A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Het doel van dit experiment is om 3D weefselachtige structuren te genereren. Dit wordt bereikt door eerst gekweekte cellen te oogsten en vervolgens een enkelcellesuspensie te maken. Vervolgens worden druppels van de celsuspensie aangebracht op de onderzijde van het omgekeerde deksel van een weefselkweekschaal.

Vervolgens wordt het deksel omgedraaid op de hydratatiekamer geplaatst. De laatste stap is om de hangende druppels 24 tot 48 uur te incuberen om de vorming van aggregaten mogelijk te maken. Deze kunnen vervolgens worden overgebracht naar een schuddend waterbad en tot vijf dagen langer worden geïncubeerd.

Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die verschillen in aggregaatcohesie of cel-sortering aantonen via compactie-assays, weefseloppervlak 10-symmetrie of epifluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele 2D-weefselkweek, is dat cellen die in 3D groeien de cellulaire interacties die cellen in een weefselomgeving ervaren nauwkeuriger nabootsen. Ik zal deze methode demonstreren om te laten zien dat deze zo eenvoudig is dat zelfs een PI het kan uitvoeren.

Om dit experiment te starten, worden adherente cellen geoogst bij een confluentie van 90%. Aspireer eerst het kweekmedium en spoel de cellaag twee keer met PBS. Aspireer vervolgens de PBS en pipetteer twee milliliters van een 0,05%trypsine-EDTA-oplossing op de monocultuurlaag.

Plaats de plaat in de weefselkweekincubator op 37 graden Celsius en incubeer tot de cellen loslaten. Verwijder vervolgens de plaat uit de incubator en stop de enzymatische werking door twee milliliter compleet medium toe te voegen.

Gebruik een pipet van 5 mL om het mengsel te tritueren totdat de cellen volledig in suspensie zijn. Breng de celсусpensie vervolgens over in een conische buis van 15 mL. Pipetteer 40 µL van een DNA-oplossing van 10 mg/mL in de celsuspensie en incubeer dit gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur na de incubatie.

Vortex de celsuspensie kort en centrifugeer vervolgens bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Zodra de centrifugatie is voltooid, wordt het S-supernatans geaspireerd en weggegooid, waarna de pellet wordt geresuspendeerd in één milliliter volledig medium om te wassen. Herhaal de centrifugatie en resuspendeer de pellet in één milliliter volledig medium.

Voer vervolgens een cel telling uit met behulp van een automatische cel teller of een hemocytometer. Pas de celsuspensie met medium aan tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 x 10⁶ cellen per milliliter. Ga daarna over tot de vorming van hangende druppels.

Bereid een hydratatiekamer voor door het deksel van een weefkweekschaal van 60 millimeter te verwijderen en vijf milliliters PBS op de bodem van de schaal te pipetteren. Keer het deksel van de schaal om en pipetteer tot 2010 microliter druppels celstussy op de onderkant van het deksel. Zorg ervoor dat de druppels voldoende uit elkaar worden geplaatst zodat ze elkaar niet raken.

Plaats het deksel met de druppelculturen voorzichtig terug op de bodem van de schaal met PBS. Plaats de kweekplaat in een weefselkweekincubator. Stel deze in op 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid en incubeer gedurende de nacht.

Controleer de druppels dagelijks en zet de incubatie voort totdat er cellagen of aggregaten zijn gevormd. Zodra de cellagen of aggregaten zijn gevormd, worden deze overgebracht naar glazen schudkolfjes met een ronde bodem die drie milliliters compleet medium bevatten. Incubeer de kolfjes met de cellagen of aggregaten in een schudwaterbad.

Houd dit gedurende ongeveer 24 uur op 37 °C en 5% koolstofdioxide tot de vorming van steroiden onder een dissectiemicroscoop kan worden gevisualiseerd. Zodra de steroiden zijn gevormd, kan het effect van experimentele manipulaties op de steroidvorming worden gekwantificeerd volgens de procedure die is beschreven in het schriftelijke protocol. Daarnaast kan de membraanintercalatie van eventueel eerder toegevoegde fluorescente kleurstoffen nu worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Deze brightfield-microscoopafbeelding demonstreert de aggregatie van rat prostaatkanker-MLL-cellen na 18 uur incubatie met gebruik van de hanging-drop-methode. Deze afbeelding toont een tweede aggregaat van MLL-cellen dat is gevormd na 18 uur cultuur met gebruik van de hanging-drop-methode. Deze cellen werden gekweekt in de aanwezigheid van 25 micromolar van de MEK-remmer PD 9 8 0 5 9, wat resulteerde in een aanzienlijk compacter aggregaat van cellen.

Hier wordt het verschil in aggregaatgrootte aangetoond tussen een MLL hanging drop-cultuur behandeld met een MEK-remmer en een onbehandelde controle-aggregaat. Het asteriskteken staat voor een statistisch significant verschil van P minder dan 0,0001. Dit is bepaald via een student-t-toets tussen de onbehandelde en de met een MEK-remmer behandelde aggregaten, wat suggereert dat behandeling met een MEK-remmer resulteert in significant kleinere en compactere aggregaten.

Deze afbeelding is vastgelegd met een Nikon Smz 800 stereomicroscoop en illustreert een steroïde die is gevormd door kiemlevercellen van kuikens 18 uur lang te incuberen in een hanging drop-cultuur. Vervolgens volgde een incubatie van 48 uur in een schuddend waterbad bij 37 degrees Celsius. Deze confocale microscopie-afbeelding demonstreert het sorteringsgedrag dat optreedt wanneer bepaalde celpopulaties samen worden gekweekt met de hanging drop-methode voordat men overgaat tot hanging drop-cultuur; de kiemlevercellen van kuikens werden gekleurd met pkh two membraanintercoating-kleurstof en kuikenembryonale.

Hartcellen werden gekleurd met PKH 26. De celsuspensies werden vervolgens gemengd en via de hanging-drop methode uitgeplaatst. De cultuur werd gedurende 18 uur uitgevoerd, gevolgd door 48 uur incubatie in een schuddend waterbad bij 37 °C.

Uit de optische doorsnede is te zien dat de geelgekleurde hartcellen zijn omgeven door levercellen. Hier zijn, in blauw gepseudogekleurd, twee nardi en getransfecteerde L-celklonen te zien die NCA op hun oppervlakken tot expressie brengen. Deze werden in een verhouding van 2,4 op één gekleurd met de fluorescerende membraan-intercalerende kleurstoffen PKH 2 en PK H 26, gemengd in gelijke proporties, en gekweekt als hangende druppels zoals voorheen.

In dit voorbeeld zijn de cellen met een hoge expressie van cadian, die groen zijn gepseudokleurd, omringd door cellen met een lagere expressie van en cadian, die rood zijn gepseudokleurd. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 30 minuten of minder worden uitgevoerd, mits deze correct wordt uitgevoerd.