Name: Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Leer hoe eiwitlokalisatie verandert bij groeifactorsignalering in Xenopus embryonale ectodermcellen. Deze methode maakt visualisatie van subcellulaire signaaleiwitten in vivo mogelijk voor onderzoek naar celbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek in het Sokol laboratorium is gesponsord door de Nationale instituten of Health.

1. In Vitro Fertilisatie van Xenopus Eieren <ol><li> Verkrijgen eitjes van vrouwelijke kikkers, dat met humaan choriongonadotrofine (400 unit / kikker) 12 uur ingespoten voor het experiment. </li><li> Leg de eieren in een kleine hoeveelheid (0,5-1 ml) van een gemodificeerde Ringer-oplossing x Marc's (MMR) 10 om de eieren te bevruchten en ze in vitro met een klein stukje ontleed testis. Na 2-3 minuten, voeg dan 0,1 x MMR het hele oppervlak van de eieren te dekken. In 20 minuten wordt ei gelei coat verwijderd met 3% cysteine ​​- HCL (pH 8 met natrium hydroxide). Eieren zijn gewassen met 0,1 x BMR drie keer en liet in een koude incubator (13 ° C) voor injecties. </li><li> Bevruchte eieren mogen ontwikkelen tot 2-4 cellig stadium. Voor injecties, worden de embryo's overgebracht naar de oplossing van 3% Ficoll, 0,5 x MMR. </li></ol> 2. RNA micro-injectie <ol><li> RNA's worden gesynthetiseerd uit gelineariseerde DNA-templates met behulp van mMessage mMachine kit (Ambion) en verdund met RNase-vrij water op de beurs concentratie van 0,1-1 ug / ul. Optimale doses van RNA's voor injecties worden bepaald in pilot experimenten. RNA's voor Diversin-RFP, het membraan marker GFP-CAAX en Frizzled 8 worden gebruikt bij 0,1 tot 1 ng per injectie. </li><li> Injectienaalden worden bereid met een naald trekker van een capillair en vervolgens met een naald molen. Voor de injectie wordt elke naald gekalibreerd met water tot 10 nl van de vloeistof per injectie uit te werpen. </li><li> Voor injecties, worden embryo's geplaatst op een plastic schaaltje in een grote druppel van 3% Ficoll, 0,5 x MMR. Een microliter van RNA-oplossing is meegezogen in een injectienaald met Narishige microinjector. 10 nl van RNA wordt geïnjecteerd in dier blastomeren van 8 cellige embryo 2-3 keer. De geïnjecteerde embryo's worden omgezet in een goed van de 12-well plaat. </li></ol> 3. Voorbereiden ectodermale Explantaten <ol><li> Wanneer de geïnjecteerde embryo's vroeg gastrulastadium te bereiken, worden ze overgebracht naar 0,6 x MMR-oplossing in een 3 cm plastic schaal bedekt met 1% agarose. Vitelline membraan wordt handmatig verwijderd met een pincet. Ectodermale explantaten zijn uitgesneden uit de embryo's met behulp van een naald en een Tungsten hairloop. </li><li> Ectodermale explantaten worden overgebracht in een glazen flacon en gefixeerd met 3,7% formaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 30 minuten. Vaste explantaten zijn gewassen met PBS drie keer (10 minuten). DAPI is opgenomen in de derde maal naar kernen vlek. </li><li> Explantaten zijn gemonteerd op een dia glas. Twee stroken plakband zijn aan de dia en de explantaten worden geplaatst tussen de twee stroken. Sinds de buitenkant van explantaten is gepigmenteerd, moet de binnenzijde van de explantaten het gezicht van de microscoop doelstelling. Voeg twee tot drie 20 pl druppels van de montage-oplossing (70% glycerol in PBS met 25 mg / ml DABCO, anti-fading reagens) 11. Leg een dekglaasje op de top. </li></ol> 4. Beeldvorming van Explantaten Onder een fluorescentiemicroscoop <ol><li> Monsters worden bekeken onder Zeiss Axioplan fluorescentie microscoop met passende filters. </li><li> Beelden worden genomen met de apotome gehechtheid aan een bepaald vliegtuig uit verschillende onafhankelijke explantaten te visualiseren. </li></ol> 5. Cryosectioning Cryosectioning is een alternatieve manier om de verdeling van fluorescerende eiwitten in de cel en meer van toepassing voor immunokleuring visualiseren. In fase 10, zijn embryo's die voor 1-2 uur met een fixatief Dent's (20% DMSO, 80% methanol), gewassen met PBS, en ingebed in 15% vis gelatin/15% sucrose-oplossing 11. Het embedded embryo's worden snel ingevroren op droog ijs en vriescoupes worden gegenereerd op Leica Cryostaat. Doorsneden zou omvatten ectodermale cellen die ingespoten RNA's en hun vertaalde eiwitproducten erven. De secties behouden fluorescentie en kan worden immunostained met specifieke antilichamen en vervolgens gemerkt met secundaire antilichamen geconjugeerd met fluorescentie. Kernen zijn gekleurd met DAPI. De montage media zijn dezelfde als hierboven beschreven. Beeldvorming kan worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. 6. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2700/2700fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Frizzled receptor rekruten Diversin aan het celmembraan. Ectoderm cellen die Frizzled 8 (Xfz8) en Div-RFP RNA's onthullen Div-RFP op het celmembraan, in plaats van het centrosoom (zoals blijkt uit g-tubuline co-kleuring). De regeling van het experiment is aan de top, een typische doorsnede wordt getoond.

<ol><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+induction+---+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Developmental+Genetics%22">Principles of Developmental Genetics</a>. Moody, S. A. , Academic Press. (2007).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling%3A+multiple+pathways%2C+multiple+receptors%2C+and+multiple+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li>
<li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt%2FJNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li>
<li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li>
<li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li>
<li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li>
<li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li>
</ol>

We hebben de boven-protocol om de subcellulaire lokalisatie van Diversin karakteriseren. In dierproeven pole explantaten, was Diversin-RFP naast de kern ontdekt en colocalized met g-tubuline, een centrosomal marker, in vriescoupes (figuur 1). Zodra de subcellulaire lokalisatie van een eiwit is geïdentificeerd, kan verwijdering constructen gegenereerd worden om vast te stellen welk eiwit-domeinen zijn noodzakelijk en voldoende voor de subcellulaire lokalisatie. Met behulp van deze aanpak zijn de centrosomal lokalisatie d...

gepolariseerde translocatie van fluorescerende eiwitten in xenopus ectoderm in reactie op wnt signalering

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Celpolariteit is een fundamentele eigenschap van eukaryote cellen die dynamisch wordt door zowel intrinsieke en extrinsieke factoren gereguleerd tijdens de embryonale ontwikkeling 1, 2. Een van de signaalwegen betrokken bij deze verordening is de Wnt-route, die vele malen wordt gebruikt tijdens embryogenese en van cruciaal belang voor de mens de ziekte van 3, 4, 5. Meerdere moleculaire componenten van deze route coördinerend regelen signalering in een ruimtelijk-beperkte wijze, maar de onderliggende mechanismen zijn nog niet volledig begrepen. Xenopus embryo epitheliale cellen is een uitstekend systeem om subcellulaire lokalisatie van de verschillende signaleringeiwitten te bestuderen. TL-fusie-eiwitten worden uitgedrukt in Xenopus embryo&#39;s door RNA micro-injectie, zijn ectodermale explantaten voorbereid en eiwit lokalisatie wordt geëvalueerd door epifluorescentie. In deze experimentele protocol beschrijven we hoe de subcellulaire lokalisatie van Diversin, een cytoplasmatisch eiwit dat is betrokken bij signalering en celpolariteit vastberadenheid 6, 7 wordt gevisualiseerd in Xenopus ectodermale cellen Wnt signaaltransductie 8 te bestuderen. Co-expressie van een Wnt-ligand of een Frizzled receptor verandert de verdeling van de Diversin gefuseerd met rood fluorescerend eiwit, RFP en rekruten aan de celmembraan in een gepolariseerde mode 8, 9. Deze ex vivo protocol moet een nuttige aanvulling op in-vitro-studies van gekweekte zoogdiercellen, waarin ruimtelijke controle van signalering verschilt van die van de intacte weefsel en is veel moeilijker te analyseren is.

Xenopus embryonale ectoderm is uitgegroeid tot een aantrekkelijk model voor onderzoek van de cel polariteit. Een test wordt beschreven, waarin de subcellulaire distributie van fluorescerende eiwitten wordt beoordeeld in het ectoderm cellen. Dit protocol zal helpen met vragen met betrekking tot ruimtelijke controle van de signalering.

Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Celpolariteit is een fundamentele eigenschap van eukaryote cellen die dynamisch wordt gereguleerd door zowel intrinsieke als extrinsieke factoren tijdens embryonale ...

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van eiwitten te onderzoeken naar aanleiding van groeifactor-signalering. Dit wordt bereikt door eerst RNA's die coderen voor diverse RFP en de signaleringsreceptor FRIZZLED eight in blastomeren van vroege embryo's van xenopus te injecteren. Vervolgens worden electrodermale implantaten en/of cryosneden van embryo's geprepareerd en immunogekleurd.Ten slotte worden de immunogekleurde cellen afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die laten zien hoe de subcellulaire lokalisatie van specifieke eiwitten afhangt van embryonale signaleringspaden. Als voorbeeld tonen we aan dat diverse wordt gerekruteerd van het centrosoom naar het celmembraan door de FRIZZLED eight receptor.Deze methode stelt onderzoekers in staat om de subcellulaire lokalisatie van signaleringsproteïnen in vivo te visualiseren met behulp van xenopus-embryo's. Dit kan helpen bij het beantwoorden van fundamentele vragen in de ontwikkelings- en celbiologie, zoals studies naar de ruimtelijke regulatie van signalering en celprioriteitsmechanismen. Om het proces van in vitro fertilisatie te

polarized-translocation-fluorescent-proteins-xenopus-ectoderm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genetische Induceerbare Fate Mapping (GIFM) merken en tracks cellen met fijne ruimtelijke en temporele...

Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo</em

We beschrijven hier het gebruik van een pH-gevoelige groene fluorescerende eiwitvariant, pHluorine, om de spatio-temporele dynamiek van axongeleidingsreceptoren aan het celoppervlak te bestuderen. De pHluorine-gelabelde receptor wordt zowel in celkweek als in vivouitgedrukt met behulp van elektroporatie van het kuikenembryo.

Gebruik van pHluorine om de dynamiek van Axon Guidance Receptoren in celcultuur en in het kuikenembryo te beoordelen

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

We presenteren voorbijgaande transgenese en gen knock-down in doorschijnende zakpijp, een chordate zus groep gewervelde dieren, met behulp van micro-injectie en elektroporatie technieken. Dergelijke methoden vergemakkelijken functionele genomica in dit eenvoudige ongewervelde dat rudimentaire kenmerken van gewervelde dieren, met inbegrip van notochord en hoofd sensorische epitheel, en vele orthologen van de ziekte bij de mens geassocieerde genen beschikt.

Embryo micro-injectie en elektroporatie in de chordate<em&gt; Doorschijnende zakpijp</em

Deze video artikel beschrijft een eenvoudige in vivo methodiek die gebruikt kunnen worden om systematisch en efficiënt te karakteriseren componenten van complexe signaalwegen en regulatorische netwerken in vele ongewervelde embryo's.

De kracht van eenvoud: Sea Urchin Embryo&#39;s als<em&gt; In Vivo</em&gt; Developmental Modellen voor het bestuderen van complexe Cell-to-cell signaling Network Interactions

Dit protocol beschrijft een optogenetische strategie voor het moduleren van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) activiteit tijdens celdifferentiatie en Xenopus embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt het mogelijk om de omkeerbare activering van de MAPK signalering weg in zoogdiercelcultuur en in multicellulaire levende organismen, zoals Xenopus embryo's, met een hoge ruimtelijke en temporale resolutie.

Lichtgemedieerde Terugkeerbare Modulatie van de Mitogeen-Geactiveerde Proteïne Kinase Pathway tijdens Cell Differentiatie en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Ontwikkeling

Dit protocol laat zien hoe een eiwit nucleaire translocatie onder hittestress bijhouden met behulp van een groene fluorescentie proteïne (GFP) fusieproteïne als merkstof en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. De DAPI kleuring protocol is snel en behoudt de GFP en eiwit subcellular localisatie-signalen.

Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Kwantificering van DNA dubbel-strengs strepen met behulp van γH2AX vorming als een moleculaire marker is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument in straling biologie. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie assay voor de kwantificering van γH2AX foci na blootstelling van cellen aan straling.

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

Leer hoe eiwitlokalisatie verandert bij groeifactorsignalering in Xenopus embryonale ectodermcellen. Deze methode maakt visualisatie van subcellulaire signaaleiwitten in vivo mogelijk voor onderzoek naar celbiologie.

Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Meer video's verkennen