Name: Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer een calciumbioluminescentie-assay voor functionele analyse van G-eiwit-gekoppelde receptoren in muggen en teken. Deze methode ondersteunt onderzoek naar structuur-activiteitrelaties en medicijnontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Drs. CJP Grimmelikhuijzen en Michael Williamson van de Universiteit van Kopenhagen (Denemarken) worden gewaardeerd om het verstrekken van de aequorine plasmide. Onze medewerker, dr. Ronald J. Nachman van ARS-USDA (TX, USA), is erkend voor peptide synthese en voor het verstrekken van de Novostar plaat lezer.

1. Oprichting van stabiele cellijnen <ol><li> Kloon uw GPCR van rente en plaats deze in een expressievector voorzien van een 5 'Kozak consensus sequentie (GCCA / GCCATGG) rond het startcodon voor een optimale ribosomale binding in een zoogdier systeem (Kozak, 1986). Hier gebruiken we het plasmide pcDNA3.1/Bm-KR voor de teek kinine-receptor, en het plasmide pcDNA3.1/Aedae-KR voor de mug kinine receptor (Holmes et al., 2003;. Pietrantonio et al., 2005.). De pcDNA3.1 (-) vector ampicillineresistentie codeert voor selectie in bacteriën en neomycine (G418) weerstand voor selectie in zoogdiercellen. </li><li> Grow CHO-K1 lege cellen (zonder plasmiden) (ATCC, Manassas, VA, Verenigde Staten) of andere gewenste cel lijn in een T-25 kolf (BD Falcon) bij 37 ° C in een 5% CO 2 bevochtigde incubator (Holmes et al. ., 2003). Alle verdere incubaties moet worden gedaan onder deze voorwaarden, tenzij anders aangegeven. Handhaaf de lege cellen in groei medium (F12K medium met 10% foetaal runderserum) met 1X antibiotica Antimycoticum (Invitrogen, CA). </li><li> Op te splitsen cellen, warm-up van alle oplossingen tot 37 ° C. Verwijder oude medium in de T-25 kolf en spoel na met 5 ml PBS en verwijder PBS. Om trypsinize cellen, voeg 2 ml PBS-trypsine-EDTA (34 ml PBS, 2 ml 7,5% natriumbicarbonaat, 4 ml 10x trypsine-EDTA) voor 2 minuten. Voeg 3 ml medium en aspireren medium op en neer om cellen te mengen. Transfer medium met cellen in een conische buis en centrifugeer gedurende 2 minuten bij ~ 200-300 g (1.000 rpm). Gooi supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml medium. Verdun de geresuspendeerde cellen tot een concentratie van 1:5 of 1:10 met vers medium en overdragen 5 ml in een nieuwe T-25 kolf. </li><li> Nadat de cellen gezond groeien (ongeveer 2-3 dagen), het zaad van de CHO-K1 cellen in T-25 weefselkweekflessen en groeien ze 's nachts in de groei medium zonder antibiotica tot zij ongeveer 30% confluent (ongeveer 18 uur). De mate van confluentie kan worden vastgesteld door het observeren van cellen onder omgekeerde fluorescentie microscopie. </li><li> Bereid de volgende mengsels voor elk monster: <ol><li> Combineer 1-2 pg DNA (bijvoorbeeld: gebruik 4μl van 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) met 100 ul Opti-MEM ik Verminderde Serum Medium (Invitrogen). </li><li> Mix 6 pl Lipofectin Reagent (InvitrogenTM) in 100 ul F12K serum-vrij medium, het maken van een 1:1 verhouding van Lipofectin aan DNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-45 minuten. </li></ol> Meng de oplossingen van 1.5.1 met 1.5.2 in een druppelsgewijs fashion (totaal volume = 200 pi). Laten staan ​​bij kamertemperatuur 10-15 minuten. </li><li> Verwijder de oude groei medium van de cellen en was de cellen met 5 ml F12K serum vrij medium en verwijder vervolgens de F12K serum vrij medium. In een 15 ml tube, meng de transfectie mengsel in 1,8 ml vers F12K medium in een drop-wijs mode. Dan waste de cellen van stap 1.5 met PBS en voeg deze nieuwe transfectie oplossing voor de cellen. Incubeer gedurende 18 uur. </li><li> Verander het medium tot medium plus 10% foetaal runderserum F12K zonder antibiotica en 's nachts incuberen. Splitsen de cellen in twee T-25 flessen met F12K medium plus 10% foetaal runderserum zonder antibiotica voor een ander 18 uur (voor het splitsen van cellen zie stap 1.3). </li><li> Vervang het medium met selectieve medium (F12K medium plus 10% foetaal runderserum met 800μg/ml Geneticine, Invitrogen). Cultuur van de cellen met behulp van de selectief medium voor 3-4 weken. Na verloop van tijd zal dit selecteren voor cellen die stabiel zijn opgenomen het plasmide in hun genoom DNA. Doorgaan met het onderhouden van de cellen met behulp van het onderhoud medium (F12K medium plus 10% foetaal runderserum met 400μg/ml Geneticine). Periodiek bevriezen cellijnen met 1:1 verhouding van bevriezing media (selectief medium met 20% DMSO) om verliest in geval van onvoorziene besmetting te voorkomen. </li><li> Het selecteren van klonale cellijnen: als een eerste stap, trypsinize en centrifugeer de cellen van stap 1.8 met het onderhoud medium zoals in stap 1.3. Re-schorten cellen in 5 ml onderhoud medium, neem dan 0,5 ml van de cel te schorten en voeg 4,5 ml vers onderhoud medium om een ​​10x verdunning te maken. Breng de 10x verdunning in 12 wells van een 96 wells-plaat, het toevoegen van 100 pi aan elk goed om te selecteren op individuele cellen. </li><li> Blijf 10x seriële verdunningen van deze cellen te maken voor een theoretische laatste schorsing van een cel per 100 pl (normaal gesproken de laatste verwatering zal in de orde van 10 -11 zijn om 10 -19, het totale aantal van 10x seriële verdunningen is ~ 19) . Onmiddellijk na elke verdunning, overdracht 100 ul van de verdunning in 12 putjes van de 96 wells plaat. Na 18 uur incubatie, in acht platen met 96 putjes onder een omgekeerde licht of fluorescentie microscoop en mark putten die lijken te bevatten slechts een enkele cel of twee cellen die duidelijk gescheiden van een enkele cel bevatten. Houd het observeren van elke dag en veranderen medium om de drie dagen. </li><li> Als de putten 80% confluENT (ongeveer een week), spoel gemarkeerd putten met 200 ul PBS en trypsinize ze met 100 ul PBS-trypsine-EDTA-oplossing. Transfer cellen van elk gemarkeerd goed in een putje van een 6-well plaat met 1 ml onderhoud medium. Groeien die cellen gedurende 3 dagen dan overdracht cellen in individuele T25 fles. Test deze cellen met behulp van de calcium-bioluminescentie test met agonist peptiden (zie hoofdstuk 2). </li><li> Selecteer een cellijn van stap 1.11 met de hoogste respons in het calcium-bioluminescentie plaat assay en uit te voeren voor de tweede keer de single celselectie volgende stappen 1.9-1.11. Periodiek bevriezen cellijnen. </li><li> Vanaf de tweede selectie beschreven in stap 1,12, kies dan 2-3 cellijnen met de hoogste respons in het calcium-bioluminescentie plaat assay en te onderhouden in de cultuur voor meer calcium bioluminescentie plaat assays. Blijf op de hoogte van de passage nummers. Van tijd tot tijd, bevriezen cellijnen van de vroege passages, zodat u kunt altijd terug naar hen als de cellijnen met meer passages stop het consequent uitvoeren. </li></ol> 2. De calcium bioluminescentie plaat-test <ol><li> Afbinden van de reporter gen van interesse in een expressievector. Hier gebruikten we aequorine plasmide mtAEQ/pcDNA1 (een geschenk van Drs. CJP Grimmelikhuijzen en Michael Williamson, Universiteit van Kopenhagen, Denemarken). Transformeren het plasmide in E. coli-cellen MC1061/PS (Invitrogen) en zuiveren ze met behulp van een spin-QIAprep Miniprep kit (Qiagen Inc.) In de laatste stap elueren het plasmide met Tris-buffer, zonder EDTA, geen water. </li><li> Grow cellijnen uit stap 1,13 uiting van de gewenste receptor in onderhoud medium. Wanneer de cellen zijn 90% confluent, trypsinize, centrifuge en vervolgens de cellen weer te schorten in 5 ml onderhoud medium zoals in stap 1.3. Verdunnen cellen (ongeveer 10x met het onderhoud medium) en tel het aantal cellen met cel teller (Bright-Line hemacytometer) onder microscopie. Stel het aantal cellen tot ongeveer 2 x 10 5 cellen / ml (gemiddeld 20 cellen in een van de negen vierkanten toonde in de hemacytometer). Seed 2 ml verdund cellen in de media in elk putje van een zes goed plaat. Incubeer 24 uur (de cellen moet ongeveer 60% confluentie bereikt na incubatie). </li><li> Verandering media in de 6 putten plaat OPTI-MEM medium. Voor elke goed, mix 96 ul OPTI-MEM met 4 ul Fugene 6 Transfectie reagens (Roche Biochemicals) in een microfugebuis en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 1 ug van aequorine / pcDNA een plasmide DNA in elke buis en dan zachtjes het monster schudden gedurende 1 minuut, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten. Voeg elk mengsel in elk putje in een druppelsgewijze manier, terwijl zachtjes schudden van de wells plaat. Incubeer de platen gedurende 6 uur en verander het medium tot medium dat 10% foetaal runderserum zonder antibioticum F12K. </li><li> Na het incuberen van de cellen in zes goed plaat gedurende 24 uur, trypsinize, centrifuge en resuspendeer de cellen als in stap 1.3. Tel het aantal cellen tot 400.000 cellen / ml als stap 2.1 en overdracht 100 pi (totaal 40.000 cells/100 pi) in elk putje van een 96-wells witte dunne bodem microtiterplaat (Costar 3610). Incubeer nog eens 24 uur tot ongeveer 80% confluentie cel. Dit is de optimale concentratie van cellen voor de bioluminescentie test. </li><li> Bereid 90μl/well van een calcium-vrij DMEM medium (Invitrogen) met 5 uM coelenterazine (Invitrogen) in het donker (coelenterazine is gevoelig voor licht). Neem de plaat uit 2,4, verwijder de oude media en voeg deze 90μl in elk putje. Incubeer de platen gedurende 3 uur in het donker bij 37 ° C en 5% CO 2, waarna de cellen in de plaat staan ​​klaar om getest te worden. </li></ol> 3. Apparaat in werking en data-analyse <ol><li> Elke bioluminescentie plaat lezer is anders. Wij voeren onze test met behulp van een Novostar (BMG Labtechnologies) plaat-lezer in bioluminensence mode. Als u een ander instrument, moet u aan te passen het protocol. </li><li> Spoel de plaat lezer pompen (of PRIME pompen) voor gebruik. Schakel het licht in de kamer voordat de plaat op de plaat houder. Zodra de plaat houder heeft gesloten, zet het licht aan. </li><li> Oplosbaar te peptiden (in een 1,5 ml Eppendorf buis) in de calcium-vrij DMEM media. Stel de "Zuig Depth" en "Positie bepalen" van de peptide-oplossing voor gebruik. Daag de cellen met 10 pi (10x) van verschillende concentraties van de peptiden (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, of andere gewenste peptide) en onmiddellijk beginnen met het opnemen van de lichtemissie. Wij hebben het instrument om de lichtemissie (465 nm) record voor elk putje om de 2 seconden voor een totale tijd van 50 seconden. </li><li> Zorg ervoor dat u een positieve controle, zoals een actieve analoge (analoge FFFSWGa is gebruikt, Taneja-Bageshwar et al.., 2009) en een negatieve controle, zoals vector alleen getransfecteerde cellen bevatten. De negatieve controle nodig zal zijn tijdens de data-analyse aan de basislijn drempel (zie de vertegenwoordiger van resultaten).Een onafhankelijke, niet-actieve peptide kan ook worden toegevoegd als een negatieve controle. </li><li> Na de run is voltooid, was het instrument pomp (of PRIME POMPEN), dan plaats je volgende peptide monster. Uw gegevens opslaan en opnieuw was de pompen. </li><li> Data handling: Breng de gegevens van de lichtemissie uit elk putje in een Microsoft Excel-gegevens sheet. </li><li> Plak de gegevens uit Excel naar Prism software 4.0 vanaf GraphPad Software Inc (San Diego, CA, USA). De verschillende peptide concentraties is de X-as en bioluminescentie-eenheden is de Y-as. Te normaliseren van de gegevens, plot een log-response curve. Selecteer een niet-lineaire regressie-curve fit analyse (sigmoïdale dosis-respons vergelijking met variabele helling) naar de concentratie-respons curves te verkrijgen voor elk peptide. Het programma plots de waarden in het einde en geeft de EG-50. </li><li> Elk experiment moet drie keer worden herhaald voor data-analyse. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Uitgedrukt in CHO-K1-cellen, de mug Aedes aegypti kinine-receptor gedroeg zich als een multiligand receptor en functioneel gereageerd op de concentraties zo laag als 1 nM van de drie endogenours Aedes kinins, Aedae kinins 1-3, getest afzonderlijk met behulp van de calcium-bioluminescentie plaat-test . Figuur 1 laat zien dat de rangorde van de potentie verkregen was Aedae-K-3&gt; Aedae-K-2&gt; Aedae-K-1, gebaseerd op de respectieve EC 50-waarden van Aedae-K-3, 16.04 nM; Aedae-K- 2, 26,6 nM en Aedae-K-1, 48.85 nM, die statistisch significant verschillend (P &lt;0.05) (Pietrantonio et al., 2005).. We hebben ook gebruik gemaakt van deze test om te bepalen welke kinine resten zijn van cruciaal belang voor de kinine peptide-receptor interactie. Insect kinine peptiden hebben een C-terminale pentapeptide dat de minimale sequentie die nodig zijn voor biologische activiteit, ook wel bekend als kern vertegenwoordigt. In tabel 1 zijn de kinine-peptide kern-analogen gesynthetiseerd als een Alanine vervanging serie van de kern van kinine pentapeptide FFSWGa en getest door een calcium-bioluminescentie plaat assay (Taneja-Bageshwar et al., 2006).. We vonden dat de aminozuren Phe 1 en Trp 4 waren essentieel voor de activiteit van het insect kinins voor beide receptoren. De test kan ook worden gebruikt om peptiden is ontworpen voor een verbeterde biostability test. Tabel 2 toont de ontworpen kinine analogen met amino isoboterzuur (AIB) getest op het vinkje recombinante kinine-receptor en Figuur 2 toont de activiteit vergelijking van zes alpha-amino isoboterzuur-analogen op de teek kinine receptor uitdrukken CHO-K1-cellijn door een calcium- bioluminescentie plate assay (Taneja-Bageshwar et al.., 2009). De hexapeptide analoge FFFSWGa is toegevoegd voor een positieve controle voor receptor-activiteit. De analoge FF [Aib] WGA resulteerde actiever dan dit hexapeptide controle analoog. De analoge met twee aminoisobutyric zuur vervangers, [Aib] FF [Aib] WGA, was de meest krachtige van de dubbele vervanging analogen getest (tabel 2 en figuur 2). Voor meer voorbeelden van hoe deze test is en kan worden aangebracht, zie Nachman en Pietantonio (2010), Nachman et al.. (2009), Taneja-Bageshwar et al.. (2008a), en Taneja-Bageshwar et al.. (2008b). <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schatting van Aedes kinins effectieve concentratie (EC 50) op CHO-K1 E10 cellen door een calcium-bioluminescentie plate assay. De y-as in de concentratie-respons curves werd verkregen van bioluminescentie eenheden uitgedrukt als een percentage van de maximale respons waargenomen voor elk peptide. Datapunten geven het gemiddelde van zes identieke monsters verkregen gedurende drie onafhankelijke experimenten. Staven geven de standaardfout. (A) Schatting van Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Schatting van Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Schatting van Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 &lt;EC 50 Aedae-K2 &lt;EC 50 Aedae-K1, P &lt;0,05. Statistische analyse en grafieken waren met de GraphPad Prism 4.0 software. <img src="/files/ftp_upload/2732/2732fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Activiteit vergelijking van de zes alpha-amino isoboterzuur-analogen op de teek kinine receptor uitdrukken CHO-K1-cellijn door een calcium-bioluminescentie plaat-test. De y-as geeft procent maximale bioluminescentie eenheden voor elk analoge uitgedrukt als een percentage van de bioluminescentie waargenomen bij een concentratie ten opzichte van de maximale respons waargenomen bij alle concentraties getest voor elk analoog. Statistische analyse en grafieken werden uitgevoerd met GraphPad Prism 4.0 software. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> Tick-receptor cellijn </td><td colspan="2"> Mosquito receptor cellijn </td></tr><td> Peptiden </td><td> EC 50 (nM) </td><td> Maximale bioluminescentie respons bij een mM </td><td> EC 50 (nM) </td><td> Maximale bioluminescentie respons bij 1 mM </td><tr><td> AFSWGa </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FASWGa </td><td> 586 </td><td> 5600 </td><td> ND </td><td> 400 </td></tr><tr><td> FFAWGa </td><td> 64 </td><td> 12.800 </td><td> 621 </td><td> 3050 </td></tr><tr><td> FFSAGa </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FFSWAa </td><td> 417 </td><td> 10.600 </td><td> 2800 </td><td> 1830 </td></tr><tr><td> FFSWGa </td><td> 590 </td><td> 10.800 </td><td> ND </td><td> 525 </td></tr><tr><td> FSWGa </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FFSWa </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FFSWG-OH </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td><td> Ik </td></tr><tr><td> FFFSWGa </td><td> 259 </td><td> 13.000 </td><td> 562 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> FF [Aib] WGA </td><td> 29 </td><td> 12.700 </td><td> 445 </td><td> 9300 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Geschatte potenties (EG 50) en de maximale bioluminescentie reactie van alle peptiden getest op de pof en de mug-receptor getransfecteerde cellijnen *. * De EG 50 schat de concentratie die nodig is om een half-maximale respons te induceren. I: Inactieve als bioluminescentie reactie is minder dan 300 eenheden (niveau van de vector-only getransfecteerde cellen). A: De positie waar de respectievelijke residu in het peptide FFSWGa is vervangen door alanine. ND: De analoge werd getest, maar was of niet erg actief of niet actief was op lagere molarities, waardoor een EC50 kon niet worden vastgesteld. <table border="1"><tbody><tr><td> K-AIB-1 </td><td> [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-2 </td><td> [Α MEF] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-3 </td><td> Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-4 </td><td> Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-5 </td><td> [Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr><tr><td> K-AIB-6 </td><td> [AIB-AIB-AIB-Aib] RFF [Aib] WGA </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Kinine-analogen (K) met amino isoboterzuur (AIB) getest op het vinkje recombinante kinine receptor. Ac: acetyl; α Me: α methyl-fenylalanine, β3F: β3-fenylalanine, een: amide.

<ol><li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%27-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).</li>
<li>Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNachman%2C+R+%22Neuropeptide+systems+as+Targets+for+Parasite+and+Pest+Control%22">Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control</a>. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).</li>
<li>Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+development+of+novel+pest+management+agents+based+upon+insect+kinin+neuropeptide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biostable+agonists+that+match+and%2For+exceed+the+activity+of+insect+kinins+on+recombinant+arthropod+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs.</a> General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+insect+kinin+analogs+with+cis-peptide+bond%2C+type+VI-turn+motifs+identifies+optimal+stereochemistry+for+interaction+with+a+recombinant+arthropod+kinin+receptor+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus.</a> Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selective+and+non-selective%2C+biostable+beta-amino+acid+agonists+of+recombinant+insect+kinin+receptors+from+the+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+and+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti.</a> Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.</li>
<li>Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structure-activity+analysis+of+insect+kinin+core+analogs+on+recombinant+kinin+receptors+drom+southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+and+mosquito+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).</li>
<li>Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+a+multiligand+receptor+for+the+three+Aedes+kinins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins.</a> Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).</li>
<li>Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+G+protein-coupled+receptor+from+the+Southern+cattle+tick+Boophilus+microplus+%28Acari%3A+Ixodidae%29+identifies+it+as+the+first+arthropod+myokinin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor.</a> Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).</li>
<li>Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+insect+adipokinetic+hormone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).</li>
<li>Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+assay+for+agonist+activity+at+potentially+any+G-protein+coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor.</a> Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).</li>
</ol>

We waren in staat om de functionele karakterisering van de eerste neuropeptide receptor ontdekt van de Arachnida (teken, mijten en spinnen), de teek kinine-receptor te voeren, met behulp van dit protocol. Deze methode heeft drie primaire applicaties. Ten eerste kan de techniek worden toegepast voor de receptor ligand deorphanization door middel van activiteiten metingen. Ten tweede, kan de test op te lossen ligand-receptor structuur-activiteit relaties (SAR). Ten derde kunnen de methoden worden gebruikt in drug discovery. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt om de activiteit van agonisten of antagonisten op bijna elk GPCR te bestuderen. We beginnen om dit protocol aan te passen voor de screening van kleine bibliotheken. De cellijn we gebruik gemaakt drukt niet de alomtegenwoordige G-eiwit G 16. We hebben geen behoefte aan omdat geleedpotigen kinine-receptoren het signaal via de Gq eiwit en de intracellulaire calciumconcentratie cascade en ze sparen dit signalering eigenschappen in zoogdiercellen zoals hier te zien.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr><tr><td> CHO-K1-cellen </td><td> ATCC </td><td> CCL-61 </td><td> Manassas, VA, USA </td></tr><tr><td> F12K medium </td><td> Invitrogen </td><td> 21127 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA (10x) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotica-Antimycoticum </td><td> Invitrogen </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM ik Verminderde Serum Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectin Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 18292-011 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticine </td><td> Invitrogen </td><td> 10131035 </td><td></td></tr><tr><td> MC1061/P3 Ultracomp </td><td> Invitrogen </td><td> C663-03 </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep draaien Miniprep kit </td><td> Qiagen Inc </td><td> 19064 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene 6 transfectiereagens </td><td> Roche </td><td> 11 814 443 001 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well witte dunne bodem microtitere plaat </td><td> Costar </td><td> 3610 </td><td></td></tr><tr><td> calcium-vrij DMEM media </td><td> Invitrogen </td><td> 21068 </td><td></td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Invitrogen </td><td> C-2944 </td><td></td></tr><tr><td> Bright-Line hemacytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijke </td><td></td><td> Horsham, PA </td></tr><tr><td> Novostar </td><td> BMG Labtechnologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prism-software 4.0 </td><td> GraphPad Software Inc </td><td></td><td> San Diego, CA, USA </td></tr><tr><td> T-25 en T-75 Kolven </td><td> BD Falcon </td><td> 353014 en 353135 </td><td></td></tr></tbody></table>

een calcium bioluminescentie assay voor functionele analyse van mosquito ( aedes aegypti) en tick ( rhipicephalus microplus) g eiwit-gekoppelde receptoren

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Geleedpotige hormoon-receptoren zijn potentiële doelwitten voor nieuwe pesticiden als ze veel essentiële fysiologische en gedragsmatige processen te reguleren. De meerderheid van hen behoren tot de superfamilie van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s). Hebben we ons gericht op het karakteriseren van geleedpotige kinine-receptoren van de teek en de mug. Geleedpotige kinins zijn multifunctionele neuropeptiden met myotropic, diuretisch, en neurotransmitter functie. Hier, een methode voor systematische analyse van de structuur-activiteit-relaties van insecten kinins op twee heterologe kinine-receptor-expressie systemen wordt beschreven. Wij leveren belangrijke informatie die relevant is voor de ontwikkeling van biologisch stabiel kinine-analogen met het potentieel om het diureticum, myotropic, en / of de spijsvertering processen in teken en muggen te verstoren. De kinine-receptoren van de zuidelijke vee teek, Boophilus MicroPlus (Canestrini), en de mug Aedes aegypti (Linnaeus), waren stabiel uitgedrukt in de zoogdiercellijn CHO-K1. Functionele analyses van deze receptoren werden afgerond met behulp van een calcium-bioluminescentie plaat test die intracellulaire bioluminescentie maatregelen om de cytoplasmatische calcium te bepalen bij de peptide toepassing op deze recombinante cellen. Deze methode maakt gebruik van de aequorine eiwit, een photoprotein geïsoleerd van lichtgevende kwallen. We tijdelijk getransfecteerd het aequorine plasmide (mtAEQ/pcDNA1) in cellijnen die stabiel tot expressie van de kinine-receptoren. Deze cellen werden vervolgens behandeld met de cofactor coelenterazine, die complexen met intracellulaire aequorine. Deze band breekt in de aanwezigheid van calcium, uitzenden luminescentie niveau indicatie van de calciumconcentratie. Omdat de kinine-receptor-signalen door het vrijkomen van intracellulaire calcium, is de intensiteit van het signaal met betrekking tot de potentie van het peptide. Dit protocol is een synthese van een aantal eerder beschreven protocollen met wijzigingen; presenteert stap-voor-stap instructies voor de stabiele expressie van GPCR&#39;s in een zoogdiercellijn door middel van functionele plaat assays (Staubly et al., 2002 en Stables et al., 1997.. ). Met behulp van deze methodologie, waren we in staat om stabiele cellijnen uiting van de mug en de teek kinine-receptoren vast te stellen, de potentie van drie mug kinins vergelijken, kritieke aminozuur posities voor de ligand-receptor interactie, en het uitvoeren van semi-throughput screening van een peptide bibliotheek. Omdat insecten kinins zijn vatbaar voor snelle enzymatische afbraak door endogene peptidasen, worden ze ernstig beperkt in gebruik als instrumenten voor bestrijding van ongedierte of endocrinologische studies. Daarom hebben we ook getest kinine-analogen met amino isoboterzuur (AIB) om hun potentie en biostability te verbeteren. Dit peptidase-resistente analoog is een belangrijke voorsprong in de ontwikkeling van biologisch stabiel insecten kinine-analogen en kan helpen bij de ontwikkeling van neuropeptide-gebaseerde geleedpotige controle strategieën.

Dit protocol bevat instructies voor het klonale-cellijn selectie en een calcium-bioluminescentie test om de structuur-activiteit relaties van gesynthetiseerd geleedpotigen neuropeptiden op hun verwante GPCR&#39;s te analyseren. Deze test kan gebruikt worden voor receptor deorphanization en structuur-activiteit relatie studies voor synthetische analoog ontwerp en peptide / drug-lead discovery.

Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren

Hormoonreceptoren van arthropoden zijn potentiële doelwitten voor nieuwe pesticiden, aangezien zij vele essentiële fysiologische en gedragsmatige processen reguleren. De ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de structuur-activiteitsrelaties van gesynthetiseerde arthropode neuropeptiden op hun cognate GPCR te analyseren. Dit wordt bereikt door Chinese hamster ovarium (CHO)-K1-lege cellen te transfecteren met de gewenste GPCR-expressievector om stabiel getransformeerde cellijnen afgeleid van een enkele cel te verkrijgen. Als tweede stap wordt de stabiele cellijn getransfecteerd met het quaran-plasmide, dat de reporter GCaMP Quaran bevat voor het meten van intracellulaire bioluminescentie in de calcium-bioluminescentie-plaatassay. Vervolgens wordt de calcium-bioluminescentie-plaatassay uitgevoerd om de cytoplasmatische calciumspiegels te bepalen na toevoeging van peptide-liganden aan deze recombinante cellen.De resultaten tonen verschillen in bioluminescentie-eenheden aan na toediening van structureel verschillende peptiden of verschillende peptideconcentraties aan de recombinante cellen, gebaseerd op de opgewekte intracellulaire calciumvrijgave zoals gedetecteerd door de reporter a corrin in de plaatassay. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van stabiel getransformeerde clonale cellellijnen die recombinante GPCR's tot expressie brengen boven transiënte expressieprotocollen is dat de receptorexpressieniveaus uniformer zijn, wat zorgt voor consistentie in de resultaten. Bovendien maakt de targeting van het aquarium-eiwit naar de mitochondriën gevoelige calciummetingen via bioluminescentie mogelijk; het experiment van vandaag zal worden uitgevoerd door twee promovendi, Shall in Lie en Simon Kersch, evenals een postdoc uit mijn laboratorium.Om stabiele cellijnen te vestigen, begint u met het kweken van Chinese hamster ovary (CHO), K1-lege cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Houd de lege cellen in groeimedium met 1x antibioticum-antimycoticum zodra de cellen gezond groeien. Zaai de Chinese hamster ovary K1-cellen uit in T25-weefkweekflessen en laat de cellen gedurende de nacht groeien in groeimedium zonder antibiotica tot ze ongeveer 30% confluent zijn.Vóór de transfectie: bereid een DNA-expressievector voor die de GPCR van belang bevat, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Meng het DNA met 100 microliters Optum reduced serum medium.Meng zes µL lipofectiereagens met 100 µL serumvrij F 12 K-medium en laat dit 30 tot 45 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Meng na incubatie het DNA en de lipofectie-oplossingen voorzichtig door ze druppelsgewijs samen te voegen. Laat het mengsel 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur staan in een buis van 15 mL.Meng het transfectiemengsel voorzichtig druppelgewijs in 1,8 milliliters vers F 12 K medium. Was de cellen vervolgens met PBS en voeg deze nieuwe transfectieoplossing toe aan de cellen. Na een incubatie van 18 uur.Vervang het medium door F 12 K-medium plus 10% FBS zonder antibiotica en incubeer dit de volgende dag gedurende de nacht. Verdeel de cellen over twee T 25-flessen met F 12 K-medium plus 10% FBS zonder antibiotica, zoals beschreven in de schriftelijke procedure. Incubeer nogmaals 18 uur.Vervang het medium door selectief medium. Kweek de cellen vervolgens gedurende drie tot vier weken in het selectieve medium. Hierdoor worden de cellen geselecteerd die het plasmide stabiel in hun genomisch DNA hebben geïncorporeerd.Ga door met het onderhouden van de cellen met behulp van onderhoudsmedium en vries de cellenlijnen periodiek in om verlies te voorkomen in geval van onverwachte contaminatie. Om clonale cellenlijnen te selecteren, moeten de cellen eerst worden getrypsiniseerd en gecentrifugeerd met onderhoudsmedium, zoals beschreven in het geschreven protocol. Resuspendeer de cellen vervolgens in vijf milliliter onderhoudsmedium.Verwijder 0,5 milliliters van de celsuspensie en voeg 4,5 milliliters vers onderhoudsmedium toe om een 10 x verdunning te maken; breng vervolgens 100 microliters van de 10 x verdunning over in 12 wells van een 96-well plaat om op enkelvoudige cellen te selecteren. Zet dit voort door deze cellen ongeveer 19 keer in 10 x seriële verdunningen te brengen voor een theoretische finale suspensie van één cel per 100 microliters, en breng 100 microliters van elke seriële verdunning over in 12 wells van een 96-well plaat. Observeer de 96-well platen na 18 uur incubatie onder een inverted licht- of fluorescentiemicroscoop en markeer de wells die naar verwachting slechts één enkele cel bevatten, of twee cellen die duidelijk zijn voortgekomen uit één enkele cel door deling.Observeer de platen dagelijks en ververs het medium elke drie dagen. Laat de cellen een week groeien tot ze ongeveer 80% confluent zijn. Spoel vervolgens de gemarkeerde wells af met 200 µL PBS en trypsine.Spoel ze met 100 µL PBS tripsine EDTA-oplossing. Verwijder de PBS tripsine EDTA-oplossing. Voeg 100 µL onderhoudsmedium toe en overbreng de cellen van elke gemarkeerde well naar één well van een zes-wells plaat met 1 mL onderhoudsmedium.Nadat de cellen drie dagen in de zeswellsplaat zijn gekweekt, worden ze overgebracht naar individuele T 25-flasks. Vries de cellijn periodiek in, zodat deze kunnen worden teruggehaald als de cellen niet langer consistent presteren. Om de cellijn met de hoogste respons te bepalen, worden de overgebrachte cellen getest met de calcium-bioluminescentie-assay met een actief ligand, zoals de receptor, het peptide, het ligand of een andere positieve controle-agonist.De calcium-bioluminescentie-assay zal later in deze video in detail worden gedemonstreerd. Voer de selectie van enkelvoudige cellen voor een tweede keer uit voordat u met het experiment verdergaat. Wanneer clonale cellijnen worden gekozen voor assays en in cultuur worden gehouden, is het essentieel om de passagesnummers bij te houden, aangezien cellen met een hoog passagesnummer mogelijk niet meer optimaal functioneren in een T 25-fles.Kweek cellijnen die de gewenste receptor tot expressie brengen in onderhoudsmedium tot ongeveer 90% confluentie. Na het trypsiniseren en centrifugeren van de cellen, resuspendeer deze in het onderhoudsmedium, verdun de cellen ongeveer 10 x met onderhoudsmedium en tel het aantal cellen met een hemocytometer. Pas vervolgens het celgetal aan naar ongeveer twee keer 10⁵ cellen per milliliter. Zaai twee milliliter van de cellen in elke put van een zes-putsplaat en incubeer de plaat gedurende 24 uur; na deze tijd moeten de cellen ongeveer 60% confluent zijn voorafgaand aan de start van de calcium-bioluminescentie-plaatassay.Bereid het reportergen van belang voor in het expressievectorconstruct. Hier wordt een mitochondriaal tot expressie gebracht quorum-report gebruikt. Transfect vervolgens de cellen met één µg van dit reporterplasmide, zoals beschreven in het geschreven protocol.Na het incuberen van de cellen in een plaat met zes putjes gedurende 24 uur, worden de cellen getrypsineerd, gecentrifugeerd en geresuspendeerd. Tel het aantal cellen tot 400 000 cellen per milliliter en breng 100 µL over naar elk putje van een witte 96-well microtiterplaat met een dunne bodem; incubeer nogmaals 24 uur tot een confluentie van ongeveer 80% is bereikt. Dit is de optimale celconcentratie voor de bioluminescentie-assay. De volgende stappen moeten in het donker worden uitgevoerd, maar worden hier in het licht getoond.Bereid voor demonstratiedoeleinden voldoende calciumvrij DME-medium voor dat vijf micromolar CHO terezin bevat voor 90 microliters per putje. Verwijder het oude medium uit de plaat en voeg aan elk putje 90 microliters toe. Incubeer de platen gedurende drie uur in het donker bij 37 °C en 5% CO2, waarna de cellen klaar zijn om te worden getest.Deze demonstratie wordt uitgevoerd met een Nova star platlezer in bioluminescentie-modus. Om te beginnen met de spoeling, moeten de machinepompen van de plaat in de plaathouder worden geplaatst terwijl deze in het donker staat. Los de peptiden op in een EOR-buisje van 1,5 milliliter.Gebruik voldoende calciumvrije DME en medium voor 10 µL van 10 x peptide per well. Stel vóór gebruik de aspiratiediepte en de positiebepaling van de peptideoplossing in. Stimuleer de cellen met 10 µL van het peptide en begin onmiddellijk met het registreren van de lichtemissie.In deze demonstratie is het instrument ingesteld om de lichtemissie bij 465 nanometer voor elke well elke twee seconden te registreren gedurende een totale tijd van 50 seconden. Nadat de run is voltooid, moeten de pompen van het apparaat worden gespoeld. Herhaal dit proces voor elk peptide-monster, sla de gegevens op en spoel de pompen van het apparaat na de assay opnieuw.De gegevens van de lichtemissie van elke put worden door het softwareprogramma automatisch overgebracht naar een Microsoft Excel-werkblad. Plak de gegevens vanuit Excel in Prism Software 4.0. Maak een grafiek met de verschillende peptideconcentraties op de x-as en bioluminescentie-eenheden.Select in de Y-as een niet-lineaire regressiecurvefit-analyse om concentratie-responscurves te verkrijgen voor elk peptide en hun bijbehorende EC 50-waarden. Elk experiment dient drie keer te worden herhaald voor de data-analyse. Wanneer tot expressie gebracht in Chinese hamster ovary, K one-cellen, gedroeg de kinine-receptor van de mug Aedes aegypti zich als een multi-ligandreceptor en reageerde functioneel op concentraties zo laag als 1 nM.Voor de drie endogene kininen van Rhipicephalus microplus die afzonderlijk zijn getest met de calcium-bioluminescentie-plaatassay. Er werden statistisch verschillende EC 50-waarden bepaald van ongeveer 16 nanomolar voor Rhipicephalus microplus kinine 3, 26 nanomolar voor Rhipicephalus microplus kinine 2 en 49 nanomolar voor Rhipicephalus microplus kinine 1, wat resulteerde in een volgorde van potentie waarbij Rhipicephalus microplus kinine 3 het meest potent was en Rhipicephalus microplus kinine 1 het minst potent. Hier volgt de vergelijking van de activiteit van zes alfa-aminoisobutyric acid kinine-analogen op de Chinese hamster ovary K1-cellijn die de tekenkininereceptor tot expressie brengt, bepaald via een calcium-bioluminescentie-plaatassay.De Y-as representeert het percentage maximale bioluminescentie-eenheden voor elke analoog, uitgedrukt als een percentage van de bioluminescentie waargenomen bij een specifieke concentratie ten opzichte van de maximale respons waargenomen bij alle geteste concentraties voor elke analoog; de KININE HEXA-peptide F-F-F-S-W-G amide analoog dient als positieve controle voor receptoractiviteit. De enkelvoudige vervangings-kinine-analoog double F amino ISO butyric acid WG amide was actiever dan de positieve controle HEXA-peptide KININE-analoog; de KININE-analoog met twee aminoboterzuurvervangingen, aminoboterzuur FF aminoboterzuur WG amide, was de meest potente van de geteste dubbele vervangingsanalogen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u A-G-P-C-R tot expressie brengt en clonale cellijnen verkrijgt om structuur-activiteitsrelaties van liganden op receptoren te analyseren middels een calcium-bioluminescentie-assay.

a-calcium-bioluminescence-assay-for-functional-analysis-mosquito

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Methoden voor het gebruik van Alphavirus transducing systemen om TL-verslaggevers uit te drukken in vitro en in volwassen muggen worden beschreven. Deze techniek kan worden aangepast aan een eiwit van belang uit te drukken in plaats van of naast een verslaggever.

Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Source: Lark, A. R., et. al.,  In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates real-time imaging of calcium dynamics using Green fluorescent protein-aequorin bioluminescence in Drosophila's deep brain structures.

Bioluminescence Imaging for Studying Calcium Transients in Drosophila Brain Structures

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.

Reproduceerbaar dsRNA Microinjection en Oviposition Bioassay in muggen en huis vliegt

Beschreven is een tijd- en ruimtebesparende methode om eieren te tellen en de broedsnelheden van individuele muggen te bepalen met behulp van 24 putweefselkweekplaten, die de schaal en snelheid van vruchtbaarheids- en vruchtbaarheidstesten aanzienlijk kunnen verhogen.

Verbeterde vruchtbaarheid en vruchtbaarheidstest voor Aedes aegypti met behulp van 24 well tissue kweekplaten (EAgaL-platen)

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Procedures worden beschreven voor het bestuderen van het sonderende en innamegedrag van Culex tarsalis muggen op menselijke handen met behulp van AC-DC elektropenetragrafie.

AC-DC Electropenetrografie voor de studie van sonderend en innamegedrag van Culex tarsalis muggen op mensenhanden

Een vereenvoudigde toch nauwkeurige methode voor het verzamelen en vlekken mug hemocytes wordt beschreven. Onze methode combineert de eenvoud van perfusie met de nauwkeurigheid van hoge injectie technieken om schoon voorbereidingen van hemocytes in Aedes muggen te isoleren. Deze methode maakt studies vereist kennis van de soorten hemocytes en hun overvloed.

Een protocol voor het verzamelen en Kleuring Hemocytes uit de Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti</em

Leer een calciumbioluminescentie-assay voor functionele analyse van G-eiwit-gekoppelde receptoren in muggen en teken. Deze methode ondersteunt onderzoek naar structuur-activiteitrelaties en medicijnontwikkeling.

Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren (Video) | JoVE Journal

Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren

Meer video's verkennen