Name: Bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in Live Rat corticale neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Leer de mitochondriële membraanpotentiaal en reactieve zuurstof meten in levende ratcorticale neuronen met fluorescentie-indicatoren TMRM en H2D CFDA. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale functie en oxidatieve stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (K22NS050137 naar JCB).

1. Celcultuur <ol><li> Corticale neuronen worden geïsoleerd en gekweekt met behulp van eerder beschreven technieken en uitgeplaat op de cultuur gerechten met een glazen bodem (MatTek Corporation, Ashland, MA) bekleed met poly-D-lysine en laminine 1. </li></ol> 2. De voorbereiding van de voorraad-oplossingen voor de fluorescerende probes TMRM en H 2 DCF-DA <ol><li> Bereid een 10-mM voorraad oplossing van TMRM door het oplossen van 5,0 mg TMRM in 1 ml watervrij dimethylsulfoxide. Vortex het voor 1 minuut. Maak dan aliquots en bewaar ze bij -20 ° C, beschermen tegen licht, en het gebruik binnen een maand. </li><li> Vervolgens bereiden een 10-mM voorraad oplossing van H 2 DCF-DA door het oplossen van 4,87 mg van H 2 DCF-DA in 1 ml watervrij DMSO. Ook vortex het voor 1 minuut. Maak dan aliquots en bewaar ze bij -20 ° C, beschermen tegen licht en gebruik binnen een week. </li></ol> 3. Het laden van rat corticale neuronen met TMRM en H 2 DCF-DA TMRM is een potentiometrische, cel-permeabele fluorescentie-indicator, dat zich ophoopt in de sterk negatief geladen interieur van mitochondriën. Het is belangrijk om de lage concentraties (10-50 nM bereik) van TMRM te gebruiken om auto-quenching van de mitochondriale TMRM te voorkomen. Vervolgens kan de fluorescentie-signaal van TMRM direct verband houden met co-ΔΨm over het binnenste mitochondriale membraan. Een verlies van ΔΨm oorzaken TMRM lekken van mitochondriën leidt tot een verlies van fluorescentie-intensiteit. H 2 DCF-DA is cel-permeabele sonde omgezet in DCF-DA door intracellulaire esterasen, en de oxidatie leidt tot fluorescerende DCF. De uiteindelijke concentratie van H 2 DCF-DA varieert tussen 20 tot 10 uM en het moet empirisch worden getest in neuronen uit verschillende gebieden van de hersenen omdat hoge concentraties van het laden kan resulteren in de verzadiging van de DCF-fluorescentie, zelfs in de afwezigheid van H 2 O 2. De aanwezigheid van een endogene of exogene oxidant (zoals stikstofoxide, waterstof peroxide) zal toenemen DFC fluorescentie-intensiteit. Hieronder geven we een protocol voor het laden van rat corticale neuronen met TMRM en H 2 DCF-DA. <ol><li> Voor het laden van de rat corticale neuronen met TMRM de eerste plaats was de gekweekte neuronen drie keer met buffer Tyrode's (Text Overlay: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl 2, en 10 mM HEPES, de pH instellen op 7,4 met NaOH). Dan, bereiden 20 nM van TMRM door verdunning van de 10 mM TMRM voorraad 1 / 1000 keer in TB en voeg dan 2 pi van de verwaterde TMRM per 1 ml van de TB. Incubeer de neuronen met TMRM gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Na 45 min, monteren de cultuur schotel op het podium van de microscoop en begin beeldvorming. </li><li> Voor het laden van de rat corticale neuronen met H 2 DCF-DA, was de gekweekte neuronen drie keer met TB. Vervolgens bereiden 2 uM van H 2 DCF-DA door verdunning van de 10 mm H 2 DCF-DA voorraad 1 / 10 keer in TB en voeg dan 2 pl verdund H 2 DCF-DA per 1 ml van de TB. Dan, incubeer de neuronen met H 2 DCF-DA voor 45 min in donker bij kamertemperatuur. Na 45 minuten, was de neuronen vier keer met TB om het overtollige fluorescentie-indicator te verwijderen voordat u om beelden te verkrijgen. </li></ol> 4. Live-beeldvorming van neuronen geïncubeerd met TMRM om te bepalen ΔΨm <ol><li> Voor het uitvoeren van live-beelden van de neuronen geïncubeerd met TMRM, confocale laser scanning microscopie (Text Overlay: LSM 510, Carl Zeiss Inc), met de toepassing van de live-tijd-serie programma, wordt gebruikt. Toe te passen met een lage resolutie en verzwakt laservermogen (Text Overlay: lage resolutie: 256 x 256; laservermogen: 1%) om de tijd die nodig is om beelden te verkrijgen en om te voorkomen dat fotobleking te minimaliseren. </li><li> . Pas vervolgens de focus van de gemonteerde neuronen geladen met TMRM met behulp van gereflecteerd licht. Onderzoek de TMRM fluorescentie door belichting bij 514 nm en detectie bij 570 nm. Stel de detectie te krijgen van een camera net onder het verzadigingsniveau. </li><li> Zodra alle parameters die resolutie, laservermogen, detectie te krijgen van een camera, en time-lapse-interval zijn te verkrijgen beelden zijn vast te stellen; niet veranderen deze instellingen tussen de experimenten. Vervolgens verandert het veld. Beginnen met het verzamelen beelden. </li><li> Voor het testen van veranderingen in de ΔΨm, kan stimuli zoals een uM van FCCP of 2 ug / ml van oligomycin, worden toegepast, die aanzienlijk zal depolariseren of hyperpolarize de mitochondriale membraanpotentiaal respectievelijk. Deze wijzigingen zullen worden weerspiegeld door een afname in TMRM fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de baseline fluorescentie-intensiteit in het geval van FCCP, of een toename in TMRM fluorescentie-intensiteit in het geval van oligomycin. </li></ol> 5. Live-beeldvorming van neuronen geïncubeerd met H 2 DCF-DA naar ROS te bepalen <ol><li> Voor het uitvoeren van live-beelden van de neuronen geïncubeerd met H 2 DCF-DA in de eerste, mount de cultuur schotel op het podium van een microscoop. Pas de scherpstelling van de cellen onsING gereflecteerde licht. Onderzoek DCF fluorescentie door excitatie bij 488 nm en emissie bij 515 nm. </li><li> Daarna pas het laservermogen tot 5-7%, detector te krijgen, en de resolutie van 256 x 256. Niet wijzigen van deze instellingen tussen de experimenten. Stel vervolgens de frequentie voor het verkrijgen van live-beelden met behulp van de tijdreeks programma. </li><li> Selecteer een nieuw veld en start het verwerven van beelden. Voor het detecteren van veranderingen in de ROS levels, te behandelen cellen met 100 tot 200 uM van H 2 O 2. Dit wordt weergegeven door een toename van de DCF-fluorescentie-intensiteit ten opzichte van baseline-niveau. </li></ol> 6. Data-analyse <ol><li> Gebruik region of interest (Text Overlay: ROI) gereedschap uit de LSM-programma om de gebieden te selecteren. Dan, het meten van de TMRM of ROS fluorescentie-intensiteiten. Selecteer de ROI van mitochondriaal regio's of ROI's uit de hele cel lichaam in beeld gebracht cellen om de fluorescentie-intensiteit van TMRM of ROS, respectievelijk te meten. </li><li> Bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van alle ROI van elke cel voor TMRM of van whole cell instanties voor alle belichte cellen voor ROS voor elk tijdstip. Selecteer de regio naast de cellen naar de achtergrond fluorescentie-intensiteit te berekenen. Enkele metingen uit en bereken het gemiddelde achtergrond intensiteit. </li><li> Trek de gemiddelde achtergrond fluorescentie-intensiteit van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de ROI in elke cel van elk tijdstip met behulp van Microsoft Excel. Na aftrek van achtergrond intensiteit, normaliseren de TMRM of DCF fluorescentie-intensiteit van de baseline fluorescentie met deze formule (Text Overlay: AF = FF o / F o x 100, waarbij F = fluorescentie-intensiteit op elk tijdstip, Voor = baseline fluorescentie). Gebruik dan de Sigma Plot programma om het perceel waarop de veranderingen in fluorescentie-intensiteit in de tijd te genereren. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Figuur 1A toont een beeld van de fluorescentie rat corticale neuronen geïncubeerd met TMRM. Toevoeging van FCCP, een mitochondriale ontkoppelrail, leidt tot mitochondriale depolarisatie en een verlies van TMRM fluorescentie-intensiteit (Fig. 1B). De baseline TMRM fluorescentie niveau blijft stabiel voor toevoeging van FCCP (de eerste 350 seconden;. Figuur 1C). Kwantitatieve analyse van TMRM fluorescentie verandert in de tijd toont een significante afname in TMRM fluorescentie na toevoeging van FCCP (Fig. 1C). Figuur 1D toont de fluorescentie beeld van de rat corticale neuronen geladen met DCF. Toevoeging van H 2 O 2 resulteert in een verhoogde DCF fluorescentie-intensiteit in cel organen (fig. 1E). De baseline DCF fluorescentie niveau is ongewijzigd (de eerste 120 sec) vóór de toepassing van H 2 O 2. Time-lapse metingen van DCF fluorescentie geven aan haar vaste niveaus, die toenemen na H 2 O 2 behandeling (fig. 1F). <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Beoordeling van de mitochondriale membraanpotentiaal en ROS levels in levende rat corticale neuronen. (A) Vertegenwoordiger fluorescentie beeld van de corticale neuronen geladen met TMRM. Na het scannen van de baseline TMRM fluorescentie, werden behandeld met de neuronen protonophore FCCP (1 uM). Aan de rechterkant is een pseudokleur intensiteit bar van TMRM fluorescentie met fel geel en zwart die maximum en minimum intensiteit, respectievelijk. Het verlies van TMRM fluorescentie van de mitochondriale regio's geeft de ineenstorting van ΔΨm op FCCP behandeling (panel B). De kwantitatieve vertegenwoordiging van verandering in TMRM fluorescentie-intensiteit op verschillende tijdstippen voor en na FCCP behandeling wordt getoond in paneel C. (D) Fluorescentie beeld van de rat corticale neuronen geladen met H2DCF-DA. Na het bepalen van de baseline DCF fluorescentie, werden de cellen behandeld met 200 uM H 2 O 2, en de verandering in de DCF fluorescentie werd beoordeeld. Een toename van de DCF fluorescentie weerspiegelt de toename van de ROS levels bij H 2 O 2 behandeling (E). Kwantitatieve analyse van verandering in de DCF fluorescentie, voor en na de H 2 O 2 de behandeling, wordt weergegeven in paneel F. Schaal bar = 10 urn Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi Live-cell imaging van TMRM in corticale neuronen voor en na FCCP Naast het gebruik van 40X doelstelling. De pseudocolor intensiteit toont een maximum (fel geel, voor FCCP toevoeging) en verminderde (rode kleur, na FCCP toevoeging) TMRM fluorescentie-intensiteit na FCCP toevoeging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">Klik hier om de video te bekijken</a> Video. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi Live-cell imaging van de DCF in corticale neuronen voor en na H 2 O 2 Naast het gebruik van 40X doelstelling. De baseline DCF fluorescentie heeft lichtgroene kleur in cel organen en H2O2 Daarnaast verhoogt de DCF fluorescentie-intensiteit te felle groene kleur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">Klik hier om video te bekijken</a>

<ol><li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+%28AICD%29+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li>
<li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%3A+implication+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li>
</ol>

We hebben gepresenteerd een stap-voor-stap procedure beschrijft hoe u ΔΨm en ROS bepalen rat corticale neuronen met behulp van de TL-indicatoren TMRM en H 2 DCF-DA, respectievelijk. Voor andere celtypen, is het belangrijk om empirisch vast te stellen is de uiteindelijke concentratie en laden tijd voor TMRM of H 2 DCF-DA. In het algemeen, TMRM concentraties range 20 tot 200 nM, en de cel incubatie tijd met TMRM varieert van 20 tot 60 minuten. De uiteindelijke concentratie van H 2 DCF-DA varieert 2-10 uM, en incubatie van cellen in een laad-oplossing die deze indicator varieert van 30-45 min.. Het is belangrijk om het optimaliseren van de laser kracht en de scansnelheid van het nemen van de beelden, zowel voor foto-toxiciteit te vermijden om de cellen en veranderingen in de fluorescentie-intensiteit (bijvoorbeeld flikkeren van TMRM fluorescentie) in het ontbreken van een stimulus. De geoptimaliseerde optische instellingen moeten resulteren in een fluorescentie-signaal dat is niet meer of minder verzadigd (drempel) in de afwezigheid van de stimulus. De optimale voorwaarden om de beelden te verzamelen van een geselecteerd veld op een bepaalde laservermogen en een scansnelheid worden bereikt als er geen veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van de sonde in het ontbreken van een stimulans voor 10-15 minuten van de live imaging. Andere fluorescentie probes aan ΔΨm bepalen onder meer rhodamine 123 en tetra-methyl-rhodamine ethylester (TMRE). Ze werden echter gevonden om de respiratoire processen in geïsoleerde mitochondria 2 remmen. Belangrijk is dat TMRM heeft geen effect op de mitochondriale ademhaling bij lage concentraties 2 en heeft een lage fototoxiciteit en fotobleking 3 in vergelijking met andere sondes. H 2 DCF-DA is een goede indicator voor de ROS als het is goed bewaard in de cellen en herkent verschillende oxidant soorten, zoals peroxiden, super oxiden, en stikstofoxide 4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Glazen bodem cultuur schaal </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in live rat corticale neuronen

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondriale membraan potentiaal (ΔΨm) is van cruciaal belang voor het behoud van de fysiologische functie van de luchtwegen keten ATP te genereren. Een significant verlies van ΔΨm maakt cellen uitgeput van energie met daaropvolgende dood. Reactive oxygen species (ROS) zijn belangrijke signaalmoleculen, maar hun accumulatie in pathologische condities leidt tot oxidatieve stress. De twee belangrijkste bronnen van ROS in de cellen zijn milieu-toxines en het proces van oxidatieve fosforylering. Mitochondriale dysfunctie en oxidatieve stress zijn betrokken in de pathofysiologie van vele ziekten, daarom de mogelijkheid om ΔΨm en ROS te bepalen kan belangrijke aanwijzingen over de fysiologische status van de cel en de functie van de mitochondriën. Verschillende fluorescerende probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) kan gebruikt worden om te bepalen Δψm in een verscheidenheid van celtypes, en vele fluorescentie-indicatoren (Dihydroethidium, dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) kan worden gebruikt om de ROS te bepalen . Bijna alle van de beschikbare fluorescentie probes gebruikt om ΔΨm of ROS te beoordelen zijn single-golflengte indicatoren, die verhogen of verlagen van hun fluorescentie-intensiteit evenredig is aan een stimulus die verhoogt of verlaagt het niveau van ΔΨm of ROS. Zo is het noodzakelijk om de fluorescentie-intensiteit van deze probes te meten op het basisniveau en na de toepassing van een specifieke stimulus. Dit maakt het mogelijk om vast te stellen het percentage van de verandering in de fluorescentie-intensiteit tussen het basisniveau en een stimulans. Deze verandering in de fluorescentie-intensiteit weerspiegelt de verandering in de relatieve niveaus van ΔΨm of ROS. In deze video laten we zien hoe de fluorescentie-indicator, TMRM, toe te passen in de rat corticale neuronen aan de procentuele verandering in TMRM fluorescentie-intensiteit tussen de baseline-niveau en na het toepassen van FCCP, een mitochondriale ontkoppelrail te bepalen. De lagere niveaus van TMRM fluorescentie als gevolg van FCCP behandeling afspiegeling van de depolarisatie van de mitochondriale membraanpotentiaal. We hebben ook laten zien hoe je de fluorescentie sonde H 2 DCF-DA van toepassing zijn op het niveau van de ROS in corticale neuronen, eerst bij aanvang vervolgens beoordelen en na toepassing van H 2 O 2. Dit protocol (met kleine wijzigingen) kan ook worden gebruikt om veranderingen in ΔΨm en ROS in verschillende celtypes en in neuronen geïsoleerd van andere hersengebieden te bepalen.

Tonen we de toepassing van de fluorescentie-indicator, TMRM, in corticale neuronen van de relatieve veranderingen in TMRM fluorescentie-intensiteit te bepalen voor en na toepassing van een specifieke stimulus. We tonen ook de toepassing van de fluorescentie sonde H<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA naar het relatieve niveau van reactieve zuurstof species in corticale neuronen te beoordelen.

Bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in Live Rat corticale neuronen

Het mitochondriale membraanpotentiaal (&Delta;&Psi;m) is essentieel voor het behoud van de fysiologische functie van de ademhalingsketen voor de generatie van ATP. Een ...

Het doel van deze procedure is om het mitochondriale membraanpotentiaal en de niveaus van reactieve zuurstofsoorten in primaire corticale neuronen te bepalen met behulp van de fluorescerende probes TMRM en H 2D CFD respectievelijk. Dit wordt bereikt door eerst stamoplossingen en werkconcentraties van TMRM en H 2D CFDA voor te bereiden. De tweede stap is het incuberen van de corticale neuronen met TMRM en H 2D CFDA gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in Thai roads-buffer.De derde stap is het beelden van de fluorescentie-intensiteit van TMRM en DCF in levende corticale neuronen met respectievelijk 515/517 nanometer en 488/515 nanometer excitatie-emissie. De veranderingen in de TMRM-fluorescentie worden gemonitord in aanwezigheid van de mitochondriële ontkoppelaar FCCP, terwijl de veranderingen in de DCF-fluorescentie worden gemonitord in aanwezigheid van waterstofperoxide. De laatste stap van deze procedure is de verzameling, normalisatie en analyse van de gegevens.Uiteindelijk worden de resultaten verkregen door een grafiek te plotten die de relatieve niveaus van TMRM- en DCF-fluorescentie-intensiteit respectievelijk voor en na behandeling met FCCP en waterstofperoxide weergeeft. Hallo, ik ben Joanna Koska. Welkom in mijn laboratorium aan de Loyola University Chicago.Vandaag laten we u zien hoe u het mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstofcomponenten kunt meten in corticale neuronen van ratten. De procedure wordt gedemonstreerd door dhi. Hallo, ik ben de Denise Jossi.Met deze procedure kan het mitochondriale membraanpotentieel worden gemeten met een enkelvoudige mitochondriale markering en reactieve zuurstofverbindingen met een enkelvoudige celmarkering. Laten we beginnen. Bereid een 10 millimolar stockoplossing van TMRM door vijf milligram TMRM op te lossen in één milliliter watervrij dimethylsulfoxide en één minuut te vortexen.Maak vervolgens aliquots en bewaar deze bij -20 °C. Bescherm tegen licht en gebruik binnen één maand. Bereid daarna een 10 mM stockoplossing van H 2D CFDA door 4,87 mg H 2D CFDA op te lossen in 1 mL watervrije dimethylsulfoxide.Vortex op dezelfde manier gedurende één minuut, maak vervolgens aliquots en bewaar deze bij -20 °C. Bescherm tegen licht en gebruik binnen één week om de rat corticale neuronen eerst te laden met TMRM. Was de gekweekte neuronen drie keer met tyro's buffer.Bereid vervolgens 20 nM TMRM voor door de 10 mM TMRM-stock 1000 keer te verdunnen in tb. Voeg daarna twee µL van de verdunde TMRM toe per 1 mL tb. Incubeer de neuronen met TMRM gedurende 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur.Plaats na 45 minuten de kweekschaal op de tafel van de microscoop en start de beeldvorming om de ratte corticale neuronen te laden met H 2D CFDA, en was de gekweekte neuronen drie keer met tb. Bereid vervolgens twee micromolair H 2D CFDA voor door de 10 millimolair H 2D CFDA-stock 10 keer te verdunnen in tb. Voeg daarna twee microliter van de verdunde H 2D CFDA toe per ene milliliter tb.Incubeer de neuronen vervolgens 45 minuten in het donker bij kamertemperatuur met H 2D CFDA. Was de neuronen vier keer met TB om overtollige fluorescente indicator te verwijderen voordat er beelden worden vastgelegd om live-imaging uit te voeren van neuronen die zijn geïncubeerd met TMRM via confocale laserscanmicroscopie, waarbij een programma voor live-tijdreeksen wordt gebruikt. Pas een lage resolutie en gedempte lasersterkte toe om de tijd die nodig is voor het verkrijgen van beelden te minimaliseren en fotobleken te voorkomen.Stel vervolgens de focus van de gemonteerde neuronen die geladen zijn met TMRM in met behulp van gereflecteerd licht. Onderzoek de TMRM-fluorescentie door illuminatie bij 540 nanometers en detectie bij 570 nanometers. Stel de detectieversterking van de camera net onder het verzadigingsniveau in zodra alle parameters zijn ingesteld, waaronder de resolutie, het laservermogen, de detectie, de versterking van de camera en het time-lapse interval voor het verkrijgen van beelden.Wijzig deze instellingen niet tussen experimenten door. Wijzig vervolgens het veld. Begin met het verzamelen van beelden om wijzigingen in de delta PSY M-stimulus te testen; zo kan bijvoorbeeld 1 µM FCCP of 2 µg/mL oligomycine worden toegepast, wat respectievelijk zal leiden tot een significante depolarisatie of hyperpolarisatie van het mitochondriale membraanpotentiaal.Deze veranderingen zullen worden weerspiegeld door een afname in TMRM-fluorescentie-intensiteit vergeleken met de basislijn-fluorescentie-intensiteit in het geval van FCCP, of een toename in TMRM-fluorescentie-intensiteit. Om live-imaging uit te voeren van neuronen die eerst zijn geïncubeerd met H 2D CFDA, monteert u het kweekschaaltje op de tafel van een microscoop en stelt u de focus van de cellen in met behulp van gereflecteerd licht. Onderzoek de DCF-fluorescentie door excitatie bij 4 88 nanometers en emissie bij vijf 15 nanometers.Stel vervolgens het laservermogen in op 5 tot 7%, stel de gain in en kies een resolutie van 256 bij 256. Wijzig deze instellingen niet tussen de experimenten door. Stel daarna de frequentie in voor het verkrijgen van live-beelden.Select met het Time series-programma een nieuw veld en start de beeldacquisitie om veranderingen in de R os-niveaus te detecteren. Behandel de cellen met 100 tot 200 µM waterstofperoxide. Dit zal resulteren in een toename van de DCF-fluorescentie-intensiteit ten opzichte van het basisniveau.Gebruik de tool voor het selecteren van het interessegebied (region of interest) van het LSM-programma om de gebieden te selecteren. Selecteer vervolgens ROI's van mitochondriale regio's of ROI's van het gehele cellichaam in de celafbeeldingen. Dit dient om respectievelijk de fluorescentie-intensiteiten van TMRM of ROS te meten.Selecteer regio's naast de cellen. Voer meerdere metingen uit om de achtergrondfluorescentie-intensiteit te bepalen en trek, met behulp van Microsoft Excel, de gemiddelde achtergrondfluorescentie-intensiteit af van de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten van de regio's van belang in elke cel voor elk tijdstip om de gemiddelde achtergrondintensiteit te berekenen. Normaliseer na aftrek van de achtergrondintensiteit de TMRM- of DCF-fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de baseline-fluorescentie.Gebruik deze formule en gebruik vervolgens het Sigma plot-programma om de grafiek te genereren die de veranderingen in fluorescentie-intensiteit over de tijd weergeeft. Hier is een voorbeeld van een fluorescentiebeeld van ratte corticale neuronen die zijn geïncubeerd met TMRM. De toevoeging van de mitochondriële ontkoppelaar F-C-C-P-A leidt tot mitochondriële depolarisatie en een verlies van TMRM-fluorescentie-intensiteit.Het basisniveau van de TMRM-fluorescentie blijft stabiel vóór de toevoeging van FCCP. Kwantitatieve analyse van de veranderingen in TMRM-fluorescentie over de tijd laat een significante afname in TMRM-fluorescentie zien na toevoeging van FCCP. Hier is een voorbeeld van een fluorescentiebeeld van corticale neuronen van raten die zijn geladen met DCF.Het basisniveau van de DCF-fluorescentie blijft ongewijzigd gedurende de eerste 120 seconden voorafgaand aan de toevoeging van waterstofperoxide. De toevoeging van waterstofperoxide leidt tot een toename van de DCF-fluorescentie-intensiteit in de cellichamen. Time-lapse metingen van de DCF-fluorescentie tonen stabiele niveaus die zijn gestegen na de behandelingen met waterstofperoxide.Bij deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat een laag laservermogen en een hoge scansnelheid moeten worden gebruikt om artefacten door fotobleken en fototoxiciteit te voorkomen. Veel succes met uw experiment.

determination-mitochondrial-membrane-potential-reactive-oxygen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Katsalifis, A., et al. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the imaging of mitochondrial redox state in primary neurons using a ratiometric fluorescent indicator. By applying two excitation wavelengths under a fluorescence microscope, the fluorescence intensity ratio is measured to assess mitochondrial oxidation. The protocol includes N-methyl-D-aspartate (NMDA) stimulation...

Imaging the Mitochondrial Redox State in Primary Neurons Using a Ratiometric Indicator

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Dit artikel beschrijft de methode voor mitochondriale time-lapse beeldvorming van astrocytenculturen uitgerust met MitoTimer biosensor en de resulterende multiparametrische analyse van mitochondriale dynamica, mobiliteit, morfologie, biogenese, redoxtoestand en omzet.

Live-imaging van mitochondriaal systeem in gekweekte astrocyten

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.

Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen

Het mitochondriale netwerk is uiterst complex, waardoor het zeer uitdagend is om te analyseren. Een nieuwe MATLAB-tool analyseert live confocale mitochondriën in timelapse-beelden, maar resulteert in een groot uitvoervolume dat individuele handmatige aandacht vereist. Om dit probleem aan te pakken, werd een routinematige optimalisatie ontwikkeld, waardoor een snelle bestandsanalyse mogelijk is.

Geoptimaliseerde geautomatiseerde analyse van homeostasemodulatie van levende neuronale mitochondriën door isovormspecifieke retinoïnezuurreceptoren

Dit protocol presenteert een workflow voor de voortplanting, differentiatie en kleuring van gekweekte SH-SY5Y-cellen en primaire hippocampusneuronen van ratten voor visualisatie en analyse van de mitochondriale ultrastructuur met behulp van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie.

Het gebruik van levende cel STED beeldvorming om de ultrastructuur van het mitochondriale binnenmembraan in neuronale celmodellen te visualiseren

In deze studie beschrijven we een stapsgewijs protocol en benadrukken we de belangrijkste details voor het bepalen van morfologische kenmerken van mitochondriën in levende cellen, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en gegevensanalyse. Deze methode wordt vaak gebruikt om de mitochondriale morfologie te onderzoeken voor het bestuderen van verschillende aandoeningen.

Bepaling van mitochondriale morfologie in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Leer de mitochondriële membraanpotentiaal en reactieve zuurstof meten in levende ratcorticale neuronen met fluorescentie-indicatoren TMRM en H2D CFDA. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale functie en oxidatieve stress.

Bepaling van de mitochondriale membraanpotentiaal en reactieve zuurstof in Live Rat corticale neuronen

Meer video's verkennen