Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren

Het algemene doel van het volgende experiment is om de structuur-activiteitsrelaties van gesynthetiseerde arthropode neuropeptiden op hun cognate GPCR te analyseren. Dit wordt bereikt door Chinese hamster ovarium (CHO)-K1-lege cellen te transfecteren met de gewenste GPCR-expressievector om stabiel getransformeerde cellijnen afgeleid van een enkele cel te verkrijgen. Als tweede stap wordt de stabiele cellijn getransfecteerd met het quaran-plasmide, dat de reporter GCaMP Quaran bevat voor het meten van intracellulaire bioluminescentie in de calcium-bioluminescentie-plaatassay. Vervolgens wordt de calcium-bioluminescentie-plaatassay uitgevoerd om de cytoplasmatische calciumspiegels te bepalen na toevoeging van peptide-liganden aan deze recombinante cellen.

De resultaten tonen verschillen in bioluminescentie-eenheden aan na toediening van structureel verschillende peptiden of verschillende peptideconcentraties aan de recombinante cellen, gebaseerd op de opgewekte intracellulaire calciumvrijgave zoals gedetecteerd door de reporter a corrin in de plaatassay. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van stabiel getransformeerde clonale cellellijnen die recombinante GPCR's tot expressie brengen boven transiënte expressieprotocollen is dat de receptorexpressieniveaus uniformer zijn, wat zorgt voor consistentie in de resultaten. Bovendien maakt de targeting van het aquarium-eiwit naar de mitochondriën gevoelige calciummetingen via bioluminescentie mogelijk; het experiment van vandaag zal worden uitgevoerd door twee promovendi, Shall in Lie en Simon Kersch, evenals een postdoc uit mijn laboratorium.

Om stabiele cellijnen te vestigen, begint u met het kweken van Chinese hamster ovary (CHO), K1-lege cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Houd de lege cellen in groeimedium met 1x antibioticum-antimycoticum zodra de cellen gezond groeien. Zaai de Chinese hamster ovary K1-cellen uit in T25-weefkweekflessen en laat de cellen gedurende de nacht groeien in groeimedium zonder antibiotica tot ze ongeveer 30% confluent zijn.

Vóór de transfectie: bereid een DNA-expressievector voor die de GPCR van belang bevat, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Meng het DNA met 100 microliters Optum reduced serum medium.

Meng zes µL lipofectiereagens met 100 µL serumvrij F 12 K-medium en laat dit 30 tot 45 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Meng na incubatie het DNA en de lipofectie-oplossingen voorzichtig door ze druppelsgewijs samen te voegen. Laat het mengsel 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur staan in een buis van 15 mL.

Meng het transfectiemengsel voorzichtig druppelgewijs in 1,8 milliliters vers F 12 K medium. Was de cellen vervolgens met PBS en voeg deze nieuwe transfectieoplossing toe aan de cellen. Na een incubatie van 18 uur.

Vervang het medium door F 12 K-medium plus 10% FBS zonder antibiotica en incubeer dit de volgende dag gedurende de nacht. Verdeel de cellen over twee T 25-flessen met F 12 K-medium plus 10% FBS zonder antibiotica, zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Incubeer nogmaals 18 uur.

Vervang het medium door selectief medium. Kweek de cellen vervolgens gedurende drie tot vier weken in het selectieve medium. Hierdoor worden de cellen geselecteerd die het plasmide stabiel in hun genomisch DNA hebben geïncorporeerd.

Ga door met het onderhouden van de cellen met behulp van onderhoudsmedium en vries de cellenlijnen periodiek in om verlies te voorkomen in geval van onverwachte contaminatie. Om clonale cellenlijnen te selecteren, moeten de cellen eerst worden getrypsiniseerd en gecentrifugeerd met onderhoudsmedium, zoals beschreven in het geschreven protocol. Resuspendeer de cellen vervolgens in vijf milliliter onderhoudsmedium.

Verwijder 0,5 milliliters van de celsuspensie en voeg 4,5 milliliters vers onderhoudsmedium toe om een 10 x verdunning te maken; breng vervolgens 100 microliters van de 10 x verdunning over in 12 wells van een 96-well plaat om op enkelvoudige cellen te selecteren. Zet dit voort door deze cellen ongeveer 19 keer in 10 x seriële verdunningen te brengen voor een theoretische finale suspensie van één cel per 100 microliters, en breng 100 microliters van elke seriële verdunning over in 12 wells van een 96-well plaat. Observeer de 96-well platen na 18 uur incubatie onder een inverted licht- of fluorescentiemicroscoop en markeer de wells die naar verwachting slechts één enkele cel bevatten, of twee cellen die duidelijk zijn voortgekomen uit één enkele cel door deling.

Observeer de platen dagelijks en ververs het medium elke drie dagen. Laat de cellen een week groeien tot ze ongeveer 80% confluent zijn. Spoel vervolgens de gemarkeerde wells af met 200 µL PBS en trypsine.

Spoel ze met 100 µL PBS tripsine EDTA-oplossing. Verwijder de PBS tripsine EDTA-oplossing. Voeg 100 µL onderhoudsmedium toe en overbreng de cellen van elke gemarkeerde well naar één well van een zes-wells plaat met 1 mL onderhoudsmedium.

Nadat de cellen drie dagen in de zeswellsplaat zijn gekweekt, worden ze overgebracht naar individuele T 25-flasks. Vries de cellijn periodiek in, zodat deze kunnen worden teruggehaald als de cellen niet langer consistent presteren. Om de cellijn met de hoogste respons te bepalen, worden de overgebrachte cellen getest met de calcium-bioluminescentie-assay met een actief ligand, zoals de receptor, het peptide, het ligand of een andere positieve controle-agonist.

De calcium-bioluminescentie-assay zal later in deze video in detail worden gedemonstreerd. Voer de selectie van enkelvoudige cellen voor een tweede keer uit voordat u met het experiment verdergaat. Wanneer clonale cellijnen worden gekozen voor assays en in cultuur worden gehouden, is het essentieel om de passagesnummers bij te houden, aangezien cellen met een hoog passagesnummer mogelijk niet meer optimaal functioneren in een T 25-fles.

Kweek cellijnen die de gewenste receptor tot expressie brengen in onderhoudsmedium tot ongeveer 90% confluentie. Na het trypsiniseren en centrifugeren van de cellen, resuspendeer deze in het onderhoudsmedium, verdun de cellen ongeveer 10 x met onderhoudsmedium en tel het aantal cellen met een hemocytometer. Pas vervolgens het celgetal aan naar ongeveer twee keer 10⁵ cellen per milliliter. Zaai twee milliliter van de cellen in elke put van een zes-putsplaat en incubeer de plaat gedurende 24 uur; na deze tijd moeten de cellen ongeveer 60% confluent zijn voorafgaand aan de start van de calcium-bioluminescentie-plaatassay.

Bereid het reportergen van belang voor in het expressievectorconstruct. Hier wordt een mitochondriaal tot expressie gebracht quorum-report gebruikt. Transfect vervolgens de cellen met één µg van dit reporterplasmide, zoals beschreven in het geschreven protocol.

Na het incuberen van de cellen in een plaat met zes putjes gedurende 24 uur, worden de cellen getrypsineerd, gecentrifugeerd en geresuspendeerd. Tel het aantal cellen tot 400 000 cellen per milliliter en breng 100 µL over naar elk putje van een witte 96-well microtiterplaat met een dunne bodem; incubeer nogmaals 24 uur tot een confluentie van ongeveer 80% is bereikt. Dit is de optimale celconcentratie voor de bioluminescentie-assay. De volgende stappen moeten in het donker worden uitgevoerd, maar worden hier in het licht getoond.

Bereid voor demonstratiedoeleinden voldoende calciumvrij DME-medium voor dat vijf micromolar CHO terezin bevat voor 90 microliters per putje. Verwijder het oude medium uit de plaat en voeg aan elk putje 90 microliters toe. Incubeer de platen gedurende drie uur in het donker bij 37 °C en 5% CO2, waarna de cellen klaar zijn om te worden getest.

Deze demonstratie wordt uitgevoerd met een Nova star platlezer in bioluminescentie-modus. Om te beginnen met de spoeling, moeten de machinepompen van de plaat in de plaathouder worden geplaatst terwijl deze in het donker staat. Los de peptiden op in een EOR-buisje van 1,5 milliliter.

Gebruik voldoende calciumvrije DME en medium voor 10 µL van 10 x peptide per well. Stel vóór gebruik de aspiratiediepte en de positiebepaling van de peptideoplossing in. Stimuleer de cellen met 10 µL van het peptide en begin onmiddellijk met het registreren van de lichtemissie.

In deze demonstratie is het instrument ingesteld om de lichtemissie bij 465 nanometer voor elke well elke twee seconden te registreren gedurende een totale tijd van 50 seconden. Nadat de run is voltooid, moeten de pompen van het apparaat worden gespoeld. Herhaal dit proces voor elk peptide-monster, sla de gegevens op en spoel de pompen van het apparaat na de assay opnieuw.

De gegevens van de lichtemissie van elke put worden door het softwareprogramma automatisch overgebracht naar een Microsoft Excel-werkblad. Plak de gegevens vanuit Excel in Prism Software 4.0. Maak een grafiek met de verschillende peptideconcentraties op de x-as en bioluminescentie-eenheden.

Select in de Y-as een niet-lineaire regressiecurvefit-analyse om concentratie-responscurves te verkrijgen voor elk peptide en hun bijbehorende EC 50-waarden. Elk experiment dient drie keer te worden herhaald voor de data-analyse. Wanneer tot expressie gebracht in Chinese hamster ovary, K one-cellen, gedroeg de kinine-receptor van de mug Aedes aegypti zich als een multi-ligandreceptor en reageerde functioneel op concentraties zo laag als 1 nM.

Voor de drie endogene kininen van Rhipicephalus microplus die afzonderlijk zijn getest met de calcium-bioluminescentie-plaatassay. Er werden statistisch verschillende EC 50-waarden bepaald van ongeveer 16 nanomolar voor Rhipicephalus microplus kinine 3, 26 nanomolar voor Rhipicephalus microplus kinine 2 en 49 nanomolar voor Rhipicephalus microplus kinine 1, wat resulteerde in een volgorde van potentie waarbij Rhipicephalus microplus kinine 3 het meest potent was en Rhipicephalus microplus kinine 1 het minst potent. Hier volgt de vergelijking van de activiteit van zes alfa-aminoisobutyric acid kinine-analogen op de Chinese hamster ovary K1-cellijn die de tekenkininereceptor tot expressie brengt, bepaald via een calcium-bioluminescentie-plaatassay.

De Y-as representeert het percentage maximale bioluminescentie-eenheden voor elke analoog, uitgedrukt als een percentage van de bioluminescentie waargenomen bij een specifieke concentratie ten opzichte van de maximale respons waargenomen bij alle geteste concentraties voor elke analoog; de KININE HEXA-peptide F-F-F-S-W-G amide analoog dient als positieve controle voor receptoractiviteit. De enkelvoudige vervangings-kinine-analoog double F amino ISO butyric acid WG amide was actiever dan de positieve controle HEXA-peptide KININE-analoog; de KININE-analoog met twee aminoboterzuurvervangingen, aminoboterzuur FF aminoboterzuur WG amide, was de meest potente van de geteste dubbele vervangingsanalogen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u A-G-P-C-R tot expressie brengt en clonale cellijnen verkrijgt om structuur-activiteitsrelaties van liganden op receptoren te analyseren middels een calcium-bioluminescentie-assay.