Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Het algemene doel van deze procedure is om de concentraties van nucleïnezuren en eiwitten nauwkeurig en reproduceerbaar te bepalen met behulp van een microvolumenspectrofotometer. Dit wordt bereikt door eerst de juiste weglengte voor het te meten monster te selecteren. De tweede stap van de procedure is het meten van een blanco.

Vervolgens wordt het DNA- of eiwitmonster gemeten. De laatste stap van de procedure is het opslaan van de gegevens in PDF- of CSV-formaat. Dit leidt uiteindelijk tot zeer reproduceerbare resultaten voor DNA en eiwit.

Kwantificering kan met deze methode snel en nauwkeurig worden verkregen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze snel, precies en reproduceerbaar is. Om de procedure voor DNA-kwantificering te starten, schakelt u de BIOS spec nano spectrophotometer in.

Open de BIOS spec nano-software vanaf het bureaublad van de pc. Klik op het tabblad simple nucleic acid D-S-D-N-A. De software zal een verbinding met het instrument tot stand brengen en een initialisatiesequentie uitvoeren.

Hiermee wordt geverifieerd dat het instrument volgens de specificaties functioneert. Selecteer vervolgens de weglengte via de schuifregelaar voor de weglengte.

Er zijn drie opties beschikbaar voor monsters met een microliter-volume. Er kan gebruik worden gemaakt van 0,2 millimeter of 0,7 millimeter. Voor verdunde monsters is er bovendien de optie om een cuvet met een optische weglengte van vijf millimeter te gebruiken.

In deze demonstratie wordt 0,7 millimeters geselecteerd voor het meten van een monster van twee µL. Alle berekeningen zijn gebaseerd op de geselecteerde padlengte. Klik vervolgens in de software op het tabblad setup en selecteer auto wiping setup.

Selecteer er één voor één veegbeurt. Voorafgaand aan de monstermeting, of telkens wanneer een nieuwe weglengte wordt gekozen, is een nulmeting vereist. Pipetteer bij een weglengte van 0,7 millimeter twee µL water of buffer op het voetstuk. Klik op blank voor de nulmeting.

Het bovenste venster beweegt om contact te maken met de monsterdruppel, waarna xenonflitsen waarneembaar zijn. Wanneer de meting is voltooid, zal de ruitenwisser het monster automatisch verwijderen. Het monster kan nu worden gemeten.

Het is belangrijk om een homogene monsteroplossing te gebruiken, aangezien de aanwezigheid van onopgeloste partikels zal leiden tot irreproduceerbare gegevens. Om het ontstaan van luchtbellen te voorkomen, worden twee microliter van het monster zorgvuldig opgezogen, waarna het monster gelijkmatig vanuit de pipetpunt op het voetstuk wordt gepipetteerd.

Druk op de startknop van het instrument. Zoals eerder gebeurt, zal het bovenste venster bewegen om contact te maken met de monsterdruppel; xenonflitsen kunnen worden waargenomen. Om de reproduceerbaarheid te bepalen, dient de meting van hetzelfde monster drie keer te worden herhaald. Alle geregistreerde gegevens worden automatisch opgeslagen als een BUD-bestand. Om op te slaan als een PDF- of CSV-bestand, klikt u op save P-D-F-C-S-V.

Resultaten kunnen ook worden opgeslagen als een CSV-bestand door de juiste selectie in het tabblad 'opslaan' te gebruiken. Proteïnekwantificering kan worden uitgevoerd met de absorptie 280-methode. Selecteer voor proteïnekwantificering het tabblad 'proteïnekwantificering'.

Voer de extinctiecoëfficiënt epsilon 280 in indien bekend; als epsilon 280 niet bekend is, bereken deze dan met epsilon 280 calc. Selecteer 0,2 millimeter op de schuifregelaar voor de padlengte om een monster van 3 µL te meten. Klik vervolgens in de software op het tabblad setup en selecteer auto wiping setup. Selecteer twee voor twee veegbeurten om contaminatie tussen monsters te voorkomen en een nauwkeurige meting te garanderen.

Om een blanco pipetteerhoeveelheid van drie microliters water of buffer op het voetstuk te meten, klikt u op blank voor de blanco-meting. Pipetteer vervolgens voorzichtig drie microliters eiwitmonster op het voetstuk. Klik in de software op start of druk op de startknop van het instrument om de meting van het monster te starten, zonder luchtbellen te introduceren.

Herhaal de meting van hetzelfde monster drie keer om de getoonde reproduceerbaarheid te bepalen. Hier zijn gegevens van metingen aan een typisch dubbelstrengs DNA-monster. De formule die wordt gebruikt voor het berekenen van de DNA-concentratie is: monsterconcentratie is gelijk aan DF vermenigvuldigd met de hoeveelheid OD 260 minus OD 320 vermenigvuldigd met NACF, waarbij DF gelijk is aan de verdunningsfactor van het monster en NACF gelijk is aan de nucleïnezuurconcentratiefactor.

De concentratiefactor voor nucleïnezuren wordt ingesteld op basis van de geselecteerde analyt. De berekende nucleïnezuurconcentratie en de OD 260/280-ratio worden weergegeven. Deze tabel bevat de resultaten van de reproduceerbaarheidstests voor DNA-kwantificering.

Samen tonen de gegevens resultaten die zeer reproduceerbaar zijn, zoals blijkt uit de lage relatieve standaarddeviatie van 0,26%. Representatieve resultaten van een proteïneconcentratieanalyse voor BSA worden hier getoond. De proteïneconcentratie in microgram per milliliter is gebaseerd op de Epsilon twee 80-waarde. Ten slotte toont deze tabel een reproduceerbaarheidsanalyse van de proteïnekwantificering.

De relatieve standaardafwijking van 0,51% geeft aan dat de BIOS spec nano de od nauwkeurig meet, niet alleen voor DNA, maar ook voor eiwitten. Zodra de methode onder de knie is, kunnen meerdere monsters in één minuut worden geanalyseerd.