Name: Bioluminescent Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Ontdek een bioluminescente reporterfaag voor de snelle detectie van Yersinia pestis. Deze methode maakt identificatie van deze categorie A pathogeen mogelijk binnen minuten in plaats van dagen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de Small Business Innovation Research programma van de National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) en de USDA Nationaal Instituut voor Voedsel-en Landbouworganisatie (NIFA, 2009-33610-20028).

1. Y. pestis plaat inoculatie <ol><li> Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) voorraad culturen op Luria-Bertani (LB) agar (Miller). Gebruik steriele techniek en uitvoeren van alle Y. pestis manipulaties in een klasse II, type A bioveiligheid kast. Y. pestis A1122 is een Biosafety Level (BSL) 2 uitgesloten te selecteren middel stam. Het ontbreekt zowel de 75 kb paar low-calcium respons (LCR) virulentie plasmide, en het PGM locus die nodig zijn voor virulentie. Grow Y. pestis bij 28 ° C gedurende 48 h in een statische temperatuur geregelde luchtvering incubator. Het groeitempo van Y. pestis is langzaam met een generatie tijd van 1.25 uur 9. </li></ol> 2. Y. pestis vloeibare media inoculatie <ol><li> Overdracht een Y. pestis kolonie in een steriele 17 x 100 mm cultuur buisje met 2 ml van LB bouillon met behulp van een steriele metalen inenting lus. Selecteer een kolonie die is uniform in grootte, is een indicatie van de andere kolonies, en is duidelijk gescheiden van de rest van de kolonies op de plaat. Vortex buis kort en cultuur op te groeien 28 ° C gedurende ongeveer 20 uur in een incubator schudden (225 rpm). </li></ol> 3. Y. pestis uitgroei, verslaggever faag Bovendien, en lichtgevende detectie <ol><li> Verdun de 's nachts Y. pestis cultuur 1:20 in de frisse LB bouillon in een 50 ml Falcon buis (bv, 500 pl van cellen in 9,5 ml medium) en groeien bij 28 ° C met schudden (225 rpm). Groeien tot een optische dichtheid bij 600 nm (A 600) van 0,2 is bereikt (ongeveer 5 uur). Actief groeiende cellen zijn voorkeur voor de detectie, omdat het vermogen van de faag te transduceren een bioluminescente reactie is gecorreleerd aan de levensvatbaarheid en de conditie van de gastheer bacteriën. Toch is het detectiesysteem is aangetoond dat ze compatibel met cellen geoogst in alle fasen van de groeicyclus 7. </li><li> Het genereren van de ondergrond nodig is voor de lichtgevende reactie door het opstellen van een 2% n-decanal oplossing. Meng 200 ul van n-decanal met 9,8 ml van LB bouillon. Vortex krachtig gedurende 5 seconden Prime de microplaat luminometer injector met 2 ml van de 2% n-decanal oplossing. Pre-set de luminometer tot 67 pi van de decanal oplossing autoinject aan elke microtiterplaat goed en direct daarna het monster te lezen voor 10 s. </li><li> Verdeel 1 ml porties van LB bouillon in drie cultuur buizen. Voeg 20 ul van de verslaggever faag stockoplossing (voorraad van 5 x 10 9 plaque-vormende eenheden [PFU] / ml) aan elke buis, de faag en de media alleen samples fungeert als een negatieve controle. Bij het ​​ontbreken van Y. pestis cellen, zou de toevoeging van de verslaggever faag niet lokken een bioluminescente reactie. </li><li> Verdeel 1 ml porties van de Y. pestis cultuur (van stap 3.1) in zes cultuur buizen. Voeg 20 ul van de verslaggever faag voorraad tot en met 3 van de culturen (test culturen). De resterende drie culturen dienen als een 'cellen alleen' negatieve controle (achtergrond autobioluminescence). Meng culturen door vortexen kort, en de oogst 200 pi van elk monster (voor de tijd 0 gelezen) en afzien in een witte 96-well microtiterplaat. Incubeer de resterende cultuur bij 28 ° C met schudden (225 rpm). </li><li> Meet de tijd 0 monsters voor bioluminescentie (relatief lichte eenheden, RLU) met behulp van de microplaat luminometer. </li><li> Oogst 200 pi van elk monster na 10, 20, 30, 40, 50 en 60 min na-reporter faag Daarnaast, en meet het monster voor bioluminescentie. Als Y. pestis-cellen aanwezig zijn, zal de verslaggever faag specifiek binden aan de cel, zijn DNA injecteren en gebruik de gastheren transcriptionele en translationele machines te transcriberen en vertalen van de luxAB reporter genen (figuur 1). </li><li> De sterkte van het signaal en het signaal responstijd is evenredig aan het aantal cellen aanwezig. Bij hoge concentraties van de cellen (10 5 -10 8 CFU / ml), een aanzienlijke toename van RLU ten opzichte van de controles moet blijken binnen 20 minuten. Bij lagere concentraties cel, (10 2 -10 4 CFU / ml), moet een aanzienlijke toename van RLU zichtbaar zijn binnen 40-60 minuten. </li><li> Als alternatief voor het opsporen proces te versnellen, zonder de noodzaak voor Y. pestis uitgroei, een kolonie van een vers volwassen plaat kan worden gemengd (en door vortexen) direct in een 1,5 ml Eppendorf buis met 200 pi van LB bouillon herbergen de verslaggever faag. Doseer de cel / faag mengsel in een putje van een microtiterplaat. Incubeer de microtiterplaat bij 28 ° C en lees de steekproef voor bioluminescentie na 60 min (enkel tijdstip only). </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Een vertegenwoordiger tijdsverloop experiment van de reporter faag gemedieerde detectie van Y. pestis is afgebeeld in figuur 2. De negatieve controles van 1) faag alleen (geen cellen), of 2)-cellen alleen (zonder faag) geven baseline niveaus van bioluminescentie van ongeveer 20 RLU in de 60 min incubation (baseline niveaus zijn luminometer specifiek). In tegenstelling tot een verhoging van de bioluminescentie voor de test monsters (verslaggever faag en cellen) wordt duidelijk op 15 minuten na faag toevoeging. De signaalsterkte moet gestaag stijging ten opzichte van 60 minuten. Incubaties voor langere perioden (meer dan 80 min), zal resulteren in een signaal dat zal dalen van de piek signaal te wijten aan gemedieerde lysis van gastheercellen faag. Vergelijkbare resultaten worden verkregen bij incubatie temperaturen van 37 ° C, ook al is de optimale temperatuur voor Y. pestis groei is 28 ° C 9. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Faag-gemedieerde bioluminescente detectie van Y. pestis. Op tijdstip 0, verslaggever faag en cellen werden gemengd, geïncubeerd bij 28 ° C, en bioluminescentie (RLU) werd gevolgd in de tijd. Een significante toename in RLU (* Studenten t-test, p &lt;0,05) is duidelijk binnen 15 minuten.

<ol><li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threats+in+bioterrorism.+I%3A+CDC+category+A+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Med+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22Laboratory+manual+of+plague+diagnostic+tests.%22">Laboratory manual of plague diagnostic tests.</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).</li>
<li>, (1999).</li>
<li>Inglesby, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthrax+as+a+biological+weapon%2C+2002%3A+updated+recommendations+for+management%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management.</a> JAMA. 287, 2236-2252 (2002).</li>
<li>Schuch, R., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+genomic+analysis+of+the+Wbeta+and+gamma+phages+infecting+Bacillus+anthracis%3A+implications+for+evolution+of+environmental+fitness+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance.</a> J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).</li>
<li>Garcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Yersinia+pestis+bacteriophage+phiA1122+reveals+an+intimate+history+with+the+coliphage+T3+and+T7+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes.</a> J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+bioluminescent+phage+for+detection+of+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).</li>
<li>Schofield, D. A., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-mediated+bioluminescent+detection+of+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22CDC%3A+Basic+laboratory+protocols+for+the+presumptive+identification+of+Yersinia+pestis%22">CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).</li>
<li>Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+differentiation+between+Pasteurella+pestis+and+Pasteurella+pseudotuberculosis+by+action+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage.</a> J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).</li>
<li>Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Action+of+Pasteurella+pestis+Bacteriophage+on+Strains+of+Pasteurella%2C+Salmonella%2C+and+Shigella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella.</a> J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).</li>
<li>Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Yersinia+pestis+using+amplification+of+plague+diagnostic+bacteriophages+monitored+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR.</a> PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).</li>
</ol>

Deze methode toont het vermogen van de verslaggever faag om snel te detecteren Y. pestis, omdat de verslaggever faag kan transduceren een lichtgevend signaal reactie op gekweekte Y. pestis cellen binnen 20 minuten na faag toevoeging. De verslaggever faag is ook in staat om direct opsporen van Y. pestis in klinische matrices, zonder de voorwaarde van de isolatie en de daaropvolgende teelt 7. Vergeleken met de standaard-faag lysis testen die vereisen over het algemeen 48 uur voor de v...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Difco LB agar, Miller </td><td> VWR </td><td> 90003-346 </td></tr><tr><td> Difco LB bouillon, Miller </td><td> VWR </td><td> 90003-350 </td></tr><tr><td> 17 x 100 mm kweekbuizen </td><td> USA Wetenschappelijke </td><td> 1485-0810 </td></tr><tr><td> n-Hoofdkerk </td><td> Sigma </td><td> D7384 </td></tr><tr><td> Veritas microplaat luminometer </td><td> Turner Biosystems </td><td> 9100-001 </td></tr><tr><td> Microlite microtiter 96-well plaat </td><td> VWR </td><td> 62402-984 </td></tr></tbody></table>

&#39;bioluminescent&#39; reporter faag voor de detectie van categorie a bacteriële pathogenen

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis en Bacillus anthracis zijn categorie A bacteriële ziekteverwekkers die de verwekkers van de pest en anthrax, respectievelijk 1. Hoewel de natuurlijke aanwezigheid van beide ziekten 'is nu relatief zeldzaam, de mogelijkheid van terroristische groeperingen gebruik van deze pathogenen als een biowapen is echt. Vanwege de ziekte die inherent zijn besmettingsgevaar, snelle beloop, en een hoge mortaliteit, is het essentieel dat een uitbraak snel kan worden opgespoord. Daarom methodologieën die een snelle opsporing en diagnose te bieden zijn essentieel voor de onmiddellijke uitvoering van public health maatregelen en de activering van de crisisbeheersing te garanderen. Recombinant verslaggever faag kunnen voorzien in een snelle en specifieke aanpak voor de detectie van Y. pestis en B. anthracis. De Centers for Disease Control and Prevention op dit moment gebruik maken van de klassieke faag lyse assays voor de bevestigde identificatie van deze bacteriële pathogenen 2-4. Deze testen profiteren van natuurlijk voorkomende faag, die specifieke en lytische zijn voor hun bacteriële gastheren. Na een nacht groei van de bacterie gekweekt in de aanwezigheid van de specifieke faag, de vorming van plaques (bacteriële lysis) biedt een positieve identificatie van de bacteriële doel. Hoewel deze tests zijn robuust, ze lijden aan drie tekortkomingen: 1) ze zijn laboratorium gebaseerd zijn, 2) ze vereisen bacteriële isolatie en kweek van het verdachte monster, en 3) zij nemen 24 tot 36 uur om te voltooien. Om deze problemen werden recombinant "light-tag" reporter faag genetisch gemanipuleerde door het integreren van de Vibrio harveyi luxAB genen in het genoom van Y. pestis en B. anthracis specifieke faag 5-8. De resulterende luxAB reporter faag waren in staat om hun specifieke doelgroep te detecteren door snel (binnen een paar minuten) en gevoelig verlenen van een bioluminescente fenotype aan ontvanger cellen. Belangrijk is dat detectie verkregen, hetzij met gekweekte cellen of de ontvanger met een mock-geïnfecteerde klinische monsters 7. Ter demonstratie, hier beschrijven we de methode voor de faag-gemedieerde detectie van een bekende Y. pestis isoleren met behulp van een luxAB reporter faag opgebouwd uit de CDC pest diagnostische faag ΦA1122 6,7 (figuur 1). Een vergelijkbare methode, met kleine wijzigingen (bv. verandering in de groei temperatuur en media), kan worden gebruikt voor de detectie van B. anthracis isolaten, met behulp van de B. anthracis verslaggever faag Wβ:: luxAB 8. De methode beschrijft de faag-gemedieerde transductie van een biolumescent fenotype aan gecultiveerde Y. pestis cellen die vervolgens worden gemeten met behulp van een microplaat luminometer. De belangrijkste voordelen van deze methode boven de traditionele faag lysis assays is het gebruiksgemak, de snelle resultaten en de mogelijkheid om gelijktijdig te testen meerdere monsters in een 96-well microtiterplaat-formaat. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Detectie schema. De faag worden gemengd met het monster, de faag infecteert de cel, luxAB worden uitgedrukt, en de cel bioluminesces. Monster verwerking is niet noodzakelijk, de faag en cellen worden gemengd en vervolgens gemeten voor licht.

Een eenvoudige methode voor de identificatie van de prioritaire bacteriële pathogenen is het gebruik van genetisch gemanipuleerd reporter faag. Deze verslaggever faag, die specifiek zijn voor hun specifieke gastheer soorten, zijn in staat om snel transduceren een lichtgevend signaal naar aanleiding van gastheercellen. Hierin beschrijven we het gebruik van de reporter faag voor de detectie van<em&gt; Yersinia pestis</em&gt;.

&#39;Bioluminescent&#39; Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen

Yersinia pestis en Bacillus anthracis zijn bacteriële pathogenen van categorie A die respectievelijk de veroorzakende agentia zijn van de pest en miltvuur 1. ...

Yesinia Pestis en Bacillus Anthrax zijn bacteriële pathogenen van categorie A die respectievelijk de veroorzakende agentia zijn van de pest en miltvuur. Hoewel het natuurlijk voorkomen van beide ziekten nu relatief zeldzaam is, is de mogelijkheid dat terroristische groepen deze pathogenen als biologisch wapen gebruiken reëel. Deze video demonstreert een methode om yersinia pestis te detecteren en te identificeren.Eerst wordt het micro-organisme gekweekt op agri-platen en in vloeibare media. Vervolgens wordt een y pesti-specifieke reporter-pH aan de cultuur toegevoegd. De reporter-pH bevat de genen die coderen voor bacterieel luciferase, luxe AB in zijn genoom.Indien Y pesti-cellen aanwezig zijn, zal de reporterfage specifiek aan de cel binden, zijn recombinante DNA injecteren dat de luxe AB-genen bevat, en de transcriptionele en translationele machinerie van de gastheer gebruiken om de luxe AB-reportergenen te transcriberen en te translateren. De resultaten tonen aan dat de monsters een bioluminescent fenotype hebben verworven, wat aangeeft dat het onbekende micro-organisme positief is geïdentificeerd als why pestis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de traditionele fagenlyse-assay, is dat de tijd die nodig is om your senior pestis te detecteren en te identificeren minuten in plaats van dagen bedraagt. Deze methode kan helpen bij de snelle identificatie en detectie van de aanwezigheid van Yesenia pesti met behulp van geïsoleerde culturen of direct vanuit complexe klinische of milieu-monsters.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van de pest, aangezien de ziekte gewoonlijk fataal is als er niet binnen de eerste 24 uur na het begin van de symptomen wordt behandeld. Daarom is de tijdige identificatie van Yesenia pests essentieel voor een positieve prognose. Aangezien er fagen bestaan voor bijna alle bacteriële soorten, kan de methodologie potentieel worden aangepast voor elke soort die medisch, ecologisch of landbouwkundig net zo belangrijk is als Y pestis.A 1122 is een stam van een uitgesloten select agent op bioveiligheidsniveau twee. Deze mist zowel het 75 Kilobase Perlo calciumrespons- of LCR-virulentieplasmide als de PGM-locus die vereist zijn voor virulentie. Begin deze procedure in een klasse II type A veiligheidskabinet met behulp van steriele techniek door Y. pestis, A 1122 uit te strijken.Ent stokculturen op LB-agar zoals hier wordt getoond. Plaats de platen ondersteboven in een statische, temperatuurgecontroleerde luchtincubator bij 28 °C gedurende 48 uur. De groeisnelheid van Y. pestis is laag, met een generatietijd van 1,25 uur na twee dagen.Gebruik een steriele metalen inoculatielus om een enkele y pestis-kolonie op te nemen. Selecteer een kolonie die uniform van grootte is, representatief is voor de andere kolonies en duidelijk gescheiden is van de rest van de kolonies op de plaat. Breng de kolonie over naar een steriele cultuurbuis van 17 bij 100 millimeter die twee milliliters LB-bouillon bevat.Sluit de buis af, vortex kortstondig en plaats deze vervolgens in een schudincubator bij 225 RPM en 28 °C gedurende ongeveer 20 uur. Voor deze assay hebben actief groeiende cellen de voorkeur voor detectie. Aangezien het vermogen van de faag om te transduceren is, correleert een bioluminescente respons met de levensvatbaarheid en fitheid van de gastheerbacteriën.Desondanks is aangetoond dat het detectiesysteem compatibel is met cellen die in alle stadia van de groeicyclus zijn geoogst. Verdun na 20 uur groei de Y pestis-cultuur 1 op 20 in een conische buis van 50 milliliter door 500 µL cellen toe te voegen aan 10 milliliter lb-bouillon. Plaats de cultuur terug in de schudincubator bij 28 °C.Laat de cultuur groeien tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,2 is bereikt. Dit zou ongeveer vijf uur moeten duren om het bioluminescente reactiesubstraat te genereren. Bereid een 2% N-decanaaloplossing voor door 200 µL N-decanal te mengen met 9,8 ml LB-bouillon.Vortex krachtig gedurende vijf seconden. Prime vervolgens de injector van de Microplate Luminometer. Plaats het ene uiteinde van de injectoreslang in een buis van 13 milliliter met 2% decal-oplossing en het andere uiteinde van de injectoreslang in een afvalcontainer.Instructeer de machine via de software van het apparaat om de injectielijn te primen met twee milliliters van de decanaaloplossing. De lijn moet na voltooiing gevuld zijn met een substraat; plaats het uiteinde van de injectielijn terug in de ingestelde positie, klaar voor injectie in de wells. Instructeer de luminometer vervolgens om 67 microliters van de deeloplossing in elke microplate te autoinjecteren.Meet vervolgens onmiddellijk het niveau van de uitgezonden bioluminescentie gedurende 10 seconden. Label daarna, ter voorbereiding van elk monster, drie kweekbuisjes in triplo voor elke conditie. Hierbij worden, naast een testmonster, alleen controles voor de fase en alleen controles voor de cellen voorbereid.Er zijn negen buizen nodig voor het bereiden van controlemonsters met alleen fagen; verdeel aliquots van 1 mL LB-bouillon over drie kweekbuizen. Voeg aan elke buis 20 µL van de reporter-faag toe vanuit een voorraadoplossing met een concentratie van 5 × 10⁹ plaque-vormende eenheden (PFU) per mL.Bij afwezigheid van Y pesti-cellen mag de toevoeging van de reporterfaag geen bioluminescente respons uitlokken. Verdeel vervolgens, ter voorbereiding van de testmonsters, aliquots van één milliliter van de Y pesti-cultuur over drie cultuurbuizen. Voeg 20 microliters van de reporterfaagstock toe aan drie van de culturen.Meng de culturen door ze kort te vortexen om de cellen alleen voor te bereiden. Voor de negatieve controles, die worden gebruikt om de achtergrond-autobioluminescentie te bepalen, worden aliquots van één milliliter van de Y. pestis-cultuur verdeeld over drie extra cultuurbuisjes. Zodra de monsters zijn voorbereid, worden 200 µL van elke cultuur overgebracht naar de wells van een witte 96-well microtiterplaat voor de tijd nul-meting.Plaats het restant van elke cultuur in de schudmachine bij 28 °C met behulp van een microplaat-luminometer. Meet de tijd. Stel de nulwaarde in voor bioluminescentie of relatieve lichteenheden.Voer bioluminescentiemetingen uit door 200 µL van elke cultuur te oogsten en metingen te verrichten in de microplaat-luminometer na 20, 30, 40 en 60 minuten. Om het detectieproces te versnellen zonder dat er een groei van y pestis nodig is, wordt de reporterfaag toegevoegd; breng hiervoor een kolonie van een vers gegroeide plaat over naar een microcentrifugebuisje met 200 µL LB waarin de reporterfaag zich bevindt. Meng het monster door te vortexen en breng vervolgens het cel-faagmengsel over naar een putje van een microtiterplaat.Incubeer de microtiterplaat bij 28 °C gedurende 60 minuten. Lees vervolgens de bioluminescentie van het monster af. De in deze video gedemonstreerde assay detecteert de aanwezigheid van Y pesti-cellen zoals beschreven in de inleiding.Wanneer y pestis aanwezig is, bindt de reporter-faag aan een specifieke receptor op de cel, injecteert deze zijn DNA en maakt gebruik van de transcriptionele en translationele machinerie van de gastheer om de luxe te transcriberen en transleren. Reportergenen. De signaalsterkte en de responstijd van het signaal zijn proportioneel aan het aantal aanwezige cellen bij hoge celconcentraties, 10^5 tot 10^8 CFU per milliliter.Een significante toename van de RLU ten opzichte van de controles zou binnen 20 minuten zichtbaar moeten zijn bij lagere celconcentraties, 10² tot 10⁴ CFU per milliliter. Een significante toename in RLU zou binnen 40 tot 60 minuten zichtbaar moeten zijn. Een representatief tijdverloop-experiment van fage-gemedieerde reporterdetectie van Y. pestis wordt hier getoond op tijdstip nul.Reporterfagen en cellen werden gemengd en geïncubeerd bij 28 °C, waarbij de bioluminescentie in RLU in de tijd werd gemonitord. Een toename in RLU was zichtbaar binnen 12 minuten, wat significant was met een P-waarde van P < 0,05; de negatieve controles met enkel fagen of enkel cellen vertoonden gedurende de incubatie van 60 minuten baseliniveaus van bioluminescentie van ongeveer 20 RLU. Let op dat baseliniveaus specifiek zijn voor de gebruikte luminometer.Daarentegen is een toename in bioluminescentie duidelijk zichtbaar bij de reporter-fagen-cellen van de testmonsters 12 minuten na toevoeging van de fagen. De signaalsterkte zou over 50 minuten gestaag moeten toenemen, hoewel hier niet getoond, zullen incubaties voor perioden langer dan 80 minuten leiden tot een signaal dat afneemt ten opzichte van het pieksignaal als gevolg van faag-gemedieerde lysis van de gastheercellen. Vergelijkbare resultaten worden verkregen bij incubatietemperaturen van 37 °C, ondanks dat de optimale temperatuur voor de groei van Y. pestis 28 °C is.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de recombinante reporter voor detectie gebruikt moet worden. Zodra de identificatie van Yesenia Pestis onder de knie is, kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd met S Golden Colonies als initieel inoculum. Bij het uitvoeren van deze procedure en het gebruik van fagen in het laboratorium is het belangrijk om te onthouden dat het zeer eenvoudig is om uw bacteriële stokculturen met de faag te contamineren; neem daarom maatregelen om de kans op contaminatie te verkleinen.Gebruik wegwerpplastics zoals pipetteerpunten en vervang uw handschoenen regelmatig. Het vermogen van de reporter om een fluorescentierespons op te wekken is gecorreleerd aan de fitness van de cel. Daarom kan de reporter, na de identificatie van Yesenia pestis, worden gebruikt om de antibiotica-gevoeligheid van het isolaat te bepalen.Bijvoorbeeld: Yesenia pesta-cellen die zijn geïncubeerd met een inhiberende concentratie van het antibioticum zullen niet in staat zijn om een bioluminescent signaal te produceren, of hun vermogen hiertoe zal ernstig worden beperkt. In contrast hiermee zullen Yesenia pesta-cellen die antibioticaresistent zijn, niet worden beïnvloed door de aanwezigheid van het antibioticum en in staat zijn een bioluminescente respons op te wekken die analoog is aan die van ongeinhibeerde cellen. Hierdoor kan een profiel van de gevoeligheid van het pathogeen voor antibiotica snel worden bepaald.Ten behoeve van de illustratie hebben we een geattenueerde Yesenia pesta-stam gebruikt. In dit experiment is Yesenia pests een categorie, een bacteriële pathogeen. Bij het uitvoeren van deze techniek met monsters waarvan vermoed wordt dat ze Yesenia Pestis bevatten, moeten de passende biosecurity- en biohazard-voorzorgsmaatregelen worden nageleefd.

bioluminescent-reporter-phage-for-detection-category-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

Source: de Vries, C. R., et al., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a bioluminescent imaging technique to monitor bacterial infection progression in a live mouse model. Pathogenic bacteria engineered with the luxABCDE reporter system emit light at the infection site, allowing visualization of metabolically active bacteria. By imaging the mouse over time, researchers can non-invasively track infection...

Bioluminescence Imaging of Bacterial Infections in Mice

This video demonstrates the reporter enzyme fluorescence (REF) imaging for in vivo detection of Mycobacterium tuberculosis infection. The infected mice are intraperitoneally injected with a substrate for REF imaging. Upon being hydrolyzed by bacterial β-lactamase enzyme, the substrate emits fluorescence, the detection of which aids evaluation of infection.

Reporter Enzyme Fluorescence Imaging for In Vivo Tracking of Bacterial Infection

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

Het uitbreiden van de stichting en de toepasbaarheid van fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) door inventarisatie van de relevante beginselen en demonstreren van de verenigbaarheid ervan met een veelheid aan fluoroforen en antilichaam-gerichte voorwaarden.

Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)

Een gedetailleerd protocol voor een muismodel voor enterohemorrhagic E. coli (EHEC) kolonisatie met behulp van bacteriën bioluminescentie-label wordt gepresenteerd. Het opsporen van deze bioluminescente bacterie door een niet-invasieve in vivo imaging systeem in levende dieren kan verder ons huidige begrip van EHEC kolonisatie.

Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem

Lichte productie regelen bioluminescente bacterie via allerlei mechanismen, zoals quorum sensing. Deze nieuwe methode kan de behandeling in situ van bioluminescentie en de correlatie van licht emissie celdichtheid. Een kunstmatige bioluminescente Escherichia coli systeem maakt het mogelijk de karakterisatie van lux operons, Lux eiwitten en hun samenspel.

In Situ Meting en de correlatie van de celdichtheid en lichte emissie van bioluminescente bacterie

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Ontdek een bioluminescente reporterfaag voor de snelle detectie van Yersinia pestis. Deze methode maakt identificatie van deze categorie A pathogeen mogelijk binnen minuten in plaats van dagen.

'Bioluminescent' Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen

Meer video's verkennen