Name: Impulsief druk zetten van neuronale cellen voor Traumatic Brain Injury Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer impulsieve druktoepassing op neuronale cellen voor traumatisch hersenletselonderzoek met een Kolsky-barapparaat. Deze methode maakt gecontroleerde druktoepassing mogelijk om celreacties en letselmechanismen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag de financieringsbronnen bedanken: Army-UNL Center for Trauma Mechanica (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr Namas Chandra), UNL Layman Award (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).

1. Neuronal Cell Culture <ol><li> Hersencellen waaronder neuronale cellen, astrocyten, en hun co-cultuur kan worden gebruikt als een cel model. Als haalbaarheid demonstratie, is impulsief onder druk van cel-lijn neuronale cellen gepresenteerd. </li><li> SH-SY5Y menselijke neuroblastoomcellen (ATCC, CRL-2266) gekweekt op 18 mm dekglaasjes diameter. Cellen worden uitgezaaid bij een dichtheid van 3 x 10 3 cellen / cm 2 met de groeimedia uit DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine. Cell gekweekte glazen dia's worden bewaard in een 5% CO 2 bevochtigde incubator bij 37 ° C. </li><li> Om de neuronale cel differentiatie van SH-SY5Y cellen te verkrijgen, cellen werden behandeld met media verder aangevuld met 10 pM retinolzuur (RA) gedurende 7 dagen met media veranderd elke twee dagen. Op dag 7 cellen bereid onder druk. </li></ol> 2. Overdruk Uitrusting: Kolsky Bar <ol><li> De Kolsky bar, dewikkeld door Kolsky 1 in 1949, is gebruikt om de mechanische eigenschappen van een materiaal te meten op een zeer hoge belasting tarief. De inrichting bestaat uit twee staven met een monster in contact tussen de spijlen. Een drukgolf, gemaakt op het incident bar, propageert naar het monster waar de golf zich opsplitst in een gereflecteerde en doorgelaten golf. De spanning in het monster is evenredig aan de doorgelaten golf. In deze studie hebben we gebruik maken van een cel onder druk kamer worden geplaatst tussen de twee bars van de Kolsky set-up. </li><li> De twee aluminium staven (elk 6-m lang) worden geschorst door uitgelijnd messing lagers, en een in vitro cel onder druk kamer wordt ingeklemd tussen de balken. De upstream bar is het incident bar met een 130 pond massa geklemd ene uiteinde. Een wrijving klem wordt geplaatst op een positie die de gewenste pulsduur geven. Door het inschakelen van de klem en aandraaien van een schaar jack tussen de massa en een steunvel, de klem-sectie massa van het incident bar pre-compressed op het gewenste niveau. Waardoor een getande bout die de klem blokkeert een plotselinge breuk met een hydraulisch systeem geeft de vooraf opgeslagen compressie snel en brengt derhalve een drukpuls. Deze plant zich voort door het incident bar, drijft de testkamer zuiger, en onder druk van de vloeistof en cellen in de kamer impulsief. De kamer onder druk beurt zet een drukpuls voortplant in de downstream uitgezonden bar. De stammen die geassocieerd zijn met de druk pulsen in de bars worden gemeten met de samengestelde hoge weerstand rekstrookjes enthousiast tot 45 volt. De meter signalen worden opgenomen met een digitale oscilloscoop bij 1 MHz frequentie als een laad-geschiedenis. </li><li> De in vitro cel onder druk kamer bestaat uit een zuiger-cilinder. De cilinder heeft 2,6 cm binnendiameter en buitendiameter 3,8 cm, en heeft een gaatje afgetapt aan de basis van de holte. Het gat dient als een lucht-en overtollig vocht ventilatie tijdens celmonster installatie. De zuiger is 7,5 cm langen is gemaakt van hetzelfde materiaal bar. De zuiger is omwikkeld met twee tot drie lagen (Teflon) loodgieter tape die als lage wrijving afdichting. De eindkap is 32 mm lang en heeft twee kleine roestvrij stalen schroeven die de dekglaasjes (waarop cellen worden gekweekt) veilig tijdens het laden. </li></ol> 3. Impulsief druk zetten van neuronale cellen <ol><li> Alle onder druk kamer delen worden gesteriliseerd met behulp van de autoclaaf en worden gehouden onder UV-licht. Het samenstel van de kamer wordt uitgevoerd binnen de celkweek kap. De ontluchtingsschroef in de kamer wordt losjes betrokken bij de ontluchter aan de basis van de holte. Voorverwarmde (37 ° C) vers groeimedium wordt gepipetteerd in de kamer zonder luchtbellen. Vervolgens wordt een cellenkweek glasplaatje opgehaald en geplaatst op de dop van de zuiger (cellen naar buiten). De kleine bevestigingsschroeven worden vastgezet op de glijbaan te houden op zijn plaats. De zuiger met een cellenkweek glasplaatje toegevoegd iets into de holte van de kamer, en het samenstel wordt gekanteld dat de ontluchting op het hoogste punt. De ontluchtingsschroef wordt verwijderd en de zuiger wordt gedrukt in de holte eerste verdringen luchtbellen wordt de overtollige vloeistof. Ofwel een merkteken of een mal wordt gebruikt als een gids voor de dezelfde cultuur media volume voor elke test te garanderen. De axiale afmeting van de media in de kamer is ongeveer 6 mm. Sanitize de ontluchtingsschroef en vervang deze door naar de kamer waterdicht te maken. De kamer mag niet lekken onder deze statische belasting, als dat zo is, de Teflon wrap moet worden vervangen of versterkt. </li><li> Op dit punt, de Kolsky bar systeem gereset. De zware massa wordt verplaatst naar de oorspronkelijke positie en een nieuwe grendel vervangt gebruikt (gebroken) een. Zet de nieuwe borgbout met de hydraulica tot ongeveer 200 psi. Gebruik de schaar jack naar de pre-loading gedeelte van het incident bar te comprimeren tot een druk iets hoger dan de gewenste waarde, en dan terug het af om de volledige wrijving van het betrekkenjack's schroef. De data acquisitie is nu ingeschakeld. </li><li> De geassembleerde cel onder druk kamer is gemonteerd in het systeem. Het is geplaatst in een V blok ondersteund door kleine lab schaar jack en uitgelijnd met de twee staven. Vet elke interface met een lichte vetlaag en samen wrijf de oppervlakken stoten aan een luchtspleten tussen elimineren. </li><li> De test kan nu doorgaan. De klem grendel wordt gedwongen om te breken door snel pompen van de hydraulische klem driver. De klem zal scheiden en de data-acquisitie moet worden weergegeven van de resultaten. De cel onder druk geschiedenis bepaald uit de metingen van de uitgezonden bar overdruk. Als de gebruikte uitgezonden bar lang genoeg dient deze slechts van de eerste verstoring van het punt waar de metingen een negatieve druk. De duur van de uitgezonden puls kan korter zijn dan het incident puls als een bel wordt gevangen. De omvang niet bereiken die van de invallende puls, maar moet een voldoende long plateau vóór het lossen. Anders kan ofwel een grote luchtbel in de verzegelde kamer of een onbalans tussen de montage en een bar zijn opgetreden. </li><li> De cel onder druk kamer wordt vervolgens verwijderd en gedemonteerd in de celkweek kap. De ontluchtingsschroef wordt verwijderd en de zuiger is losgetrokken van de kamer. De cel-gekweekte glasplaatje wordt gerekend vanaf het uiteinde van de zuiger. </li></ol> 4. Het beoordelen van onder druk cel gedrag <ol><li> Na pressurisatie, kunnen de cellen direct worden geïnspecteerd of verder geïncubeerd later onderzoek. Met de juiste aseptische operationele processen, op langere termijn na de incubatie is mogelijk. </li><li> Druk cellen kunnen worden onderzocht door alle moleculaire en cellulaire biologie technieken. Specifiek voor neuronale cellen onder druk, om de cellulaire en moleculaire onderzoeken in fysiologie TBI omstandigheden assays beoordelen druk geïnduceerde veranderingen in neurietuitgroei, microtubule cytoskelet verandering neuronale gen expression, apoptose, etc., worden uitgevoerd. Als controle celmonsters, cellen die gekweekt hetzelfde gehouden binnen de onder druk kamer voor dezelfde tijdsperiode, maar niet onder druk worden gebruikt (zogenaamde, kamer control). </li><li> Ter beoordeling van de veranderingen in neurietgroei worden druk en kamer controle cellen onderzocht door optische microscoop onmiddellijk na pressurisatie en 1 en 24 h na incubatie. Een voorbeeld van neuronale cel beelden worden getoond in de "Representatieve resultaten sectie (figuur 2). De neurite lengteverandering kan worden gekwantificeerd door actine immunofluorescente kleuring en beeldanalyse. Cellen gefixeerd met 4% w / v paraformaldehyde oplossing gespoeld met 0,05% v / v Tween-20 wasbuffer en gepermeabiliseerd met een 0,1% v / v Triton X-100 oplossing. Na het blokkeren met 1% w / v runderserumalbumine oplossing worden cellen geïncubeerd met tetramethylrhodamine isothiocyanaat (TRITC)-geconjugeerd phalloidin. Immunofluorescentie beelden van de cellen genomen met een fluorescentmicroscoop en de lengte van neurieten voor druk en controle cellen gekwantificeerd met de ImageJ software (NIH). </li><li> De neurieten kan worden geïdentificeerd als axonen of dendrieten. De morfologische veranderingen in axons of dendrieten beoordelen, de hierboven beschreven experimenten worden herhaald met behulp van antilichamen detecteren van elke, nl. neurofilament (NF) antilichaam axonen en microtubule-geassocieerd eiwit (MAP2) antilichaam voor dendrieten. </li><li> Microtubuli zijn een van de belangrijkste componenten van het cytoskelet neuronen, en de schade aan microtubuli is gebruikt als een merker van neuronale schade. Microtubule 2 kan worden gevisualiseerd immunofluorescently met de β-tubuline antilichaam. Cellen gefixeerd na 0 en 24 uur post overdruk, gekleurd met β-tubuline antilichaam en waargenomen door de fluorescentiemicroscoop. </li><li> Om het effect van impulsieve onder druk op neuronale en apoptotische genexpressie te beoordelen, wordt totaal RNA geëxtraheerd uit druk en controle cellen. Gene expressie kan worden onderzocht door het uitvoeren van kwantitatieve RT-PCR of real-time RT-PCR, vergelijkbaar met gepubliceerde protocollen 3. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een voorbeeld van drukprofiel bij de cellen in de kamer onder druk. De Kolsky bar apparaat genereert succes 2 MPa niveau, een enkele puls soort impulsieve onder druk met een duur van ongeveer 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Een voorbeeld van neuronale cel respons op impulsieve overdruk. SH-SY5Y cellen blootgesteld aan impulsieve onder druk van 2 MPa tonen verschillende neuriet / axon afbraak ten opzichte van de kamer controle cellen. 6. Moeilijkheden en oplossingen <ol><li> Kamer afdichting is een van de belangrijkste obstakels worden overwonnen. Het found die grote schijven met o-ringen een probleem van kerving en verhoogde wrijving hebben. Om de wrijving te verwijderen en te voorkomen kerving, een eenvoudige methode zuiger tape met Teflon tape loodgieter gebruikt. Dit lost de problemen en produceert gewenste drukniveau en duur. </li><li> Onder druk neuronale cel gedrag, in het bijzonder bij de beoordeling van secundaire TBI mechanisme of langere termijn effecten, moet worden onderzocht na een lange post-incubatietijd. De cel-bevattende kamer wordt blootgesteld aan potentieel steriele omstandigheden tijdens het verplaatsen naar de Kolsky bar druk, en terug naar de celkweek kap. Met pre-sterilisatie van de kamer delen en de goede werking van montage / demontage van de cel-gekweekte glijbaan en ruimte in de cel cultuur kap, op langere termijn na de incubatie is mogelijk tot enkele weken. </li><li> De reproduceerbaarheid van de gegevens is een belangrijke parameter in cellulaire mechanische stimulatie experimenten. Voor ons apparaat, de reproducibility in neuronale cel respons wordt bepaald hoe gewenst impulsief onder druk profiel, zowel in druk en-duur, wordt herhaaldelijk verkregen. Omdat we nemen de verkregen drukprofiel voor elke onder druk, kan de cel respons data van ongewenste drukprofiel later handmatig worden uitgesloten. </li><li> De gehele onder druk stappen, met inbegrip van de kamer assemblage, overdracht en monteren in de Kolsky bar, onder druk, transfer-back, en kamer demontage, in minder dan 10 minuten. De volgende cel gekweekte dia kan onmiddellijk onder druk na de vorige druk zetten. Aldus kan voldoende overdruk experimenten efficiënt uitgevoerd. Onze set-up maakt gebruik van 18 mm diameter glas dekglaasjes. Een onder druk experiment levert niet genoeg eiwitten voor de westerse immunoblotting het oppervlak tengevolge van grootte (en ook deels omdat een aantal van de onder druk staande cellen zijn dood). Ongeveer drie herhaalde onder druk experimenten leveren eiwit hetgeen noodzakelijk is voor immunoblOtting. Opnieuw wordt de reproduceerbaarheid gecontroleerd telkens met het drukprofiel. </li></ol>

<ol><li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Prec.+Phys.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity%2C+microtubule+disassembly%2C+and+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li>
<li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li>
<li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li>
<li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosive+blast+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li>
<li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+percussion+barotrauma+chamber%3A+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li>
<li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li>
<li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li>
<li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Lat.+Am.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Velen in vitro experimentele technieken zijn uitgeprobeerd voor het bestuderen van de hersenen celbeschadiging in TBI omstandigheden. Deze omvatten neuron / astrocyten strekken, stromingsgeïnduceerde schuifspanning gewicht drop, stylus scheuren, laser transsectie lithotripsie, etc. 4,5 Aangenomen wordt dat kortstondige overdruk is een dominante factor voor fysieke TBI. 6,7 Vooral , de schokgolf van de explosie TBI heeft een pulsduur van een orde van milliseconden. 4 Gebaseerd op deze veronderstelling en waarneming, heeft barometer kamer staat voorbijgaande onder druk ontwikkeld en gebruikt voor de beoordeling van de hersenen cel gedrag onder TBI omstandigheden. Zo is in het fluïdum percussie barotrauma kamer een drukpuls met 20-30 ms lange duur en een piekdruk van 0,5 MPa gebruikt om de humane gliale cel gedrag onderzocht onder TBI. 6 Onlangs, VandeVord et al.. 7 gebruikt metal bal opvallende barometer kamer naar de astrocyten cel te onderzoekengedrag onder TBI, maar de metalen bal opvallend geproduceerd meerdere drukpulsen. In deze studie hebben we een nieuwe cel overdruk apparaat dat een enkele puls soort impulsieve onder druk genereert. Het apparaat is ontwikkeld gebaseerd op de Kolsky bar set-up, die is gebruikt als materiaal testapparaat in onze 8 en ander studies. 1,9 bar Kolsky het materiaal van testmogelijkheden zeer hoge densiteit is aangepast om te kunnen toepassing single-pulstype overdruk aan de gekweekte cellen in de kamer onder druk (figuur 1). We konden met succes de controle van de omvang en de duur van de impulsieve overdruk. Als vertegenwoordiger celrespons hebben we aangetoond dat bij 2 MPa SH-SY5Y neuronale cellen significant neurieten en axonaal verlies weer vergeleken met controle cellen drukloos kamer. Tot slot hebben we een nieuwe impulsieve cel onder druk apparatuur met behulp van een speciaal ontworpen Kolskybar apparaat en toonde zijn potentieel gebruik bij het onderzoek naar neuronale cel respons in TBI omstandigheden. We merken ook op dat deze techniek zeer veelzijdig in dat elk type cellen worden blootgesteld aan impulsieve druk op verschillende niveau en duur. Daarom kan het apparaat worden gebruikt om de impulsieve druk-geïnduceerde cellulaire mechanotransductie gedrag onderzoeken, niet alleen voor verwonden de cellen ook positief voor het stimuleren van de cellen in hun functie en lot bepalen.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) humane neuroblastomacellen </li><li> Diameter van 18 mm glas dekglaasjes </li><li> Celkweekmedia: DMEM, 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine </li><li> Retinoïnezuur (10 uM) voor het induceren neurogenese </li><li> Kolsky bar impulsieve onder druk apparaat </li><li> Zuiger-cilinder cel onder druk kamer </li><li> Roestvrij stalen schroeven voor het vastzetten van cellen gekweekt dekglaasje op de zuiger </li><li> Vet voor interfaces tussen cel-kamer en Kolsky bar </li><li> Algemene moleculaire biologie benodigdheden voor het beoordelen celreactie op druk brengen (fixatief, antilichaam, fluorescerende kleurstof, PCR benodigdheden, enz.) </li></ul>

impulsief druk zetten van neuronale cellen voor traumatic brain injury study

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Een nieuwe impulsief cel onder druk experiment is ontwikkeld met behulp van een Kolsky bar apparaat om blast-geïnduceerde traumatisch hersenletsel (TBI) te onderzoeken. We tonen in dit artikel hoe video blast TBI relevante impulsieve onder druk wordt toegevoerd aan de neuronale cellen in vitro. Dit is mogelijk door goed gecontroleerde drukpuls gecreëerd door een gespecialiseerd apparaat Kolsky bar met volledige luchtdrukwaarden in de cel opgenomen overdruk kamer. Druk neuronale cellen onmiddellijk geïnspecteerd na pressurisatie, of verder geïncubeerd om de lange termijn effecten van impulsieve onder druk op neuriet / axonale uitgroei neuronale genexpressie, apoptose, etc. Het verdient impulsieve overdruk waargenomen bij ongeveer 2 MPa onderzoeken induceert afzonderlijke neurieten verlies ten opzichte om zonder drukcabine cellen. Onze techniek verschaft een nieuwe werkwijze om de moleculaire / cellulaire mechanismen van blast TBI onderzoeken, via impulsieve druk zetten van hersencellen bij goed gecontroleerde prEssure omvang en duur.

Een nieuwe impulsief cel onder druk experiment is ontwikkeld met behulp van een Kolsky bar apparaat op de moleculaire / cellulaire mechanismen van blast-geïnduceerde traumatisch hersenletsel te onderzoeken.

Impulsief druk zetten van neuronale cellen voor Traumatic Brain Injury Study

Een nieuw experiment voor impulsieve celdrukzetting is ontwikkeld met behulp van een Kolsky-stafapparaat om blast-geïnduceerd traumatisch hersenletsel (TBI) te onderzoeken. ...

Het algemene doel van deze procedure is het toedienen van en het observeren van impulsieve overdruk op gekweekte hersencellen voor onderzoek naar traumatisch hersenletsel. Dit wordt bereikt door eerst neurale differentiatie van de cellen te induceren met behulp van retinoïnezuur. Vervolgens worden de neurale cellen in het cellen-pressurisatieapparaat op basis van de ksky bar geplaatst en blootgesteld aan impulsieve druk met een magnitude en duur die relevant zijn voor blast-geïnduceerd traumatisch hersenletsel.Tot slot worden de cellen onderworpen aan molecuulbiologische assays om celbeschadigingen en mogelijke mechanismen van traumatisch hersenletsel te evalueren. De resultaten van de microscopische inspectie tonen neuronale celdood en structureel verlies van axonale neurieten bij een impulsieve overdruk van 2 megapascal en een duur van 0,7 milliseconde. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals vloeistofpercussie, is dat er geen secties met negatieve druk zijn en dat de tijdsduur nauwkeurig wordt gecontroleerd.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van traumatisch hersenletsel (TBI), zoals de drempelwaarde voor neurocellulaire sterfte of letsel als functie van impulsdruk, grootte, duur en belastingsvorm. Hoewel deze methode binnen onze groep tot nu toe is gebruikt om blast-geïnduceerde TBI te bestuderen, kan deze ook worden toegepast op andere typen traumatisch hersenletsel, zoals impact-geïnduceerde TBI. De procedure wordt gedemonstreerd door Matthew, een promovendus uit het laboratorium van Professor Chen fang, en door li ha, een technicus uit mijn laboratorium.In dit experiment wordt een Ksky-stang gebruikt als apparaat voor celpressurisatie. Het apparaat bestaat uit twee aluminiumlegeringstangen van zes meter die zijn opgehangen door uitgelijnde messing lagers met een in vitro celpressurisatiekamer. De celpressurisatiekamer, die tussen de stangen is geplaatst, bestaat uit een zuilercilinder.De cilinder heeft een klein gat in de bodem van de holte, dat tijdens de installatie van het celmonster lucht en overtollige vloeistof afvoert. De zuiger is gemaakt van dezelfde buis als de staaf en is omwikkeld met twee of drie lagen Teflon-tape. De eindkap bevestigt de glazen dekglasjes met twee kleine roestvrijstalen schroeven.Deze demonstratie maakt gebruik van SH SY five Y menselijke neuroblastoomcellen. Het protocol is echter toepasbaar op veel verschillende celcultuurmodellen. De cellen bevinden zich op glazen dekglasjes met een diameter van 18 millimeter bij een dichtheid van 3000 cellen per vierkante centimeter.Tijdens de incubatie in aangevuld DMEM wordt de differentiatie van de cellen geïnduceerd door het medium gedurende zeven dagen aan te vullen met 10 micromolar retinoïnezuur, waarbij het medium elke twee dagen wordt ververst. Op de zevende dag vertonen de cellen een goed ontwikkelde neuriet-axonale structuur en zijn ze klaar om onder druk te worden gezet. Steriliseer alle onderdelen van de drukkamer met een autoclaaf en bewaar deze onder UV-licht tijdens het assembleren van de kamer.Zorg in een steriele werkbank ervoor dat de ventilatieschroef in de kamer losjes in de luchtafvoer is gedraaid. Vul de kamer aan de basis van de holte met vers bereid warm groeimedium. Schroef vervolgens een glazen objectglas met cellen op de dop van de zuiger, met de cellen naar buiten gericht, en plaats de zuiger voorzichtig in de holte van de kamer.Verwijder de ontluchtingsschroef, kantel de ontluchting omhoog en duw de zuiger in de kamer tot een eerder bepaalde referentielijn. Dit laat een vloeistofdiepte van ongeveer zes millimeter over in de celdrukkamer. Vermijd het introduceren van bellen, desinfecteer de ontluchtingsschroef en plaats deze terug om de kamer waterdicht te maken.De kamer mag niet lekken onder de statische belasting. Reset het Ksky bar-systeem. Verplaats de zware massa terug naar de oorspronkelijke positie en plaats de vergrendelingsbout terug.De vergrendelingsbout oefent een klemkracht uit die beweging van de incidentstaaf voorkomt totdat de pennen breken. Zet de nieuwe vergrendelingsbout met de hydraulische krik aan tot ongeveer 200 PSI. Gebruik de schaarkrik om het voorspanningsgedeelte van de incidentstaaf samen te drukken tot een druk die iets hoger ligt dan de gewenste waarde, en draai deze vervolgens iets terug om de volledige wrijving van de JAK-schroef te benutten. Stel nu de gegevensacquisitie in, aangezien de drukopbouw ongeveer een milliseconde duurt.Stel een bemonsteringsfrequentie van één megahertz in met behulp van 2000 ohm rekstrookjes in een Wheatstone-brugschakeling. De spanning moet worden ingesteld op 45 volt bij de zendstaaf. Monteer de celkamer met de zuiger naar de zendstaaf gericht.Plaats de celkamer in een V-blok dat wordt ondersteund door de kleine laboratoriumschaarhef en uitgelijnd is met de twee stangen. Smeer elke interface licht in en verwijder eventuele lucht tussen de contactoppervlakken door deze voorzichtig tegen elkaar te wrijven. Het systeem is nu voorbereid.Activeer de gegevensacquisitie en voer de test uit door snel op de hydraulische klembediener te pompen. Hierdoor breekt de vergrendelingsbout, waardoor de klem loskomt en er een drukgolf naar de cellen wordt overgebracht. Verwijder na de test de slide uit de kamer in een steriele werkbank en ga over tot het beoordelen van het celgedrag.Met ervaring kan het apparaat worden gebruikt om ongeveer negen cellenhulpstukken per uur onder druk te zetten. Bij het analyseren van de uitlezing kunnen luchtbel-fouten optreden aan het begin van het verzonden staafsignaal, hoewel deze in deze demonstratie niet zichtbaar zijn.Als de transmissiebalk voldoende lang is, moeten de belangrijkste gegevens beginnen bij de eerste verstoring en eindigen waar de metingen een negatieve druk vertonen; deze spanningsmeting is proportioneel aan de door de cellen ondergane stress via rekstrookanalyse. De duur van de verzonden puls kan korter zijn dan die van de invallende puls. Als er een kleine bel lucht gevangen zit in de vloeistof binnen de drukkamer van de cel, kan de amplitude van de verzonden puls die van de invallende puls niet overschrijden, maar deze moet een voldoende lang plateau vertonen vóór de ontlasting.Anders is er ofwel een grote luchtbel ingesloten in de verzegelde kamer, of de assemblage en de staaf zijn niet correct uitgelijnd. Na de drukopbouw kunnen de cellen onmiddellijk worden geïnspecteerd of verder worden geïncubeerd voor latere analyse. Vergelijk de onder druk gezette cellen met de controlecellen in de kamer, die op identieke wijze zijn behandeld maar niet zijn blootgesteld aan druk, om veranderingen in de neurietenlengte met optische microscopie te beoordelen op verschillende tijdstippen na de incubatie.Actine-immunofluorescentiekleuring kan worden gebruikt om veranderingen in het cytoskelet te beoordelen. Daarnaast kan een antilichaam tegen microtubule-geassocieerd proteïne twee (MAP2) worden gebruikt om veranderingen in een van de belangrijkste neuronale markers te visualiseren.Om het effect van impulsieve overdruk op de expressie van neuronale en apoptotische genen te beoordelen, kunnen indien gewenst standaard moleculair-biologische technieken zoals R-T-P-C-R worden gebruikt. Voldoende cellysaten voor immunoblotting kunnen worden verzameld uit meerdere identiek onder druk gezette celmonsters. In dit voorbeeld van het overdrukprofiel heeft het ksky bar-apparaat succesvol een enkelvoudige impulsieve drukpuls van twee megapascal met een duur van ongeveer 0,7 milliseconde toegepast op de gecultiveerde neuronale cellen, zoals te zien is in de beelden van de optische microscoop; SHSY vijf Y menselijke neuronale cellen die aan een impulsieve druk van twee megapascal werden blootgesteld, vertonen een duidelijke afbraak van neurite-axonen in vergelijking met niet onder druk gezette controlecellen.Bij het uitvoeren van deze procedure moet de vloeistofdrukkamer altijd op deze manier worden vastgehouden en nooit op de andere manier, omdat de cellen anders na de ontwikkeling aan negatieve druk worden blootgesteld. Deze techniek heeft onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen in staat gesteld om het celmechanisme van traumatisch hersenletsel te onderzoeken onder gecontroleerde drukomstandigheden. Wij danken het Army UNL Center for Trauma Mechanics voor de financiële ondersteuning.

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video demonstrates the procedure for inducing an open-skull traumatic brain injury in a mouse by making a midline skull incision, drilling through the skull and removing the bone flap to expose the brain cortex, and applying high pressure to induce trauma. The wound is then sutured to prepare the mouse model for subsequent experiments.

Generating a Traumatic Brain Injury Mouse Model Using an Impactor Probe

In vitro traumatisch hersenletsel modellen gewerkt te reproduceren in vivo hersenen vervorming. Stretch-geïnduceerde schade is werkzaam voor astrocyten, neuronen, gliacellen, aorta, en de hersenen endotheelcellen. Echter, maakt gebruik van ons systeem een bloed-hersenbarrière (BBB) ​​model dat eigenschappen die een legitiem model van de BBB om een te vestigen in vitro TBI model bezit.

Strekken in Brain microvasculaire endotheelcellen (CEND) als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisch Hersenletsel Model van de Blood Brain Barrier

Traumatische hersenverwondingen (THV) blijven een ernstig gezondheidsprobleem. Met behulp van het gecontroleerde corticale impactchirurgie-model kan onderzoek worden gedaan naar de effecten van THV en mogelijke behandelmethoden.

Gecontroleerde Corticale Impact Model voor traumatisch hersenletsel

Dit document beschrijft een nieuwe model van traumatische hersenenverwonding primaire blast. Een drukluchtremmen gedreven schok buis wordt gebruikt voor het blootstellen van in vitro hippocampal segment culturen van de muis om een enkele schokgolf. Dit is een eenvoudige en snelle protocol voor het genereren van een reproduceerbare hersenletsel met weefsel met een hoog debiet.

Een roman In Vitro Model van traumatische hersenenverwonding Blast

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van methoden voor ex vivo vasculaire reactiviteit bepaling na een primaire blast traumatisch hersenletsel (bTBI) met behulp van geïsoleerde, hydrofoor, knaagdier middelste cerebrale arterial (MCA) segmenten. bTBI-inductie is uitgevoerd met behulp van een schok buis, ook bekend als een geavanceerde Blast Simulator (ABS) apparaat.

Gevolgen van Blast-geïnduceerde Neurotrauma voor hydrofoor knaagdier midden cerebrale bloedvaten

Hier presenteren we een protocol om ernstige TBI te induceren met de laterale vloeistof percussie blessure (FPI) model bij volwassen, mannelijke Wistar ratten. We tonen ook het gebruik van een draadloze telemetrie systeem om continu video-EEG-opnames en monitor voor epileptiform lozingen in overeenstemming met post-traumatische epileptogenese te verzamelen.

Gebruik van een draadloze video-EEG-systeem te controleren epileptiform lozingen na laterale vloeistof-percussie geïnduceerde traumatisch hersenletsel

Hier beschrijven we een protocol voor de inductie van muriene traumatisch hersenletsel via een open-Head gecontroleerd corticale impact.

Murine model van gecontroleerde corticale impact voor de inductie van traumatisch hersenletsel

We presenteren hier een protocol van een explosiegolfmodel voor knaagdieren om neurobiologische en pathofysiologische effecten van mild tot matig traumatisch hersenletsel te onderzoeken. We hebben een gasgestuurde, bench-top opstelling opgezet die is uitgerust met druksensoren die een betrouwbare en reproduceerbare generatie van door ontploffing geïnduceerd mild tot matig traumatisch hersenletsel mogelijk maken.

Blast Wave-model met lage intensiteit voor preklinische beoordeling van licht traumatisch hersenletsel met gesloten hoofd bij knaagdieren

Intraparenchymale bloeding en neuro-inflammatie vergezeld van hersenkneuzing kunnen ernstig secundair hersenletsel veroorzaken. Dit protocol beschrijft een muisgecontroleerd corticaal impactmodel (CCI), waarmee onderzoekers bloedingen, kneuzingen en posttraumatische immuunresponsen kunnen bestuderen en mogelijke therapieën kunnen onderzoeken.

Een preklinisch gecontroleerd corticaal impactmodel voor traumatische bloedingen, kneuzingen en neuro-inflammatie

Hier worden methoden gepresenteerd voor het produceren van herhaalde blootstellingen aan ontploffingen met lage intensiteit met behulp van muizen.

Modellering van zeer repetitieve blootstelling aan ontploffingen op laag niveau bij muizen

Dit protocol beschrijft een op maat gemaakt luchtdruksysteem dat is ontworpen om verwondingen aan het centrale zenuwstelsel (CZS) van een gesloten systeem bij muizen te induceren, inclusief oculaire, hersen- en ruggenmergtrauma's. Het doel van dit protocol is om een kader te bieden voor onderzoekers om het systeem gemakkelijk aan te passen en uit te breiden voor hun unieke CZS-traumastudies.

Systeem voor focaal, gesloten systeem letsel aan het centrale zenuwstelsel

Leer impulsieve druktoepassing op neuronale cellen voor traumatisch hersenletselonderzoek met een Kolsky-barapparaat. Deze methode maakt gecontroleerde druktoepassing mogelijk om celreacties en letselmechanismen te bestuderen.

Impulsief druk zetten van neuronale cellen voor Traumatic Brain Injury Study

Meer video's verkennen