Name: A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Leer een eenvoudige hanging drop methode om 3D sferoïden te genereren voor het bestuderen van cel-cel interacties. Deze techniek biedt een snel alternatief voor traditionele methoden in de celbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur wil graag Dr Dongxuan Jia bedanken voor technische bijstand. Sommige van de beelden in dit artikel zijn in samenwerking met Dr Malcolm S. Steinberg, Afdeling Moleculaire Biologie, Universiteit van Princeton. De auteur wil ook het ministerie van Defensie Prostaatkanker Research Program (subsidies PC-030.482-en PC-991552) en de NCI / NIH (subsidie ​​R01CA118755) voor hun genereuze steun bedanken.

1. De voorbereiding van een enkele celsuspensie <ol><li> Hechtende celkweken moeten worden gekweekt tot 90% confluentie, dient waarna monolagen twee keer gespoeld met PBS. Na het aftappen goed, voeg 2 ml (voor 100 mm platen) van 0,05% trypsine-1 mM EDTA, en incubeer bij 37 ° C tot cellen los te maken. Stop trypsinisatie door toevoeging van 2 ml van compleet medium en voorzichtig gebruik van een 5 ml pipet op het mengsel vermaal tot de cellen in suspensie. Overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis. </li><li> Voeg 40 pi van een 10 mg / ml DNase voorraad en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Vortex kort en centrifugeer op 200 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Gooi supernatans en was pellet met 1 ml volledige weefselkweek medium. Herhalen, dan resuspendeer cellen in 2 ml van volledige weefselkweek medium. </li><li> Tel de cellen met behulp van een hemacytometer, of geautomatiseerde celgetalmeter en aan te passen concentratie 2,5 x 10 6 cellen / ml. Voor deze demonstratie een BioRad TC 10 geautomatiseerde cel tegen te gaan werd gebruikt. </li></ol> 2. Vorming van Opknoping Drops. <ol><li> Verwijder het deksel van een 60 mm weefselkweek schotel en plaats 5 ml van PBS op de bodem van de schotel. Deze zal fungeren als een hydratatie kamer. </li><li> Keer de deksel en gebruik een 20 ul pipet tot 10 pl druppels op de bodem van het deksel storting. Zorg ervoor dat de druppels zo genoeg van elkaar geplaatst, dat niet aanraken. Het is mogelijk om plaats minstens 20 druppels per schotel. </li><li> Omgekeerde het deksel op de PBS-gevulde onderste kamer en incubeer bij 37 ° C / 5% CO 2 / 95% luchtvochtigheid, toezicht op het dagelijks druppels en incubeer totdat cel platen of aggregaten hebben gevormd. Een stereo microscoop kan worden gebruikt om de totale formatie te beoordelen. </li><li> Eenmaal vellen vorm, kunnen ze worden overgebracht naar ronde bodem glas shaker kolven met 3 ml van compleet medium en geïncubeerd in een schuddend waterbad bij 37 ° C en 5% CO 2 tot sferoïden te vormen. </li></ol> 3. Opmerkingen <ol><li> Afhankelijk van de celgrootte, kan de concentratie moet up-of naar beneden worden aangepast. </li><li> Cellen kunnen worden gekleurd met membraan intercalerende fluorescente kleurstoffen voorafgaand aan de opknoping druppelvorming. </li><li> Twee verschillende soorten cellen kunnen verschillend worden gekleurd en gemengd in een 1:1 (of andere) verhouding voorafgaand aan de vorming van druppels opknoping. Deze kunnen kanker en stromale cellen, embryonale weefsels, of cellen genetisch gemanipuleerd om specifieke lijm handtekeningen. </li><li> Cellen kunnen worden losgemaakt uit weefselkweek gerechten met 0,05% trypsine / 2 mM calcium cadherine functie te behouden. </li><li> Afhankelijk van het experiment, kan papierformaten wordt gewaardeerd, of aggregaten kunnen worden gebruikt voor mechanische tests of andere biochemische of moleculaire analyse. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Blad of sferoïde formatie treedt meestal op binnen 24 uur maar kan langer duren afhankelijk van het celtype. Figuur 1 geeft beelden die na 18 uur incubatie van onbehandelde prostaatkanker MAT-LyLu (MLL) cellen in opknoping druppel cultuur (Figuur 1A) of cellen die werden behandeld met 25 micrometer MEK-inhibitor PD98059. Merk op dat Meki behandeling resulteert in een duidelijke verdichting van de cel vel. Verdichting kan worden gekwantificeerd door het meten van de grootte van 10-20 (of meer) opknoping daalt en het vergelijken van gemiddelde grootte tussen de behandelingsgroepen. We meestal analyseren van beelden met behulp van ImageJ software door drempelmethode elk beeld dan het omzetten van afbeeldingen naar binaire modus, waarna passen we analyse van deeltjes op het totale beeld gebied in pixels te onthullen. Dit kan vervolgens eenvoudig worden geconverteerd naar vierkante micron. Figuur 2 geeft een maat voor de vergelijking onbehandelde en Meki-behandelde MLL cellen. Zoals opgemerkt, Meki behandeling aanzienlijk vermindert papierformaat in vergelijking met Student's t-test (p &lt;0,0001). Voor deze vergelijking werden 10 aggregaten voor elk van de onbehandelde en behandelde cellen gemeten. Figuur 3 geeft een kuiken embryonale lever sferoïde gevormd na 24 uur in opknoping druppel cultuur en 2 dagen in een shaker bad. De opknoping druppel test kan ook worden aangepast om meer dan een type cel te onthullen van de ruimtelijke positionering aangenomen te nemen. Zo kan bijvoorbeeld chick embryonale levercellen worden geïsoleerd, gekleurd met een fluorescente membraan-intercalerende kleurstof en gemengd met chick embryonale hartcellen die zijn gekleurd met een verschillende fluorescerende marker. Figuur 4A toont aan dat in plaats van de resterende vermengd, lever en het hart cellen hebben de neiging om "sort-out" van een ander en neemt een bol-in-een-sfeer configuratie waarin het hart cellen zijn omgeven door levercellen. Deze configuratie kan worden verklaard door verschillen in de intercellulaire adhesie tussen de lever en het hart-cellen. Dit concept is gecodificeerd in de Differential Adhesion Hypothese die is gebruikt om de cellen uit te leggen sorteergedrag tussen embryonale kiemlaag weefsel voor amfibieën 3 en 4 teleost embryo's, voor de eilandjes van Langerhans cel organisatie 5 en voor celsortering tussen twee celpopulaties identieke in elk opzicht anders dan voor de expressie niveaus van hetzelfde type cadherine (6 en figuur 4B). Dit resultaat is vooral van belang voor het aantonen van hoe technisch een simpel verschil in hechting tussen celpopulaties kan resulteren in de vorming van organen structuur, bijvoorbeeld, een vijf eilandjes van Langerhans. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Beelden van cellen geïncubeerd in opknoping druppel cultuur voor 18 uur, hetzij in de afwezigheid (A) of aanwezigheid (B) van 25 micrometer van het MEK inhibitor PD98059. Beelden werden vastgelegd met behulp van een Nikon Eclipse TE 300 epifluorescentiemicroscoop en een Photometrics CoolSNAP ES digitale camera. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Kwantificering van Meki-geïnduceerde verdichting van de rat prostaatkanker MLL cellen. Opknoping druppel culturen van onbehandeld en Meki-behandelde MLL-cellen werden geïncubeerd gedurende 18 uur waarna de totale grootte werd bepaald zoals hierboven beschreven. Statistische analyse van de totale omvang werd door de Student's t-test. Het sterretje is een statistisch significant verschil in de totale omvang (P &lt;0,0001) tussen onbehandelde en Meki-behandelde cellen en suggereert dat Meki-behandeling resulteert in een aanzienlijk kleiner en compacter aggregaten. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Een sferoïde gevormd door incuberen chick embryonale levercellen in opknoping druppel cultuur voor 18 uur daarna in een incubator / schudden bad voor 48 uur. Deze opname werd gemaakt met een Nikon SMZ800 stereo microscoop en een zwarte Sony CCD-camera. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Opknoping druppel cultuur onthult sorteren-out gedrag tussen verschillende celtypen. In paneel A, werden chick embryonale levercellen gekleurd met PKH-2 membraan intercalerende kleurstof en gemengd in gelijke delen met PKH-26-lood chick embryonale hartcellen. In paneel B, werden twee N-cadherine-getransfecteerde L cel klonen (LN4 en LN2a) uitdrukken en N-cad op hun oppervlakken in de verhouding van 2.4:1, ook gekleurd met de fluorescerende kleurstoffen membraan intercalerende PKH-2 en PKH-26 , (Sigma-Aldrich), gemengd in gelijke delen en gekweekt zoals opknoping daalt 7. Na 18 uur in cultuur, werden overgebracht naar cel lakens schudden kolven en geïncubeerd voor een ander 48 uur. Aggregaten werden vastgesteld in 2% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing en bekeken worden met een BioRad MRC600 scanning laser confocale microscoop systeem gekoppeld aan een Nikon Optiphot-2 microscoop. Optische secties van zowel groene en rode kanalen werden verzameld en een Silicon Graphix Crimson VGX werkstation uitgerust met Vital Images Voxel Bekijk Ultra imaging software werd gebruikt om valse kleuren toe te wijzen aan beide kanalen en om de beelden samen te voegen, waaruit de gegenereerde anatomische configuraties. (A) confocale optische gedeelte door middel van een aggregaat te tonen omsingeling van het hart cellen (hier in een pseudo-kleur geel) door de lever cellen in pseudocolor blauw (uit 8). (B) Confocale optische gedeelte door middel van een aggregaat te tonen omsingeling van hoge N-cadherine expressie brengende cellen (groen) door die uitdrukken lagere niveaus van N-cadherine (rood) (vanaf 6).

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signaling%3A+tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-layer+surface+tensions+and+%26quot%3Btissue+affinities%26quot%3B+in+Rana+pipiens+gastrulae%3A+quantitative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-layer surface tensions and &quot;tissue affinities&quot; in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements.</a> Dev Biol. 192, 630-644 (1997).</li>
<li>Schotz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP J. 2, 42-56 (2008).</li>
<li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li>
<li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+adhesion+hypothesis%3A+a+direct+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li>
<li>Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+casein+kinase+2+subunits+in+Chinese+hamster+ovary+and+3T3+L1+cells+provides+information+on+the+role+of+the+enzyme+in+cell+proliferation+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle.</a> J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).</li>
<li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+bottlenecks+of+bioreactors+in+3D+cell+culture+and+tissue+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing.</a> Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).</li>
<li>Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+wound+contraction%3A+collagen+organization%2C+fibroblasts%2C+and+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts.</a> Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+biology+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices.</a> Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).</li>
<li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+beta1-integrin+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+three-dimensional+basement+membrane+breast+cultures%3A+a+different+perspective+in+epithelial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).</li>
<li>Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+apoptosis+by+basement+membrane+requires+three-+dimensional+tissue+organization+and+withdrawal+from+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).</li>
<li>Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+by+hyaluronidase+of+adhesion-dependent+multicellular+drug+resistance+in+mammary+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells.</a> J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).</li>
<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+structure%2C+nuclear+organization%2C+and+gene+expression+in+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast.</a> Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).</li>
<li>Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+tumor+spheroid+in+a+microgravity+environment+as+a+3D+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).</li>
<li>Napolitano, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+three-dimensional+cell+culture+utilizing+micromolded+nonadhesive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Biotechniques. 43, 494-496 (2007).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).</li>
</ol>

Studies hebben aangetoond dat het kweken van cellen in een drie-dimensionale context (3D) verschillende cellulaire morfologie en signalering in vergelijking met een stijve tweedimensionale (2D) cultuur-systeem 9 produceert. Bijvoorbeeld, fibroblast-bevolkte collageen gels aan te tonen dat fibroblasten morfologie in 3D is zeer verschillend van die in 2D 10,11. Op dezelfde manier kan 3D-cultuur induceren weefsel-specifieke differentiatie van mamma-epitheliale cellen. 3D-cultuur systemen zijn gebruikt...

<ul><li> automatische celgetalmeter (BioRad TC 10) </li><li> schudwaterbad met CO 2 gevel te dekken Model 3540 (Lab-line) </li></ul>

a simple opknoping drop cultuur van de cel protocol voor het genereren van 3d-sferoïden

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies van cel-cel cohesie en cel-substraat adhesie hebben in het verleden zijn uitgevoerd op monolaagculturen aanhanger van stijve substraten. Cellen in een weefsel, maar zijn meestal verpakt in een dicht op elkaar gepakte massa weefsel waarbij de cellen intieme verbindingen tot stand met de vele bijna-buren en met de extracellulaire matrix componenten. Dienovereenkomstig, de chemische milieu en fysieke krachten ervaren door cellen in een 3D-weefsel zijn fundamenteel anders dan die ervaren door cellen gekweekt in monolaag cultuur. Dit is aangetoond dat duidelijk invloed cellulaire morfologie en signalering. Verschillende methoden zijn ontwikkeld om 3D-celculturen waaronder inkapseling van de cellen in collageen gels 1 of in biomateriaal steigers 2 te genereren. Dergelijke methoden, hoewel nuttig, niet herhalen het intieme direct cel-cel adhesie architectuur gevonden in de normale weefsels. Integendeel, zij nauwer bij benadering cultuur-systemen waarin de afzonderlijke cellen zijn losjes verspreid in een 3D-meshwork van ECM-producten. We beschrijven hier een eenvoudige methode waarin cellen zijn geplaatst in opknoping druppel cultuur en geïncubeerd onder fysiologische omstandigheden totdat ze vormen echte 3D-sferoïden waarin de cellen zijn in direct contact met elkaar en met de extracellulaire matrix componenten. De methode vereist geen speciale apparatuur en kan worden aangepast aan de toevoeging van een biologisch middel in zeer kleine hoeveelheden die mogelijk van belang zijn in het ontrafelen van effecten op cel-cel of cel-ECM interacties te nemen. De methode kan ook worden gebruikt om de co-cultuur twee (of meer) verschillende cel populaties om zo de rol van cel-cel of een cel-ECM interacties in het specificeren van ruimtelijke relaties tussen de cellen toe te lichten. Cel-cel cohesie en cel-adhesie ECM zijn de hoekstenen van de studies van de embryonale ontwikkeling, tumor-stromale cel interactie in kwaadaardige invasie, wondgenezing, en voor toepassingen op tissue engineering. Deze eenvoudige methode zal een middel van het genereren van weefsel-achtige cellulaire aggregaten voor het meten van de biomechanische eigenschappen of voor moleculaire en biochemische analyse in een fysiologisch relevante model.

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Studies naar cel-celcohesie en cel-substraatadhesie zijn historisch gezien uitgevoerd op monolaagculturen die aan rigide substraten hechten. Cellen ...

Het doel van dit experiment is om 3D weefselachtige sferoïden te genereren. Dit wordt bereikt door eerst gecultureerde cellen te oogsten en vervolgens een suspensie van enkelvoudige cellen te maken. Vervolgens worden druppels van de celsuspensie aangebracht op de onderzijde van het omgekeerde deksel van een weefkweekschaal.Vervolgens wordt het deksel omgekeerd op de hydratatiekamer geplaatst. De laatste stap is om de hangende druppels 24 tot 48 uur te incuberen, zodat aggregaten kunnen vormen. Deze kunnen vervolgens worden overgebracht naar een schuddend waterbad en tot vijf dagen langer worden geïncubeerd.Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die verschillen in aggregaatcohesie of cel sortering aantonen via compactie-assays, weefseloppervlakte-symmetrie of epiflorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele 2D-weefselkweek, is dat cellen die in 3D zijn gekweekt de cellulaire interacties die cellen in een weefselomgeving ervaren, nauwkeuriger nabootsen. Ik zal deze methode demonstreren om aan te tonen dat deze zo eenvoudig is dat zelfs een PI het kan.Om dit experiment te beginnen, oogst adhesioncellen bij een confluentie van 90%. Aspireer eerst het kweekmedium en spoel de cellaag twee keer met PBS. Aspireer vervolgens de PBS en pipetteer twee milliliters van een 0,05% trypsin-EDTA-oplossing op de monocultuurlaag.Plaats de plaat in de weefselkweekincubator op 37 °C en incubeer totdat de cellen loslaten. Neem vervolgens de plaat uit de incubator en stop de enzymatische werking door twee milliliter compleet medium toe te voegen.Gebruik een pipet van vijf milliliter om het mengsel te tritureren totdat de cellen volledig in suspensie zijn. Breng de celsuspensie vervolgens over in een conische buis van 15 milliliter. Pipetteer 40 µL van een DNA-oplossing van 10 mg/mL in de celsuspensie en incubeer dit gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur na de incubatie.Vortex de celstuspensie kort en centrifugeer vervolgens bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Zodra de centrifugatie is voltooid, wordt het S-supernatans afgezogen en weggegooid, waarna de pellet wordt geresuspendeerd in één milliliter compleet medium om te wassen. Herhaal de centrifugatie en resuspendeer de pellet in één milliliter compleet medium.Voer vervolgens een celtelling uit met een automatische celteller of een hemocytometer. Pas de celsuspensie met medium aan tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 × 10⁶ cellen per milliliter. Ga daarna over tot de vorming van hangende druppels.Bereid een hydratatiekamer voor door het deksel van een weefkweekschaal van 60 millimeter te verwijderen en vijf milliliters PBS in de bodem van de schaal te pipetteren. Keer het deksel van de schaal om en pipetteer tot 2010 microliter druppels cel-suspensie op de onderzijde van het deksel. Zorg ervoor dat de druppels voldoende uit elkaar worden geplaatst zodat ze elkaar niet raken.Plaats het deksel met de druppelculturen voorzichtig terug op de bodem van de schaal met PBS. Plaats de cultuurplaat in een weefselkweekincubator. Stel deze in op 37 °C, 5% koolstofdioxide en 95% luchtvochtigheid en incubeer gedurende de nacht.Controleer de druppels dagelijks en zet de incubatie voort totdat er cellagen of aggregaten zijn gevormd. Zodra cellagen of aggregaten zijn gevormd, worden deze overgebracht naar glazen kolfjes met een ronde bodem die drie milliliters compleet medium bevatten. Incubeer de kolfjes met de cellagen of aggregaten in een schuddend waterbad.Houd dit gedurende ongeveer 24 uur op 37 °C en 5% koolstofdioxide, totdat de vorming van steroïden onder een dissectiemicroscoop zichtbaar is. Zodra de steroïden zijn gevormd, kan het effect van experimentele manipulaties op de steroïdevorming worden gekwantificeerd volgens de procedure die in het schriftelijke protocol is beschreven. Daarnaast kan de membraanintercalatie van eventuele eerder toegevoegde fluorescerende kleurstoffen nu worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie.Deze brightfield-microscoopafbeelding demonstreert de aggregatie van rat prostaatkanker MLL-cellen na 18 uur incubatie met behulp van de hanging drop-methode. Deze afbeelding toont een tweede aggregaat van MLL-cellen dat is gevormd na 18 uur cultuur met gebruik van de hanging drop-methode. Deze cellen werden gekweekt in de aanwezigheid van 25 micromolar van de MEK-remmer PD 9 8 0 5 9, wat resulteerde in een aanzienlijk compacter aggregaat van cellen.Hier wordt het verschil in aggregaatgrootte aangetoond tussen een MLL hanging drop-cultuur behandeld met een MEK-remmer en een onbehandelde controleaggregaat. Het asteriskteken geeft een statistisch significant verschil aan van P kleiner dan 0,0001. Zoals bepaald door een student T-test tussen onbehandelde en met een MEK-remmer behandelde aggregaten, suggereert dit dat behandeling met een MEK-remmer resulteert in significant kleinere en compactere aggregaten.Deze afbeelding is vastgelegd met een Nikon Smz 800 stereomicroscoop en illustreert een steroïde gevormd door het incuberen van embryonale levercellen van kuikens in een hangende-druppelcultuur gedurende 18 uur, gevolgd door 48 uur in een schuddend waterbad bij 37 °C. Deze confocale microscopische afbeelding demonstreert het sorteergedrag dat optreedt wanneer bepaalde celpopulaties samen worden gekweekt met de hangende-druppelmethode; voordat er werd overgegaan tot de hangende-druppelcultuur, werden de embryonale levercellen van kuikens gekleurd met pkh two membraan-intercoatingkleurstof en embryonale cellen van kuikens.Hartcellen werden gekleurd met PKH 26. De cel-suspensies werden vervolgens gemengd en via de hanging drop-methode aangebracht. De cultuur werd gedurende 18 uur uitgevoerd, gevolgd door een incubatie van 48 uur in een schuddend waterbad bij 37 °C.Uit de optische sectie is te zien dat de geelgekleurde hartcellen zijn omgeven door levercellen. Hier in het blauw pseudo-gekleurd, twee nardi- en getransfecteerde L-celklonen die NCA op hun oppervlakken tot expressie brengen. In een verhouding van 2,4 op één werden deze gekleurd met de fluorescerende membraan-intercalerende kleurstoffen PKH 2 en PKH 26, gemengd in gelijke proporties, en gekweekt als hangende druppels zoals eerder beschreven.In dit voorbeeld zijn de cellen die veel e-cadherine tot expressie brengen, welke groen zijn gekleurd, omringd door cellen die lagere niveaus van e-cadherine tot expressie brengen, welke rood zijn gekleurd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 30 minuten of minder worden uitgevoerd, mits deze correct wordt toegepast.

a-simple-hanging-drop-cell-culture-protocol-for-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Spheroids are a type of 3D cell culture model used to more accurately represent a cell’s environment compared to 2D cell culture monolayer models. In the example protocol, we will see scientists generate spheroids from a colorectal cancer cell line and apply live-cell imaging to track the spheroids’ growth.

Spheroid Generation from Cell Lines: A Three-Dimensional (3D) Cell Culture Method

This video describes the technique of generating three-dimensional spheroids via the hanging drop method using melanoma cells. The generated in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may give insights into intra-tumoral...

Hanging Drop Method: A Technique to Generate 3D Melanoma Spheroids

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Hier beschrijven we een snel en flexibel protocol voor de vorming van 3D-celsferoïden door celaggregatie. Dit is gemakkelijk aanpasbaar voor meerdere celtypen en is geschikt voor gebruik in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder celmigratie, invasie of anoikis-assays, en voor het visualiseren en kwantificeren van cel-matrix interacties.

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Hier presenteren we een aantal eenvoudige methoden voor de evaluatie van de levensvatbaarheid en de dood in 3D kanker cel sferoïden, die de fysisch-chemische gradiënten van in vivo tumoren veel beter dan de 2D-cultuur na te bootsen. Het sferoïde model maakt het dus mogelijk om de effectiviteit van kanker medicijnen te evalueren met een verbeterde vertaling naar in vivo omstandigheden.

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

We presenteren een centrifugale microfluïdisch apparaat met motoraandrijving dat celsferioïden kan cultiveren. Met behulp van dit apparaat kunnen sferoïden van enkelvoudige of meervoudige celtypen gemakkelijk onder hoge zwaartekracht worden gecocultureerd.

Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids

Het huidige protocol beschrijft een techniek om op grote schaal en kosteneffectief weefselsferoïden te produceren met behulp van een 3D-geprint stempelachtig apparaat.

Genereren van weefselsferoïden via een 3D-geprint stempelachtig apparaat

We presenteren een protocol voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden en hun fenotypische karakterisering met behulp van beeldopname en proteomics.

Semi-geautomatiseerde fenotypische analyse van functionele 3D-sferoïde celculturen

Deze studie presenteert een kosteneffectieve en efficiënte methodologie voor het genereren van 3D-celstructuren met behulp van een op stempels gebaseerd systeem om microwells in agaroseschimmels te maken. Het systeem bevordert de vorming van uniforme sferoïden/organoïden, waardoor de celinteracties worden verbeterd. Deze aanpak vermindert de experimentele variabiliteit en ondersteunt toepassingen in het testen van geneesmiddelen en weefselmanipulatie.

Generatie van driedimensionale sferoïden/organoïden uit tweedimensionale celculturen met behulp van een nieuw stempelapparaat

Leer een eenvoudige hanging drop methode om 3D sferoïden te genereren voor het bestuderen van cel-cel interacties. Deze techniek biedt een snel alternatief voor traditionele methoden in de celbiologie.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Meer video's verkennen