Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van eiwitten te onderzoeken naar aanleiding van groeifactor-signalering. Dit wordt bereikt door eerst RNA's die coderen voor diverse RFP en de signaleringsreceptor FRIZZLED eight in blastomeren van vroege embryo's van xenopus te injecteren. Vervolgens worden electrodermale implantaten en/of cryosneden van embryo's geprepareerd en immunogekleurd.

Ten slotte worden de immunogekleurde cellen afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die laten zien hoe de subcellulaire lokalisatie van specifieke eiwitten afhangt van embryonale signaleringspaden. Als voorbeeld tonen we aan dat diverse wordt gerekruteerd van het centrosoom naar het celmembraan door de FRIZZLED eight receptor.

Deze methode stelt onderzoekers in staat om de subcellulaire lokalisatie van signaleringsproteïnen in vivo te visualiseren met behulp van xenopus-embryo's. Dit kan helpen bij het beantwoorden van fundamentele vragen in de ontwikkelings- en celbiologie, zoals studies naar de ruimtelijke regulatie van signalering en celprioriteitsmechanismen. Om het proces van in vitro fertilisatie te starten, verkrijg eicellen van vrouwelijke kikkers die zijn geïnjecteerd met humaan choriongonadotrofine.

Voeg 12 uur voor het experiment 0,5 tot 1 ml van een 1X Marx-gemodificeerde Ringer-oplossing toe aan de eitjes en bevrucht deze in vitro met een klein stukje gedisseceerde testis. Verlaag na twee tot drie minuten de zoutconcentratie met 0,1 XMMR om de motiliteit van de sperma te activeren. Incubeer gedurende 20 minuten.

Na bevruchting oriënteren de eitjes zich met hun animale pool naar boven. Verwijder de geleiomhulsel van de eitjes door de MMR-oplossing gedurende vijf minuten te vervangen door een 3% cysteïne-oplossing in water. Was de eitjes drie keer met 0,1 XMMR.

Incubeer bij 13 °C tot het twee- tot viercelstadium. Breng de embryo's vervolgens over naar 3% fi. Call in 0,5 XMMR voor micro-injectie.

Synthetiseer RNA's uit gelineariseerde DNA-templates met behulp van de M message M machine-kit en verdun deze met RNAse-vrij water tot een concentratie van 0,1 tot 1 µg/µL. RNA's voor diverse RFP, de membraanmarker GFP CX en FRIZZLED 8 worden gebruikt in een hoeveelheid van 0,1 tot 1 ng per injectie. Bereid voor aanvang van de injectie injectienaalden uit capillaire buizen met behulp van een naaldtrekker en een naaldslijper.

Kalibreer elke naald met water om per injectie 10 liters vloeistof uit te stoten voor de injecties. Plaats embryo's bovenop een plastic schaaltje in een grote druppel 3%fial 0.5 XMMR. Zuig één microliter RNA-oplossing op in een injectienaald met een smalle shige micro-injector.

Injecteer 10 nanoliters RNA in elk van de twee animal-blastomeren van tweecellige embryo's. Breng de geïnjecteerde embryo's over naar een putje van een 12-wells plaat en incubeer deze bij 13 °C tot ze het vroege gastrulatiestadium bereiken.

Overbreng de embryo's in het gastrulatiestadium naar 0,6 XMMR-oplossing in een plastic schaal van zes centimeter die is gecoat met 1% aeros. Verwijder de vitellijnmembraan handmatig met een pincet. Gebruik vervolgens een tsin-naald en een haarlus om ectodermale explantaten uit de embryo's te excideren.

Fixeer ze gedurende 30 minuten in 3,7% formaldehyde in PBS. Was de X explan drie keer gedurende elk 10 minuten in PBS. Voeg davi toe aan de derde wasbeurt om de kernen te kleuren.

Monteer vervolgens de X-explan op een glazen objectglas door ze tussen twee stroken plakband te plaatsen, waarbij de niet-gepigmenteerde binnenzijde van de X-explan naar het objectief is gericht. Voeg twee tot drie druppels van 20 µL van de monteersolution toe. Plaats daarop een dekglas.

De geïnjecteerde embryo's kunnen cryosecties ondergaan om de distributie van fluorescerende eiwitten in de cel te visualiseren en om ze te kleuren met specifieke antilichamen. Fixeer de embryo's in stadium 10 gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur met een fixatief in een glazen buisje van vier milliliter. Bedrijf vervolgens, na het wassen in PBS, de embryo's in een oplossing van 15% visgelatine en 15% sucrose in hetzelfde buisje.

Verplaats de ingebedde embryo's de volgende dag naar een plastic mal. Vries de ingebedde embryo's snel in op droge ijs. Bereid vervolgens cryosnedes met behulp van een cryostaat.

Voer immunofluorescente kleuring uit op de coupes, monteer de objectglazen en beeldvorm de dwarsdoorsneden van embryo's met dezelfde methode als beschreven voor ectodermimplantaten. Verzamel beelden met een Zeiss Axio plan fluorescentiemicroscoop met de juiste filters en software om specifieke Z-vlakken binnen het X-vlak te identificeren en te beelden. In deze figuur is ersin gelokaliseerd in het centrosoom van ectodermale cellen, maar trans is gelokaliseerd in het celmembraan.

Als reactie op Frizzled eight markeert cex GFP het celmembraan in het groen. Diverse in RFP is in het rood, en DPI-gemarkeerde kernen zijn hier in het blauw. Diverse in RFP wordt door Frizzled eight naar het celmembraan gerekruteerd in cryosecties van embryo's.

Gamma-tubuline is een centrosomale marker. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het nut van XUS-embryo's en embryonale cellen voor studies naar eiwitdocking-autorisatie en signaleringsprocessen op subcellulaire resolutie.