Impulsief druk zetten van neuronale cellen voor Traumatic Brain Injury Study

Het algemene doel van deze procedure is het toedienen van en het observeren van impulsieve overdruk op gekweekte hersencellen voor onderzoek naar traumatisch hersenletsel. Dit wordt bereikt door eerst neurale differentiatie van de cellen te induceren met behulp van retinoïnezuur. Vervolgens worden de neurale cellen in het cellen-pressurisatieapparaat op basis van de ksky bar geplaatst en blootgesteld aan impulsieve druk met een magnitude en duur die relevant zijn voor blast-geïnduceerd traumatisch hersenletsel.

Tot slot worden de cellen onderworpen aan molecuulbiologische assays om celbeschadigingen en mogelijke mechanismen van traumatisch hersenletsel te evalueren. De resultaten van de microscopische inspectie tonen neuronale celdood en structureel verlies van axonale neurieten bij een impulsieve overdruk van 2 megapascal en een duur van 0,7 milliseconde. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals vloeistofpercussie, is dat er geen secties met negatieve druk zijn en dat de tijdsduur nauwkeurig wordt gecontroleerd.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van traumatisch hersenletsel (TBI), zoals de drempelwaarde voor neurocellulaire sterfte of letsel als functie van impulsdruk, grootte, duur en belastingsvorm. Hoewel deze methode binnen onze groep tot nu toe is gebruikt om blast-geïnduceerde TBI te bestuderen, kan deze ook worden toegepast op andere typen traumatisch hersenletsel, zoals impact-geïnduceerde TBI. De procedure wordt gedemonstreerd door Matthew, een promovendus uit het laboratorium van Professor Chen fang, en door li ha, een technicus uit mijn laboratorium.

In dit experiment wordt een Ksky-stang gebruikt als apparaat voor celpressurisatie. Het apparaat bestaat uit twee aluminiumlegeringstangen van zes meter die zijn opgehangen door uitgelijnde messing lagers met een in vitro celpressurisatiekamer. De celpressurisatiekamer, die tussen de stangen is geplaatst, bestaat uit een zuilercilinder.

De cilinder heeft een klein gat in de bodem van de holte, dat tijdens de installatie van het celmonster lucht en overtollige vloeistof afvoert. De zuiger is gemaakt van dezelfde buis als de staaf en is omwikkeld met twee of drie lagen Teflon-tape. De eindkap bevestigt de glazen dekglasjes met twee kleine roestvrijstalen schroeven.

Deze demonstratie maakt gebruik van SH SY five Y menselijke neuroblastoomcellen. Het protocol is echter toepasbaar op veel verschillende celcultuurmodellen. De cellen bevinden zich op glazen dekglasjes met een diameter van 18 millimeter bij een dichtheid van 3000 cellen per vierkante centimeter.

Tijdens de incubatie in aangevuld DMEM wordt de differentiatie van de cellen geïnduceerd door het medium gedurende zeven dagen aan te vullen met 10 micromolar retinoïnezuur, waarbij het medium elke twee dagen wordt ververst. Op de zevende dag vertonen de cellen een goed ontwikkelde neuriet-axonale structuur en zijn ze klaar om onder druk te worden gezet. Steriliseer alle onderdelen van de drukkamer met een autoclaaf en bewaar deze onder UV-licht tijdens het assembleren van de kamer.

Zorg in een steriele werkbank ervoor dat de ventilatieschroef in de kamer losjes in de luchtafvoer is gedraaid. Vul de kamer aan de basis van de holte met vers bereid warm groeimedium. Schroef vervolgens een glazen objectglas met cellen op de dop van de zuiger, met de cellen naar buiten gericht, en plaats de zuiger voorzichtig in de holte van de kamer.

Verwijder de ontluchtingsschroef, kantel de ontluchting omhoog en duw de zuiger in de kamer tot een eerder bepaalde referentielijn. Dit laat een vloeistofdiepte van ongeveer zes millimeter over in de celdrukkamer. Vermijd het introduceren van bellen, desinfecteer de ontluchtingsschroef en plaats deze terug om de kamer waterdicht te maken.

De kamer mag niet lekken onder de statische belasting. Reset het Ksky bar-systeem. Verplaats de zware massa terug naar de oorspronkelijke positie en plaats de vergrendelingsbout terug.

De vergrendelingsbout oefent een klemkracht uit die beweging van de incidentstaaf voorkomt totdat de pennen breken. Zet de nieuwe vergrendelingsbout met de hydraulische krik aan tot ongeveer 200 PSI. Gebruik de schaarkrik om het voorspanningsgedeelte van de incidentstaaf samen te drukken tot een druk die iets hoger ligt dan de gewenste waarde, en draai deze vervolgens iets terug om de volledige wrijving van de JAK-schroef te benutten. Stel nu de gegevensacquisitie in, aangezien de drukopbouw ongeveer een milliseconde duurt.

Stel een bemonsteringsfrequentie van één megahertz in met behulp van 2000 ohm rekstrookjes in een Wheatstone-brugschakeling. De spanning moet worden ingesteld op 45 volt bij de zendstaaf. Monteer de celkamer met de zuiger naar de zendstaaf gericht.

Plaats de celkamer in een V-blok dat wordt ondersteund door de kleine laboratoriumschaarhef en uitgelijnd is met de twee stangen. Smeer elke interface licht in en verwijder eventuele lucht tussen de contactoppervlakken door deze voorzichtig tegen elkaar te wrijven. Het systeem is nu voorbereid.

Activeer de gegevensacquisitie en voer de test uit door snel op de hydraulische klembediener te pompen. Hierdoor breekt de vergrendelingsbout, waardoor de klem loskomt en er een drukgolf naar de cellen wordt overgebracht. Verwijder na de test de slide uit de kamer in een steriele werkbank en ga over tot het beoordelen van het celgedrag.

Met ervaring kan het apparaat worden gebruikt om ongeveer negen cellenhulpstukken per uur onder druk te zetten. Bij het analyseren van de uitlezing kunnen luchtbel-fouten optreden aan het begin van het verzonden staafsignaal, hoewel deze in deze demonstratie niet zichtbaar zijn.

Als de transmissiebalk voldoende lang is, moeten de belangrijkste gegevens beginnen bij de eerste verstoring en eindigen waar de metingen een negatieve druk vertonen; deze spanningsmeting is proportioneel aan de door de cellen ondergane stress via rekstrookanalyse. De duur van de verzonden puls kan korter zijn dan die van de invallende puls. Als er een kleine bel lucht gevangen zit in de vloeistof binnen de drukkamer van de cel, kan de amplitude van de verzonden puls die van de invallende puls niet overschrijden, maar deze moet een voldoende lang plateau vertonen vóór de ontlasting.

Anders is er ofwel een grote luchtbel ingesloten in de verzegelde kamer, of de assemblage en de staaf zijn niet correct uitgelijnd. Na de drukopbouw kunnen de cellen onmiddellijk worden geïnspecteerd of verder worden geïncubeerd voor latere analyse. Vergelijk de onder druk gezette cellen met de controlecellen in de kamer, die op identieke wijze zijn behandeld maar niet zijn blootgesteld aan druk, om veranderingen in de neurietenlengte met optische microscopie te beoordelen op verschillende tijdstippen na de incubatie.

Actine-immunofluorescentiekleuring kan worden gebruikt om veranderingen in het cytoskelet te beoordelen. Daarnaast kan een antilichaam tegen microtubule-geassocieerd proteïne twee (MAP2) worden gebruikt om veranderingen in een van de belangrijkste neuronale markers te visualiseren.

Om het effect van impulsieve overdruk op de expressie van neuronale en apoptotische genen te beoordelen, kunnen indien gewenst standaard moleculair-biologische technieken zoals R-T-P-C-R worden gebruikt. Voldoende cellysaten voor immunoblotting kunnen worden verzameld uit meerdere identiek onder druk gezette celmonsters. In dit voorbeeld van het overdrukprofiel heeft het ksky bar-apparaat succesvol een enkelvoudige impulsieve drukpuls van twee megapascal met een duur van ongeveer 0,7 milliseconde toegepast op de gecultiveerde neuronale cellen, zoals te zien is in de beelden van de optische microscoop; SHSY vijf Y menselijke neuronale cellen die aan een impulsieve druk van twee megapascal werden blootgesteld, vertonen een duidelijke afbraak van neurite-axonen in vergelijking met niet onder druk gezette controlecellen.

Bij het uitvoeren van deze procedure moet de vloeistofdrukkamer altijd op deze manier worden vastgehouden en nooit op de andere manier, omdat de cellen anders na de ontwikkeling aan negatieve druk worden blootgesteld. Deze techniek heeft onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen in staat gesteld om het celmechanisme van traumatisch hersenletsel te onderzoeken onder gecontroleerde drukomstandigheden. Wij danken het Army UNL Center for Trauma Mechanics voor de financiële ondersteuning.