Een systeem voor het kweken van Iris pigment epitheelcellen aan Lens Regeneratie Study in Newt
22 juni 2011
In newt, de lens regenereert altijd vanaf het dorsale iris door transdifferentiatie van de iris gepigmenteerde epitheelcellen (IPE). Hier beschrijven we een procedure om cultuur dorsale en ventrale newt IPE cellen en hun inplanting op de newt oog. De geïmplanteerde cellen worden vervolgens onderzocht door weefsel snijden en immunohistochemie.
Het algemene doel van deze procedure is het kweken van gepigmenteerde epitheelcellen van de iris om lensregeneratie bij de salamander te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst een salamander te anesthetiseren in een slaapoplossing en vervolgens de ogen te verwijderen.
De tweede stap van de procedure is het isoleren van gepigmenteerde epitheelcellen van de iris uit het oogweefsel door eerst het retinawefsel te verwijderen, gevolgd door het snijden van corneaal irisfragmenten in dorsale en ventrale helften. De iriscellen worden vervolgens gescheiden van het stroma en in vitro gedurende twee weken gekweekt. Na twee weken kweek worden de IPE-cellen geaggregeerd en vervolgens geïmplanteerd in een recipiënt die is geoptimaliseerd.
Na een maand genezing onthult histologie het potentieel voor lensregeneratie van dorsale en ventrale IPE-cellen. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal bij de stappen van celkweek en implantatie, die moeilijk te leren zijn omdat ze een breed scala aan vaardigheden voor microdissectie en chirurgie vereisen. Begin met het anesthetiseren van ten minste zeven nudes met 0,1% ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfzuur en verwijder hun ogen chirurgisch met een pincet en chirurgische scharen door het ooglid samen met het conjunctiva weg te snijden. Knip vervolgens de oogzenuw door.
Verplaats de gedissekeerde ogen nu snel naar een zuurkast en steriliseer ze gedurende drie seconden in lugo-ethanol. Was de ogen vervolgens tweemaal in calcium- en magnesiumvrije Hanks-oplossing. Breng ze over naar verse Hanks-oplossing en ga verder met de dissectie.
Maak met een scalpel een inkeping in het oog. Gebruik vervolgens een schaar om langs de rand van het hoornvlies te knippen. Verwijder de lens en snijd het resterende netvliesweefsel samen met de sclera weg.
Verplaats de iris-hoornvliescomplexen met een scalpel nr. 15 naar een schaal met verse hanks-oplossing. Scheid de complexen in hun dorsale en ventrale helften. De dorsale en ventrale irissen worden geïdentificeerd aan de hand van de aanwezigheid van zwarte vlekken op de sclera aan de dorsale zijde en een V-vormige inkeping op de ventrale iris.
Scheid de ventrale iris en de dorsale iris. Verzamel de irisfragmenten in een schaaltje van 35 millimeter met één milliliter L 15-oplossing. Bewaar de dorsale en ventrale helften in afzonderlijke schaaltjes.
Voeg nu 150 µL dispa-oplossing toe aan de schaaltjes en incubeer deze gedurende twee uur bij 27 °C. Om IPE-cellen uit het stroma te verzamelen: pel met behulp van een pincet voorzichtig de IPE-cellen van alle verzamelde weefselfragmenten.
Breng vervolgens de IPE-cellen over naar een buisje van 1,5 milliliter en centrifugeer deze twee minuten bij 1000 RPM bij kamertemperatuur; verwijder daarna het supernatant. Resuspendeer het pellet in één milliliter Hanks-oplossing en herhaal de centrifugatie om de cellen te scheiden. Verwijder de Hanks-oplossing en resuspendeer het pellet.
Incubeer gedurende twee uur bij 27 °C in één milliliter van een 1:250 trypsine-oplossing. Centrifugeer om de cellen te wassen en verwijder de trypsine. Voeg één milliliter L 15-oplossing toe en centrifugeer opnieuw; herhaal deze wasstap nogmaals en vervang de vloeistof door 800 µL verse L 15, waarna de cellen voorzichtig met een pipet in de oplossing worden gebracht. Zaai de cellen vervolgens uit in 24-wellplaten die zijn gecoat met collageen.
De gebruikelijke opbrengst van zeven N's is vier putjes met dorsale cellen en vier putjes met ventrale cellen. Incubeer de schaal na twee weken gedurende twee weken bij 27 °C. Hier wordt getoond dat het IPE kan worden getransfecteerd met genen om hun functie bij lensregeneratie te onderzoeken.
Deze tweeweekse cultuur van ventrale IPE-cellen vertoont dezelfde morfologie als de dorsale cellen. Let op dat de pigmentatie in dit stadium in zowel de dorsale als ventrale iriscellen aanwezig blijft. Alvorens de IPE-cellen te implanteren, moeten ze worden geaggregeerd door 20 µL dyse in 400 µL vers kweekmedium aan de cellen toe te voegen; draai de plaat voorzichtig en laat de cellen gedurende de nacht in een incubator bij 27 °C.
Gebruik de volgende dag voorzichtig een pipette om de cellen los te maken en breng deze vervolgens over naar buisjes van 1,5 milliliter. Was de cellen nu door de buisjes te centrifugeren en het supernatant te vervangen door één milliliter L 15. Herhaal deze stap tweemaal. Gebruik 10 microliters van de celsuspensie om het celgetal te berekenen met standaardmethoden.
Nadat dit is berekend, worden 3000 tot 5,000 cellen in 200 µL L 15 per aggregaat klaargemaakt. Centrifugeer de cellen vervolgens en incubeer ze gedurende 48 uur. Bij 27 °C kunnen de cellen nu worden geïmplanteerd in een recipientdier.
Begin met het anesthetiseren van een volwassen nieuwe in de slaapoplossing tot deze stopt met bewegen. Gebruik nu een scalpelblad om een snee in het hoornvlies van het oog te maken. Verwijder vervolgens de lens met een pincet.
Nadat de lens is verwijderd, plaatst u het IPE-celaggregaat net onder het hoornvliesweefsel aan de ventrale zijde van het oog. Plaats de salamander vervolgens in een aparte container en laat deze genezen. Wees tijdens deze periode voorzichtig bij het hanteren van de salamander om beschadiging van het genezende weefsel te voorkomen.
De getransplanteerde cellen hebben een maand nodig om uit te groeien tot een nieuwe lens. Na een maand worden de nieuwe ogen, waarin de aggregaatcellen zijn geïmplanteerd, verwijderd en wordt het weefsel gefixeerd. Met behulp van een standaard dehydratieprotocol kan het gefixeerde weefsel worden ingebed in inbeddingsmallen die geschikt zijn voor het snijden van coupes van 15 micrometer, die vervolgens op de juiste wijze worden gekleurd.
Na de implantatie van het aggregaat in een lensloze oogkas, induceert het aggregaat van de dorsale IPE-cellen de vorming van een nieuwe lens. Inductie van de gastheerlens vanuit de dorsale iris wordt ook waargenomen in het oog met het ventrale implantaat. Geen lensinductie wordt waargenomen bij het aggregaat dat is geprepareerd uit de ventrale IPE-cellen wanneer het gen six 3 wordt overexpressie; in aanwezigheid van retinoïnezuur wordt lensinductie waargenomen vanuit het ventrale aggregaat.
Daarnaast wordt inductie van de lens door de dorsale iris van het oog waargenomen na de ontwikkeling ervan. Deze techniek maakte het voor onderzoekers op het gebied van lensregeneratie mogelijk om de rol van verschillende genen op een nieuwe manier te onderzoeken.
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het kweken van gepigmenteerde epitheelcellen van de iris (IPEs) van salamanders om lensregeneratie te onderzoeken. De procedure omvat het isoleren en implanteren van deze cellen in het oog van de salamander, gevolgd door histologische analyse om de lensvorming te beoordelen.
Belangrijke Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve Biologie
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Salamanders hebben het vermogen om lenzen te regenereren vanuit cellen van de dorsale iris.
- Gepigmenteerde iris-epitheelcellen (IPEs) spelen een cruciale rol in dit regeneratieproces.
- Inzicht in de mechanismen van lensregeneratie kan nieuwe inzichten bieden voor de regeneratieve geneeskunde.
- Eerdere studies hebben het potentieel van IPEs bij de lensvorming aangetoond.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het kweken van dorsale en ventrale IPE's van salamanders.
- Het onderzoeken van de vermogens tot lensregeneratie van deze gekweekte cellen.
- Het bieden van een visuele demonstratie van de celkweek- en implantatietechnieken.
Gebruikte methoden
- Anesthesie en chirurgische verwijdering van de ogen van de salamander.
- Isolatie van IPE-cellen uit dorsale en ventrale irisfragmenten.
- In vitro kweek van IPE-cellen gedurende twee weken.
- Implantatie van geaggregeerde IPE-cellen in de ogen van ontvangende salamanders.
Belangrijkste resultaten
- Histologische analyse toonde succesvolle lensregeneratie aan vanuit dorsale IPE-implantaten.
- Er werd geen lensinductie waargenomen vanuit ventrale IPE-cellen, tenzij specifieke genen werden overgeëxpresseerd.
- De studie demonstreerde het belang van dorsale IPE's bij de lensvorming.
- Getransfecteerde IPE-cellen behielden hun morfologie en pigmentatie tijdens de cultuur.
Conclusies
- De vastgestelde methode is effectief voor het bestuderen van lensregeneratie bij salamanders.
- Verder onderzoek kan de genetische factoren verkennen die lensregeneratie beïnvloeden.
- Deze techniek kan helpen bij het begrijpen van regeneratieve processen in andere soorten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt mechanische risicoreductie van lensregeneratiepaden mogelijk door een reproduceerbaar in vitro systeem te bieden om de functie van gepigmenteerde iris-epitheelcellen in de dorsale versus ventrale regio te onderzoeken. Het ondersteunt doelwitvalidatie in de regeneratieve biologie door variabelen te isoleren die de transdifferentiatiecapaciteit bepalen. Het systeem biedt voorspellende waarde voor het prioriteren van genetische en moleculaire doelwitten in preklinische ontdekkingspijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het lensvormend vermogen van gekweekte dorsale en ventrale IPE-cellen te testen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk via reaggregatie- en implantatieassays die het in vivo regeneratiepotentieel recapituleren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolietriage door te identificeren welke genetische manipulaties de regeneratieve functie in ventrale IPE-aggregaten herstellen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gestandaardiseerde IPE-aggregaten die geschikt zijn voor downstream compound- of genetische screening in een ziekterelateerd systeem.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van lensinductie mogelijk als functionele readout na implantatie en genezing.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt workflows voor multi-well plating en aggregatie voor parallelle tests van experimentele condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert een regeneratief proces met een duidelijke dorso-ventrale polariteit, wat inzicht biedt in positionele signalen bij weefselherstel.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro cultuurbevindingen en in vivo resultaten via histologische validatie van lensvorming.
- Mechanistische risicovermindering: Verduidelijkt genspecifieke bijdragen aan regeneratie, zoals de rol van six3 en retinoïnezuur bij ventrale IPE-reprogrammering.
Integratie van pipeline & workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinische fase door hypothese-gestuurde validatie van regeneratiedoelen mogelijk te maken voordat men overgaat tot lead-optimalisatie of preklinische werkzaamheidsstudies.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door IPE-cellen te isoleren om het transdifferentiepotentieel onder gecontroleerde omstandigheden te testen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve aggregaten voor het beoordelen van genetische of farmacologische modifiers van lensregeneratie.
- Analytics: Genereert histologische eindpunten waarmee de regeneratieve capaciteit tussen experimentele groepen kan worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro fenotypes met in vivo weefselherstel, wat risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling ondersteunt.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van regeneratiemechanismen bij meerdere genetische of omgevingsperturbaties.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in de plasticiteit van iriscellen en vermindert ambiguïteit bij de validatie van targets voor regeneratie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare celkweek- en implantatieprocedures met gedefinieerde tijdlijnen van twee weken kweek en één maand genezing.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door te bevestigen of moleculaire interventies de regeneratieve functie herstellen in niet-permissieve celtypen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van hun vermogen om lensvorming te induceren in ventrale IPE-aggregaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie, weefseldissectie en steriele celverwerking voor irisisolatie en aggregatie.
- Afhankelijk van collagen-gecoate platen, L15-medium, trypsine en dissociatiereagentia voor een consistente opbrengst aan IPE-cellen.
- Noodzaak van gestandaardiseerde aggregatieprotocollen met behulp van kleurstof en gecontroleerde incubatie om reproduceerbare pelletvorming te garanderen.
- Vereist expertise in histologische verwerking en coupesnijden om de resultaten van lensregeneratie één maand na implantatie te beoordelen.
- Beperkt door de beschikbaarheid van salamander-exemplaren en de technische uitdaging van dorsaal-ventrale irisseparatie op basis van anatomische kenmerken.
