaar voor de weglengte.Er zijn drie opties beschikbaar voor monsters met een microliter-volume. Er kan gebruik worden gemaakt van 0,2 millimeter of 0,7 millimeter. Voor verdunde monsters is er bovendien de optie om een cuvet met een optische weglengte van vijf millimeter te gebruiken.In deze demonstratie wordt 0,7 millimeters geselecteerd voor het meten van een monster van twee µL. Alle berekeningen zijn gebaseerd op de geselecteerde padlengte. Klik vervolgens in de software op het tabblad setup en selecteer auto wiping setup.Selecteer er één voor één veegbeurt. Voorafgaand aan de monstermeting, of telkens wanneer een nieuwe weglengte wordt gekozen, is een nulmeting vereist. Pipetteer bij een weglengte van 0,7 millimeter twee µL water of buffer op het voetstuk. Klik op blank voor de nulmeting.Het bovenste venster beweegt om contact te maken met de monsterdruppel, waarna xenonflitsen waarneembaar zijn. Wanneer de meting is voltooid, zal de ruitenwisser het monster automatisch verwijderen. Het monster kan nu worden gemeten.Het is belangrijk om een homogene monsteroplossing te gebruiken, aangezien de aanwezigheid van onopgeloste partikels zal leiden tot irreproduceerbare gegevens. Om het ontstaan van luchtbellen te voorkomen, worden twee microliter van het monster zorgvuldig opgezogen, waarna het monster gelijkmatig vanuit de pipetpunt op het voetstuk wordt gepipetteerd.Druk op de startknop van het instrument. Zoals eerder gebeurt, zal het bovenste venster bewegen om contact te maken met de monsterdruppel; xenonflitsen kunnen worden waargenomen. Om de reproduceerbaarheid te bepalen, dient de meting van hetzelfde monster drie keer te worden herhaald. Alle geregistreerde gegevens worden automatisch opgeslagen als een BUD-bestand. Om op te slaan als een PDF- of CSV-bestand, klikt u op save P-D-F-C-S-V.Resultaten kunnen ook worden opgeslagen als een CSV-bestand door de juiste selectie in het tabblad 'opslaan' te gebruiken. Proteïnekwantificering kan worden uitgevoerd met de absorptie 280-methode. Selecteer voor proteïnekwantificering het tabblad 'proteïnekwantificering'.Voer de extinctiecoëfficiënt epsilon 280 in indien bekend; als epsilon 280 niet bekend is, bereken deze dan met epsilon 280 calc. Selecteer 0,2 millimeter op de schuifregelaar voor de padlengte om een monster van 3 µL te meten. Klik vervolgens in de software op het tabblad setup en selecteer auto wiping setup. Selecteer twee voor twee veegbeurten om contaminatie tussen monsters te voorkomen en een nauwkeurige meting te garanderen.Om een blanco pipetteerhoeveelheid van drie microliters water of buffer op het voetstuk te meten, klikt u op blank voor de blanco-meting. Pipetteer vervolgens voorzichtig drie microliters eiwitmonster op het voetstuk. Klik in de software op start of druk op de startknop van het instrument om de meting van het monster te starten, zonder luchtbellen te introduceren.Herhaal de meting van hetzelfde monster drie keer om de getoonde reproduceerbaarheid te bepalen. Hier zijn gegevens van metingen aan een typisch dubbelstrengs DNA-monster. De formule die wordt gebruikt voor het berekenen van de DNA-concentratie is: monsterconcentratie is gelijk aan DF vermenigvuldigd met de hoeveelheid OD 260 minus OD 320 vermenigvuldigd met NACF, waarbij DF gelijk is aan de verdunningsfactor van het monster en NACF gelijk is aan de nucleïnezuurconcentratiefactor.De concentratiefactor voor nucleïnezuren wordt ingesteld op basis van de geselecteerde analyt. De berekende nucleïnezuurconcentratie en de OD 260/280-ratio worden weergegeven. Deze tabel bevat de resultaten van de reproduceerbaarheidstests voor DNA-kwantificering.Samen tonen de gegevens resultaten die zeer reproduceerbaar zijn, zoals blijkt uit de lage relatieve standaarddeviatie van 0,26%. Representatieve resultaten van een proteïneconcentratieanalyse voor BSA worden hier getoond. De proteïneconcentratie in microgram per milliliter is gebaseerd op de Epsilon twee 80-waarde. Ten slotte toont deze tabel een reproduceerbaarheidsanalyse van de proteïnekwantificering.De relatieve standaardafwijking van 0,51% geeft aan dat de BIOS spec nano de od nauwkeurig meet, niet alleen voor DNA, maar ook voor eiwitten. Zodra de methode onder de knie is, kunnen meerdere monsters in één minuut worden geanalyseerd.

concentration-determination-nucleic-acids-proteins-using-micro-volume

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microvolume monsters worden gekwantificeerd door een spectrofotometer systeem dat natuurlijke oppervlaktespanning gebruikt om monsters te behouden zonder het gebruik van cuvetten of haarvaten. Het dynamisch bereik van eiwitconcentraties en de snelheid waarmee ze kunnen worden gemeten zijn sterk verhoogd met deze methode.

Microvolume Eiwitconcentratie Bepaling met behulp van de NanoDrop 2000C Spectrophotometer

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Demonstratie van kwantificering van dsDNA met behulp van Molecular Probes PicoGreen kleurstof en Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrofotometer uitgerust met een microplaat reader accessoire.

Kwantificering van dsDNA het gebruik van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrophotometer en PicoGreen Dye

Het gebruik van NanoDrop microvolume systemen als praktische en efficiënte alternatieven voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode wordt beschreven door de demonstratie van twee microvolume nucleïnezuur kwantificatie protocollen.

NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren

Een protocol voor de nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en high-throughput flowcytometrie om polymere genafgifte nanodeeltjes evalueren beschreven. NTA wordt gebruikt om de nanodeeltjes deeltjesgrootteverdeling en het plasmide per deeltjesverdeling karakteriseren. High-throughput flowcytometrie in staat stelt kwantitatieve transfectie efficiëntie evaluatie voor een bibliotheek van gen delivery biomaterialen.

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Een reeks colorimetrische testen beschreven voor het snel onderscheiden eiwitten, RNA, DNA, en opnieuw in ducing suikers mogelijk heterogene biomoleculaire monsters.

Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters

Nanodeeltje-gebaseerde optische sondes zijn ontworpen als een voertuig voor het detecteren van antigenen met behulp van Raman en UV-Vis spectroscopie. Hier beschrijven we een protocol voor het voorbereiden van dergelijke sondes voor een UV-Vis/Raman spectroscopie immunoassay op een manier die toekomstige multiplexing mogelijkheden kan integreren.

Het vervaardigen van een UV-Vis en Raman spectroscopie Immunoassay Platform

Semiflexible polymeren weer unieke mechanische eigenschappen die uitgebreid door levende systemen worden toegepast. Systematische studies over biopolymeren zijn echter beperkt omdat eigenschappen zoals polymeer rigiditeit niet toegankelijk zijn. Dit manuscript wordt beschreven hoe is deze beperking omzeild door programmeerbare DNA nanobuisjes, waardoor experimentele studies over de gevolgen van de stijfheid van de gloeidraad.

DNA Nanotubes als een veelzijdig instrument om te studeren van Semiflexible polymeren

Het hier beschreven protocol heeft tot doel de hydrodynamische diameter van bolvormige nanodeeltjes, meer bepaald gouden nanodeeltjes, in waterige media te meten door middel van Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Dit laatste omvat het volgen van de beweging van deeltjes als gevolg van Browniaanse beweging en het implementeren van de Stokes-Einstein-vergelijking om de hydrodynamische diameter te verkrijgen.

Nanodeeltjes tracking analyse van gouden nanodeeltjes in waterige media door middel van een interlaboratorium vergelijking

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Leer nucleïnezuren en eiwitten kwantificeren met de BioSpec-nano spectrofotometer. Deze methode biedt snelle, nauwkeurige metingen met minimale samplevolumes en uitstekende reproduceerbaarheid voor biotechnologisch onderzoek.

Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Meer video's verkennen