Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer
February 17th, 2011
Deze mededeling bevat gegevens over de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de BioSpec-nano UV-VIS spectrofotometer voor dsDNA en eiwit kwantificatie. Zelfs met ultra-kleine volumes (1 tot 2 L), reproduceerbaarheid is uitstekend, terwijl de automatische vegen functie verbetert de doorvoer en resulteert in een minimale overdracht voor betere resultaten.
Het algemene doel van deze procedure is om de concentraties van nucleïnezuren en eiwitten nauwkeurig en reproduceerbaar te bepalen met behulp van een microvolumespectrofotometer. Dit wordt bereikt door eerst de juiste padlengte te selecteren voor het te meten monster. De tweede stap van de procedure is het meten van een blanco.
Vervolgens wordt het DNA- of eiwitmonster gemeten. De laatste stap van de procedure is het opslaan van de gegevens in PDF- of CSV-formaat. Uiteindelijk zeer reproduceerbare resultaten voor DNA en eiwit.
Kwantificering kan snel en nauwkeurig worden verkregen met deze methode. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel, nauwkeurig en reproduceerbaar is. Om de procedure voor DNA-kwantificering te starten, zet u de BIOS spec nano-spectrofotometer aan.
Open de BIOS spec nano-software vanaf het bureaublad van de pc. Klik op het tabblad voor eenvoudig nucleïnezuur D-S-D-N-A. De software zal communicatie met het instrument tot stand brengen en een initialisatiesequentie uitvoeren.
Dit verifieert dat het instrument volgens specificaties presteert. Selecteer vervolgens de padlengte. Op de padlengte-schuifregelaar.
Er zijn drie opties beschikbaar voor microlitervolumemonsters. 0,2 millimeter of 0,7 millimeter kan worden gebruikt. En voor verdunde monsters is er een optie om een padlengte van vijf millimeter te gebruiken.
In deze demonstratie wordt 0,7 millimeter geselecteerd voor het meten van een monster van twee microliter. Alle berekeningen zijn gebaseerd op de geselecteerde padlengte. Klik vervolgens in de software op het tabblad instellingen en selecteer automatische afveeginstellingen.
Selecteer één voor één afvegen. Voorafgaand aan de monstermeting, of elke keer dat een nieuwe padlengte wordt geselecteerd, is een blanco meting vereist. Voor een padlengte van 0,7 millimeter pipet twee microliters water of buffer op de voet. Klik op blanco voor een blanco meting.
Het bovenste venster zal bewegen om contact te maken met de monstersteek en kan xenon-flashes worden waargenomen. Wanneer de meting is voltooid, veegt de wisser het monster automatisch weg. Nu kan het monster worden gemeten.
Het is belangrijk om een homogene monsteroplossing te gebruiken, aangezien de aanwezigheid van onopgeloste deeltjes. Monsterstuk zal resulteren in onreproduceerbare gegevens. Om luchtbellen te voorkomen, zuigt u voorzichtig twee microliter van het monster aan en pipet vervolgens het monster gelijkmatig vanuit de pipettentip op de voet.
Druk op de startknop op het instrument. Net als eerder zal het bovenste venster bewegen om contact te maken met de monstersteek en kunnen xenon-flashes worden waargenomen om de reproduceerbaarheid te bepalen. Herhaal de meting van hetzelfde monster drie keer, alle geregistreerde gegevens worden automatisch opgeslagen als een BUD-bestand. Om op te slaan als een PDF- of CCSV-bestand, klikt u op Opslaan P-D-F-C-S-V.
Resultaten kunnen ook worden opgeslagen als een CSV-bestand door de juiste selectie in het tabblad Opslaan te gebruiken. Eiwitkwantificering kan worden gedaan met behulp van de absorptie twee 80-methode. Voor eiwitkwantificering, selecteert u het tabblad eiwitkwantificering.
Voer de extinctiecoëfficiënt epsilon twee 80 in als bekend, als Epsilon twee 80 niet bekend is, bereken deze met behulp van Epsilon twee 80 calc. Selecteer 0,2 millimeter op de padlengte-schuifregelaar om een monster van drie microliter te meten. Klik vervolgens in de software op het tabblad instellingen en selecteer automatische afveeginstellingen. Selecteer twee voor twee veeg om eventuele monstersoortdrager te voorkomen en om een nauwkeurige lezing te garanderen.
Om een blanco te meten, pipet drie microliter water of buffer op de voet, klik op blanco voor een blanco meting. Pipet vervolgens voorzichtig drie microliter eiwitmonster op de voet. Zonder enige luchtbellen te introduceren om te beginnen met het meten van het monster, klikt u op Start in de software of drukt u op de startknop op het instrument.
Herhaal de meting van hetzelfde monster drie keer om de reproduceerbaarheid te bepalen. Hier zijn gegevens van metingen op een typisch dubbelstrengs DNA-monster. De formule die wordt gebruikt voor het berekenen van de DNA-concentratie is monsterconcentratie gelijk aan DF keer de hoeveelheid OD twee 60 minus OD drie 20 keer NACF, waarbij DF gelijk is aan monsterverdunningsfactor en NACF gelijk is aan nucleïnezuurconcentratiefactor.
De nucleïnezuurconcentratiefactor wordt ingesteld in overeenstemming met de geselecteerde analyt. De berekende nucleïnezuurconcentratie en OD 2 62 80-verhouding worden aangegeven. Deze tabel bevat de resultaten van de reproduceerbaarheidstest voor DNA-kwantificering.
Samen tonen de gegevens resultaten die zeer reproduceerbaar zijn, zoals blijkt uit de lage relatieve standaardafwijking van 0,26%. Hier zijn representatieve resultaten van een eiwitconcentratieanalyse voor BSA weergegeven. De microgram per milliliter eiwitconcentratie is gebaseerd op de Epsilon twee 80-waarde. Ten slotte toont deze tabel een reproduceerbaarheidsanalyse van de eiwitkwantificering.
De relatieve standaardafwijking van 0,51% geeft aan dat de BIOS spec nano metingen nauwkeurig meet, niet alleen voor DNA, maar ook voor eiwitten. Eenmaal onder de knie, kunnen meerdere monsters in één minuut worden geanalyseerd.
Overzicht
Deze studie evalueert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de BioSpec-nano UV-VIS spectrofotometer voor het kwantificeren van dsDNA en eiwitten. De methode toont uitstekende reproduceerbaarheid, zelfs met ultrakleine monstervolumes, waardoor de doorvoer wordt verbeterd met minimale overdracht.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Analytische Chemie
- Biotechnologie
Achtergrond
- Accurate kwantificering van nucleïnezuren en eiwitten is cruciaal in biologisch onderzoek.
- Micro volume spectrofotometrie maakt analyse mogelijk met minimale monstervereisten.
- Automatische functies kunnen de efficiëntie en nauwkeurigheid van metingen verbeteren.
- Reproduceerbaarheid is essentieel voor betrouwbare experimentele resultaten.
Doel van de studie
- Om de prestaties van de BioSpec-nano spectrofotometer te beoordelen voor kwantificering van nucleïnezuren en eiwitten.
- Om een protocol op te stellen voor nauwkeurige metingen met kleine monstervolumes.
- Om de betrouwbaarheid van resultaten aan te tonen door herhaalde metingen.
Gebruikte methoden
- Selectie van een geschikte padlengte voor monstermeting.
- Blanco-meting voorafgaand aan monsteranalyse.
- Automatisch afvegen om overdracht tussen monsters te voorkomen.
- Gegevensopslag in PDF- of CSV-formaten voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Uiterst reproduceerbare resultaten voor DNA-kwantificering met een relatieve standaardafwijking van 0,26%.
- Eiwitkwantificering vertoonde ook hoge nauwkeurigheid met een relatieve standaardafwijking van 0,51%.
- Snelle en nauwkeurige metingen kunnen worden bereikt met de BioSpec-nano.
- Meerdere monsters kunnen snel worden geanalyseerd, waardoor de doorvoer wordt verbeterd.
Conclusies
- De BioSpec-nano spectrofotometer biedt betrouwbare kwantificering voor zowel dsDNA als eiwitten.
- Automatische functies verbeteren de metingsefficiëntie aanzienlijk.
- Deze methode is geschikt voor hoogwaardige toepassingen in biologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate and reproducible quantification of nucleic acids and proteins is essential for target validation and assay development in early drug discovery. The BioSpec-nano micro-volume spectrophotometer enables high-throughput, low-sample-consumption measurements with automated sample handling, reducing variability and improving data reliability for lead identification workflows. Its rapid measurement cycle and low relative standard deviation support predictive confidence in downstream screening and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise quantification of nucleic acid and protein samples to support target expression analysis and pathway interrogation.
- Operational Value: Reduces sample consumption and manual handling steps, increasing throughput for hypothesis testing in discovery biology.
- Predictive Value: Low relative standard deviation (0.26% for DNA, 0.51% for protein) enhances confidence in quantitative data used for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides reproducible absorbance measurements (OD260-OD320 for DNA, OD280 for protein) suitable for assay standardization and reagent qualification.
- Operational Value: Automated wiping and blanking minimize carryover and ensure measurement consistency across plates or batches.
- Scalability: Three-second measurement time enables rapid screening of sample libraries or fractionation outputs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker quantification and pharmacokinetic sample analysis where low-volume, high-precision detection is required.
- Mechanistic De-risking: Accurate protein concentration data (via ε280 calculation from Trp, Tyr, Cys-S-S residues) enables correct dosing in functional assays.
- Workflow Integration: Outputs in PDF/CSV format facilitate data tracking and cross-functional sharing between discovery and preclinical teams.
Pipeline & Workflow Integration
The BioSpec-nano fits within the discovery continuum from initial target validation through assay development and into preclinical sample analysis, particularly where sample conservation and measurement reproducibility are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven quantification of nucleic acids (e.g., gene expression constructs) and proteins (e.g., purified targets, antibodies) for target validation.
- Screening: Enables QC of sample inputs and reaction outputs in biochemical or cell-based assays with minimal volume requirements.
- Analytics: Delivers quantitative OD-based readouts with automated pathlength correction and extinction coefficient calculation for proteins.
- Translational Research: Compatible with low-volume preclinical samples (e.g., plasma, tissue lysates) requiring accurate concentration normalization.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared core lab resource for standardized quantitation across multiple projects and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves data quality and reproducibility in nucleic acid and protein quantitation, reducing false negatives/positives in early screening.
- Operational Value: Automation of sample contact, measurement, and cleaning reduces user variability and increases lab efficiency.
- Strategic Value: Enables faster iteration in lead optimization by providing reliable quantification for structure-activity relationship (SAR) studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted resource allocation by delivering trustworthy quantitative data for target prioritization.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with spectrophotometer principles and pathlength selection based on sample concentration.
- Needs access to a PC with BioSpec-nano software and periodic maintenance of optical surfaces.
- Benefits from standardized SOPs for blanking, wiping, and sample application to ensure cross-user consistency.
- Adaptable to various sample types (DNA, protein, other analytes) via software configuration and pathlength adjustment.
- Limited to absorbance-based quantification; not suitable for fluorescent or luminescent assays without additional instrumentation.
