Bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in Live Rat corticale neuronen

Het doel van deze procedure is om het mitochondriale membraanpotentiaal en de niveaus van reactieve zuurstofsoorten in primaire corticale neuronen te bepalen met behulp van de fluorescente probes TMRM en H 2D CFD respectievelijk. Dit wordt bereikt door eerst stock- en werkconcentraties van TMRM en H 2D CFDA voor te bereiden. De tweede stap is het incuberen van de corticale neuronen met TMRM en H 2D CFDA gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in Thai roads buffer.

De derde stap is het beelden van de fluorescentie-intensiteit van TMRM en DCF in levende corticale neuronen, waarbij respectievelijk 5 15 5 17 nanometer en 4 88 5 15 nanometer excitatie-emissie worden gebruikt. De veranderingen in de TMR-fluorescentie worden gemonitord in aanwezigheid van de mitochondriële ontkoppelaar FCCP, terwijl de veranderingen in de DCF-fluorescentie worden gemonitord in aanwezigheid van waterstofperoxide. De laatste stap van deze procedure is het verzamelen, normaliseren en analyseren van de gegevens.

Uiteindelijk worden de resultaten verkregen door een grafiek te plotten die de relatieve niveaus van TMRM- en DCF-fluorescentie-intensiteit respectievelijk vóór en na behandeling met FCCP en waterstofperoxide weergeeft. Hallo, ik ben Joanna Koska. Welkom in mijn laboratorium aan de Loyola University Chicago.

Vandaag laten we u zien hoe u het mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstofverbindingen in corticale neuronen van ratten kunt meten. De procedure wordt gedemonstreerd door dhi. Hallo, ik ben de Denise Jossi.

Met deze procedure kan het mitochondriale membraanpotentiaal worden gemeten met een enkelvoudige mitochondriale markering en reactieve zuurstofcomponenten met een enkelvoudige celmarkering. Laten we beginnen. Bereid een 10 millimolair stockoplossing van TMRM door vijf milligram TMRM op te lossen in één milliliter watervrije dimethylsulfoxide en meng dit gedurende één minuut met een vortex.

Maak vervolgens aliquots en bewaar deze bij -20 °C. Bescherm tegen licht en gebruik binnen één maand. Bereid daarna een 10 mM voorraadoplossing van H 2D CFDA door 4,87 mg H 2D CFDA op te lossen in 1 ml watervrij dimethylsulfoxide.

Vortex op dezelfde manier gedurende één minuut, maak vervolgens aliquoten en bewaar deze bij -20 °C. Bescherm tegen licht en gebruik binnen één week om de rat corticale neuronen eerst te laden met TMRM. Was de gekweekte neuronen drie keer met Tyro-buffer.

Bereid vervolgens 20 nM TMRM voor door de 10 mM TMRM-voorraad 1000 keer te verdunnen in tb. Voeg daarna twee µL van de verdunde TMRM toe per 1 mL tb. Incubeer de neuronen met TMRM gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur.

Plaats na 45 minuten de kweekschaal op de tafel van de microscoop en start de beeldvorming om de corticale neuronen van de rat te laden met H 2D CFDA, en was de gekweekte neuronen drie keer met tb. Bereid vervolgens twee micromolair H 2D CFDA voor door de 10 millimolair H 2D CFDA-stock 10 keer te verdunnen in tb. Voeg daarna twee microliter van de verdunde H 2D CFDA toe per één milliliter tb.

Incubeer de neuronen vervolgens 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur met H 2D CFDA. Was de neuronen vier keer met TB om overtollige fluorescente indicator te verwijderen voordat er beelden worden verkregen om live-imaging van de met TMRM geïncubeerde neuronen uit te voeren met behulp van confocale laserscanmicroscopie, waarbij een programma voor live tijdreeksen wordt gebruikt. Gebruik een lage resolutie en een verlaagd laservermogen om de tijd die nodig is voor het verkrijgen van de beelden te minimaliseren en fotobleking te voorkomen.

Stel vervolgens de focus van de gemonteerde neuronen geladen met TMRM in met behulp van gereflecteerd licht. Onderzoek de TMRM-fluorescentie door verlichting bij 540 nanometer en detectie bij 570 nanometer. Stel de detectieversterking van de camera net onder het verzadigingsniveau in zodra alle parameters, waaronder resolutie, laservermogensdetectie, cameraversterking en het time-lapse interval voor het verkrijgen van beelden, zijn ingesteld.

Wijzig deze instellingen niet tussen experimenten door. Verander vervolgens het gezichtsveld. Begin met het verzamelen van beelden om veranderingen in de delta PSY M stimulus te testen; bijvoorbeeld kan 1 µM FCCP of 2 µg/mL oligomycine worden toegepast, wat respectievelijk zal leiden tot een significante depolarisatie of hyperpolarisatie van het mitochondriale membraanpotentiaal.

Deze veranderingen zullen worden weerspiegeld door een afname van de TMRM-fluorescentie-intensiteit vergeleken met de basisfluorescentie-intensiteit in het geval van FCCP, of door een toename van de TMRM-fluorescentie-intensiteit. Om live imaging uit te voeren van neuronen geïncubeerd met H 2D CFDA, monteer dan eerst de kweekschaal op de tafel van een microscoop en stel de focus van de cellen in met behulp van gereflecteerd licht. Onderzoek de DCF-fluorescentie door excitatie bij 4 88 nanometers en emissie bij vijf 15 nanometers.

Pas vervolgens het laservermogen aan naar 5 tot 7%, stel de gain in en kies een resolutie van 256 bij 256. Wijzig deze instellingen niet tussen experimenten door. Stel daarna de frequentie in voor het verkrijgen van live-beelden.

Select met het tijdserieprogramma een nieuw veld en start de beeldverwerving om veranderingen in de ROS-niveaus te detecteren. Behandel de cellen met 100 tot 200 µM waterstofperoxide. Dit zal resulteren in een toename van de DCF-fluorescentie-intensiteit vergeleken met het basisniveau.

Gebruik de tool voor het selecteren van het interessegebied (region of interest) uit het LSM-programma om de gebieden te selecteren. Selecteer vervolgens ROI's van mitochondriale regio's of ROI's van het volledige cellichaam in de celafbeeldingen om respectievelijk de fluorescentie-intensiteiten van TMRM of ROS te meten.

Selecteer regio's naast de cellen. Neem meerdere metingen om de achtergrondfluorescentie-intensiteit te bepalen en bereken met Microsoft Excel de gemiddelde achtergrondintensiteit door deze af te trekken van de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de regio's van belang in elke cel voor elk tijdstip. Normaliseer na aftrek van de achtergrondintensiteit de TMRM- of DCF-fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de baseline-fluorescentie.

Gebruik deze formule en gebruik vervolgens het Sigma plot-programma om de grafiek te genereren die de veranderingen in fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd weergeeft. Hier is een voorbeeld van een fluorescentiebeeld van rat corticale neuronen geïncubeerd met TMRM. De toevoeging van de mitochondriële ontkoppelaar F-C-C-P-A leidt tot mitochondriële depolarisatie en een verlies van TMRM-fluorescentie-intensiteit.

Het basisniveau van de TMRM-fluorescentie blijft stabiel vóór de toevoeging van FCCP. Kwantitatieve analyse van de veranderingen in TMRM-fluorescentie in de loop van de tijd laat een significante afname van de TMRM-fluorescentie zien na toevoeging van FCCP. Hier is een voorbeeld van een fluorescentiebeeld van corticale neuronen van raten die zijn geladen met DCF.

Het basisniveau van de DCF-fluorescentie blijft ongewijzigd gedurende de eerste 120 seconden vóór de toevoeging van waterstofperoxide. De toevoeging van waterstofperoxide leidt tot een toename van de DCF-fluorescentie-intensiteit in de cellichamen. Time-lapse-metingen van de DCF-fluorescentie tonen stabiele niveaus die zijn toegenomen na de behandelingen met waterstofperoxide.

Bij deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een laag laservermogen en een hoge scansnelheid moeten worden gebruikt om artefacten door fotobleking en fototoxiciteit te voorkomen. Veel succes met uw experiment.