Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie
3 mei 2011
Optische resolutie fotoakoestische microscopie (OR-PAM) is een opkomende technologie die in staat van beeldvorming optische absorptie contrasten In vivo Met cellulaire resolutie en gevoeligheid. Hier bieden wij een gevisualiseerd instructie op de experimentele protocollen van OR-PAM, met inbegrip van de systeemconfiguratie, systeem uitlijning, typisch In vivo Experimentele procedures, en functionele beeldvorming regelingen.
Het algemene doel van deze procedure is om in vivo optische resolutie foto-akoestische microscopie of, of Pam van microcirculatie te demonstreren die niet-invasief en labelvrij is. Dit wordt bereikt door eerst het experimentele dier te anesthesieren. De tweede stap van de procedure is om het gebied van interesse te positioneren door de beeldvormingskop van de optische resolutie foto-akoestische microscoop te verplaatsen. Vervolgens worden de scanparameters ingesteld en wordt de beeldacquisitie gestart.
Uiteindelijk worden de verdelingen van de totale zuurstofconcentratie en zuurstofverzadiging van hemoglobine verkregen door berekening van de multi-golflengte experimentele gegevens. Optische resolutie foto-akoestische microscopie is gebaseerd op laserexcitatie en ultrasone detectie. Een korte postlaserstraal wordt gefocusseerd in biologisch weefsel.
Lichtabsorptie genereert tijdelijke verwarming en daaropvolgende ultrasone emissie, die wordt ontvangen om een afbeelding te vormen. Het unieke voordeel van, of Pam, is de grondvrije detectie en de uitzonderlijke gevoeligheid voor optische absorptie. In tegenstelling tot bestaande reflectie, zijn optische microscopietechnologieën voornamelijk gevoelig voor optische verstrooiing of fluorescentie. Capabel om in vavo labelvrije hoog-resolutie beeldvorming van optische absorptie of RPM te bieden, heeft het brede biomedische toepassingen gevonden in neurologie, oftalmologie, vasculaire biologie en dermatologie.
Optische resolutie foto-akoestische microscopie of, of pamm bestaat uit zowel optische als ultrasone componenten. De optische bestralingsbron is een dye-laser gepompt door een vaste staat pulslaser. De uitgaande laserstraal wordt gedimd door een neutraal dichtheidsfilter en gekoppeld aan een single mode optische vezel voor lichtlevering om mechanisch scannen van de microscoopbeeldvormingskop mogelijk te maken in plaats van het levende object om effectief de multimode laserstraal in een single mode optische vezel te koppelen.
Het wordt eerst gefilterd door een 50 micrometer diameter pinhole. De pinhole is iets van het brandpunt van de condensorlens gepositioneerd om zijn diameter aan te passen aan de fundamentele modestraaldiameter. Om een bijna diffractie-beperkte optische focus te creëren, wordt de uitgang van de single mode vezel gecollimeerd en vult deze de achterste opening van een microscoop.Objectief.
De ultrasone detectie omvat een zelfgemaakte akoestisch optisch straalcombinateur verbonden met een ultrasone transducer. De combiner lijnt de optische bestraling en de akoestische detectie coaxiaal uit. Er is een sferische holte in de bodem van de combiner gefreesd om een akoestische lens met een numerieke apertuur van 0,5 in water te produceren, wat een akoestische focale diameter van 43 micrometer op de centrale frequentie van 50 megahertz biedt.
Voor de eerste uitlijning helpt het om puls-echo echografie te gebruiken om de positie van het akoestische focale vlak te bepalen. De beeldvormingskop wordt verticaal aangepast tot het maximale puls-echo ultrasone signaal wordt waargenomen. Om de detectiegevoeligheid te maximaliseren, worden de optische en akoestische foci uitgelijnd.Confocal.
Een optisch absorberend doelwit, zoals een stuk zwart plakband, wordt in het akoestische focale vlak geplaatst. Vervolgens wordt de optische focale positie aangepast om het fotoakoestische signaal te maximaliseren. Het or PAM-systeem omvat ook elektronische versterkers en analoog-digitaal converter, een mechanische scanner en een scannercontroller.
Het gedigitaliseerde signaal wordt overgebracht naar een computer voor beeldacquisitie. De software converteert de ruwe gegevens in een reeks dwarsdoorsneden becan-beelden. Terwijl de microscoopkop het object rasterscans, kunnen de opgenomen beelden vervolgens worden weergegeven als individuele dwarsdoorsnedenbeelden, 2D maximale amplitudeprojectie-beelden of 3D-weergaven.
Een watertank wordt gebruikt om de microscoopbeeldvormingskop te huisvesten. Er wordt een beeldvormingsvenster gesneden in een petrischaaltje en verzegeld met een akoestisch en optisch doorschijnende polyethyleenmembraan. De foto-akoestische golf die van het object wordt gegenereerd, wordt akoestisch gekoppeld aan de ultrasone detector, eerst door ultrasoon gel tussen het object en het polyethyleenmembraan, en vervolgens door gedeïoniseerd water in de petrischaal.
Deze uitvindingen en toepassingen van beschikbare optieklasers en de ultrasone transducer vormen het or pam-systeem. In het volgende segment zullen we met dit systeem de microvatsculatuur van een levende muis beeldvormen. Als het afgebeelde dier geen naakte muis is, is het ideaal om dete 24 uur voor het experiment te verwijderen.
Dus de irritatie van het huidvaatbed herstelt zich. Anesthesieer de muis met 3% ISO-fluorine verdampt in medisch zuurstof. De typische stroomsnelheid ligt tussen één en 1,5 liter per minuut.
Afhankelijk van het lichaamsgewicht van het dier. Houd de anesthesie gedurende het hele experiment met 1% ISO-fluorine. Voer een teenprik uit om ervoor te zorgen dat de muis volledig verdoofd is. Breng de muis over naar een stereotactische schaal met een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op 37 graden Celsius te houden.
Vlak nu het oor op de plastic plaat. Breng vervolgens een laagje ultrasoon gel aan op het oor. Vermijd het vastlopen van luchtbellen in het gel.
Breng ook oogzalf aan in de ogen om uitdroging of onbedoelde laserschade te voorkomen. Raak het oog niet direct aan met de applicator. Plaats vervolgens het oor onder het beeldvormingsvenster en breng de dierenkooi langzaam omhoog tot het ultrasoon gel contact maakt met de onderkant van de membraan.
Zachte contact is vereist omdat het tegen de membraan drukken van het oor de bloedstroom in het oor kan beïnvloeden. Neem vervolgens een paar voorzorgsmaatregelen met het dier om zijn fysiologische status te controleren. Klem een pulsoximeter aan de muis, poot of staart.
Verlaag nu de beeldvormingskop tot de akoestische lens in gedeïoniseerd water is gedompeld en verwijder de luchtbellen die onder de akoestische lens zijn vastgehouden. Stel de laser in op de externe triggermodus en start het proefscannen. Pas de Z-positie van de beeldvormingskop aan totdat de optische en akoestische dubbele foci in he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor fotoakoestische microscopie met optische resolutie (OR-PAM), een niet-invasieve beeldvormingstechniek die cellulaire resolutie in vivo biedt. De procedure omvat het anesthetiseren van het dier, het positioneren van de beeldvormingskop en het verkrijgen van beelden om de microcirculatie te analyseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Fotoakoestische Microscopie
Achtergrond
- OR-PAM is een nieuwe beeldvormingstechnologie.
- Het maakt beeldvorming van optische absorptiecontrasten mogelijk.
- De techniek is labelvrij en niet-invasief.
- Het biedt inzicht in de microcirculatie en zuurstofgehaltes in weefsels.
Doel van de studie
- Om het in vivo gebruik van OR-PAM aan te tonen.
- Om een gevisualiseerde instructie van de experimentele protocollen te bieden.
- Om het begrip van de microcirculatiedynamiek te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het anesthetiseren van het experimentele dier.
- Het positioneren van het interessegebied voor beeldvorming.
- Het instellen van de scanparameters voor beeldacquisitie.
- Het berekenen van de totale zuurstofconcentratie en verzadiging op basis van gegevens van meerdere golflengten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle in vivo beeldvorming van de microcirculatie.
- Acquisitie van gegevens over zuurstofconcentratie en verzadiging.
- Demonstratie van het niet-invasieve karakter van de techniek.
- Validatie van OR-PAM als instrument voor functionele beeldvorming.
Conclusies
- OR-PAM is effectief voor het in beeld brengen van de microcirculatie.
- De techniek biedt waardevolle informatie over de weefseloxygenatie.
- Het heeft potentiële toepassingen in diverse biomedische onderzoeksvelden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Driedimensionale fotoakoestische microscopie met optische resolutie (OR-PAM) maakt niet-invasieve, labelvrije beeldvorming met hoge resolutie van de optische absorptie van weefsel mogelijk, waardoor functionele en fysiologische inzichten op microvasculair niveau worden verkregen. Deze mogelijkheid vult een kritisch gat in de beeldvorming tijdens de ontdekkingsfase door zuurstofverzadiging en hemoglobinedynamiek in vivo te kwantificeren, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie en translationele continuïteit. De integratie van optische en akoestische detectie in OR-PAM biedt een unieke waarde voor targetvalidatie en voorspellend vertrouwen in preklinische onderzoeksprocessen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van weefseloxygenatie en hemoglobineverzadiging mogelijk voor functionele doelwitinterrogatie.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door fysiologische responsen in intacte microvasculatuur te kwantificeren.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen in target engagement via kwantitatieve, labelvrije imaging-outputs.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde in vivo modellen voor voor downstream compound-screening en mechanistische studies.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve metingen van de microvasculaire functie en oxygenatie.
- Maakt assay-standaardisatie en platform-schaalbaarheid mogelijk voor high-content imaging workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt beelduitkomsten met ziekterelevante fysiologische biomarkers, zoals zuurstofsaturatie.
- Zorgt voor continuïteit van discovery tot preklinische validatie door ondersteuning van functionele beeldvorming op meerdere schalen.
- Verlaagt de risico's bij beslissingen over verdere ontwikkeling door directe meting van farmacodynamica op weefselniveau mogelijk te maken.
Pipeline- en workflowintegratie
OR-PAM past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waarbij vroege mechanistische studies en translationele biomarker-validatie worden verbonden via kwantitatieve in vivo imaging.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door real-time fysiologische veranderingen in de microcirculatie te meten.
- Screening: Biedt assay-ready, reproduceerbare beeldvorming van vasculaire parameters en oxygenatie voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve read-outs van hemoglobineconcentratie en zuurstofsaturatie voor robuuste statistische vergelijking.
- Translationeel onderzoek: Verbindt functionele beeldvormingsgegevens met preklinische biomarkerstrategieën wanneer deze zijn afgestemd op ziektemodellen.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar beeldvormingsplatform voor functionele studies op meerdere schalen en in meerdere organen binnen R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij doelvalidatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare imaging-workflows voor in vivo studies.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door het verstrekken van bruikbare fysiologische gegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van kandidaten mogelijk op basis van functioneel imaging-bewijs.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de uitlijning van optische en akoestische systemen en in vivo imaging-protocollen.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde laser-, ultrasone en data-acquisitie-instrumentatie.
- Maakt cross-team standaardisatie van imaging-parameters en data-analyse workflows noodzakelijk.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende weefseltypes of diermodellen op basis van optische eigenschappen.
- De imaging-gevoeligheid en resolutie zijn afhankelijk van een precieze optisch-akoestische confocale uitlijning.
