Name: Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Leer leukocyten te isoleren uit de hersenen van muizen met TMEV-infectie via gradientcentrifugatie. Deze methode maakt gedetailleerde immunofenotypering door flowcytometrie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidie ​​NS64571 van de NINDS (CLH), door een vroege loopbaanontwikkeling prijs van de Mayo Clinic (CLH), en door een gulle gift van Donald en Frances Herdrich (CLH). We willen de Mayo Clinic Flow Cytometry Core bedanken voor hulp.

1. Intracraniële virus injectie: De volgende techniek is aangepast en uitgebreid gebruikt door ons lab en collega's. In het kort, intracraniële injectie van de stam Daniel's van muizen encefalomyelitis Theiler's virus (TMEV) of sham-infectie (1, 10) wordt uitgevoerd op jonge muizen (bij voorkeur 5-6 weken oud) naar de hersenen infiltreert leukocyten (Bils) te lokken. Houdt u er rekening mee dat resultaten zullen verschillen tussen de stam van de Daniel, de Bean stam, en de GDVII stam. Voor de toepassing van de oogst Bils, muizen krijgen 2x10 5 PFU van TMEV en geïnfecteerd zijn voor 24 uur. <ol><li> Bevestig de injectienaald (27 gauge, ¼ in, Kendall), om een ​​automatische 1 ml Hamilton spuit en ingesteld op 10 ul van het virus te leveren. </li><li> Het opstellen van TMEV in 10 pi DMEM in de spuit met zorgvuldige aandacht voor luchtbellen. Indien nodig, sham geïnfecteerde muizen ontvangen 10 ul van virus-vrij DMEM. </li><li> Net voor injectie, giet ongeveer 1 mL van isofluraan in een stolp die een draadrooster met katoenen ondergrond eronder bevat. </li><li> Plaats muizen direclty op draadrooster in de glazen stolp tot ze licht verdoofd, ongevoelig voor teen-knijpen en geïmmobiliseerd door de inhalatie-anesthesie, ongeveer 10-15 seconden. Muizen mag niet in direct contact komen met isofluraan, zoals stof kan irriterend zijn en bijtende. </li><li> Terwijl onder narcose, voor te bereiden muizen voor injectie door snel te zoeken naar de juiste coördinaten in de frontale cortex regio op de schedel met scheren en inkten. De algemene locatie voor injectie is 1 mm anterior tot bregma en 1 mm lateraal van de pijlnaad aan de rechterkant (figuur 1). Terwijl de stereotactische injectie kan geschikt zijn voor sommige experimentele situaties, hebben we ontdekt dat de vrije hand injectie zonder scheren of inkt is geschikt voor het merendeel van de experimenten. Afscheid van de vacht met de naald punt langs beide assen geschikt is voor injectie. </li><li> Om een ​​injectie te maken, richt u de naald loodrecht op de schedel en druk op door het bot tot ongeveer een 3 mm diepte. </li><li> Express virus in de hersenen door te drukken op de Hamilton spuit knop ingedrukt en wacht 2 seconden voor het virus naar de hersenen in te voeren voordat trekken. </li><li> Verwijder voorzichtig de naald en leg de muis in een schone, droge kooi. Muizen ontwaken uit narcose en snel weer de normale functie binnen enkele minuten. Geef de juiste aandacht voor muizen die abnormale symptomen vertonen, zoals overmatig bloeden uit de injectieplaats, zoals euthanasie van het dier kan worden geschikt. De juiste dieren omgaan 6 en naleving van de National Institutes of Health en institutionele Dierverzorging en gebruik Comite richtlijnen moeten worden gevolgd. </li></ol> 2. Brain-infiltrerende leukocyten celpreparaat: <ol><li> Bereid ronde bodem Oak Ridge centrifugebuizen met een capaciteit van 30 ml kan bevatten met 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll en 1 ml 10X PBS en buizen moeten bij RT zitten op de bank tijdens de hersenen verwijderen proces. </li><li> Breng Ficoll-Paque Plus op kamertemperatuur (RT). </li><li> Euthanaseren van dieren door de gewijzigde isofluraan overdosis 5 en snel te verwijderen van de hersenen met behulp van een roestvrij stalen weefsel spatel en plaats in een 15 ml conische buis met 5 ml RPMI op ijs. Onder bepaalde omstandigheden kan PBS-perfusie geschikt zijn om te verwijderen circulerende perifere bloedcellen van de Bils voorbereiding. Muizen moeten volledig en correct verdoofd voorafgaand aan de PBS-perfusie. </li><li> Overdracht hersenen en RPMI oplossing voor een 7 ml glazen Pyrex merk Tenbroeck weefsel molen en voorzichtig homogeniseren met 10-15 slagen. </li><li> Pipet een extra 5 ml RPMI in de homogenisator en pipet op en neer tweemaal. Transfer hersenhomogenaat (ca. 10 ml) aan eerder bereid ronde bodem buis en voorzichtig omkeren 2-3 keer om te mengen. </li><li> Spin hersenhomogenaat op 7800g ave gedurende 30 min bij RT in een F0360 met vaste hoek rotor in een Beekman Allegra X-22R klinische centrifuge. </li><li> Na het centrifugeren, verwijder myeline puin dat heeft gedreven naar de top van het verloop. Verzamel de leukocyten laag die zweeft boven de rode bloedcellen pellet (figuur 2). </li><li> Zeef leukocyten laag door een 40 um cel zeef in een 50 ml conische. Breng de oplossing tot 50 ml volume met RMPI. </li><li> Spin tubes met verdunde celsuspensie in een klinische centrifuge bij 1500 rpm (600g ave) gedurende 5 min bij RT. </li><li> Zuig het supernatant en het verzamelen van de cel pellet. Resuspendeer de pellet in 1 ml FACS buffer (1% bovine serum albumine, 0,02% natriumazide aan calcium en magnesium-vrij PBS) en breng de celsuspensie tot 5 ml met ronde bodem FACS buizen. </li><li> Zorgvuldig onderlaag ophanging met 1 ml Ficoll-Paque Plus. </li><li> Spin buis bij 2500 toeren per minuut (1400 gaf) in de klinische centrifuge gedurende 25 min bij RT zonder rem. </li><li> Verwijder de witte, pluizige laag op de interface (figuur 2) met 1 ml pipet en transfer naar het nieuwe 5 ml FACS buis. Was cel met 4 ml FACS buffer. </li><li> Spin buis bij 1500 tpm (600 g ave) gedurende 5 min bij RT in de klinische centrifuge tot pellet cellen. </li><li> Aspireren supernatant en het verzamelen van celpellet. Resuspendeer de leukocyten pellet in de juiste buffer en te houden op het ijs in nieuwe FACS buis. </li><li> Tellen cellen, te beoordelen levensvatbaarheid van de cellen door trypan blauw uitsluiting en analyseren flowcytometrie. In het algemeen kunnen de onderzoekers verwachten dat ongeveer 5 x 10 5 cellen / dier te verwerven. </li></ol> 3. Flowcytometrische immunofenotypering <ol><li> Na het isoleren en tellen van de leukocyten, draai de cellen gedurende 3 minuten bij 1500 rpm (600 gaf) in een klinische centrifuge. </li><li> Resuspendeer de pellet in het blokkeren van buffer met het volgende: FACS buffer, supernatans van 2.4G2 hybridoma (Fc blokkeren; anti-CD16/32) en foetaal runderserum in een verhouding van 10:05:01 en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C . </li><li> Voor te bereiden en voeg geconjugeerde antilichamen tegen het extracellulaire antigenen om de geblokkeerde cellen in een concentratie van 1:200 en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker. Vlek en incubeer cellen in 200 pl in een 96-wells V-bodemplaat. Passende controles zijn ongekleurd cellen en fluorochroom schadevergoeding monsters, als dat nodig is. </li><li> Spin de gekleurde cellen bij RT gedurende 3 minuten bij 1500 rpm (600 gaf) in een klinische centrifuge met behulp van een rotor geschikt voor 96-wells platen. </li><li> Zuig het supernatant en was de cellen met 200 ul FACS buffer door zachtjes en neer te pipetteren 3 keer. </li><li> Twee keer herhaalt u de bovenstaande was-techniek. </li><li> Na het wassen, resuspendeer de cellen in 2% paraformaldehyde en transfer naar FACS buizen. Fixatie is nodig voor flowcytometrische analyse van cellen geïnfecteerd Bioveiligheid Level 2 reagentia. </li><li> Voer de vaste cellen op een BD FACS Calibur na een aangepaste flow cytometrie methode 8 en analyseren van bestanden offline met behulp van FlowJo, WinMDI of andere beschikbare flowcytometrie-analyse software. </li><li> De analyse van 50-100,000 gebeurtenissen per monster is over het algemeen nodig voor een adequate immunofenotypering. </li></ol> Direct geconjugeerde antilichamen gebruikt in dit experiment: CD45 werd gedetecteerd met kloon 30-F11. Ly6C / G werd gedetecteerd met kloon Gr1, RB6-8C5. CD11b werd gedetecteerd met kloon M1/70. F4/80 werd gedetecteerd met kloon BM8. 4. Representatieve resultaten: We tonen cel fenotyperen resultaten voor muis Bils 24 uur na infectie (figuur 3). Leukocyten werden gekleurd met PerCP-geconjugeerd anti-muis-CD45 om het immuunsysteem cellen te detecteren, PE-geconjugeerd anti-muis Ly6C / G om inflammatoire monocyten, APC-geconjugeerd anti-muis-CD11b en APC-geconjugeerd anti-muis F4/80 te detecteren om cellen te detecteren van monocyten afstamming. De analyse werd uitgevoerd met een BD FACS Calibur instrument. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Anatomische lokalisatie van de plaats van injectie. De plaats van de injectie ligt 1 mm anterior tot bregma en 1 mm lateraal van de pijlnaad aan de rechterkant. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Illustratie van de gradiënt scheiding van leukocyten en Bils. Leukocyten worden in eerste instantie, die rechtstreeks onder de myeline laag puin en boven de RBC pellet in de Percoll verloop. De witte, pluizige laag (Bils) op de interface is verzameld uit de Ficoll verloop. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Immunofenotype van de hersenen-infilatrating leukocyten op 24 uur na infectie. Mouse leukocyten werden geïsoleerd uit de hersenen door differentiële centrifugatie dichtheid van weefsel homogenaten bereid uit dieren in 24 uur na intracraniële infectie. Cellen werden gekleurd met fluorescent-geconjugeerde antilichamen tegen muis CD45, Ly6C / G, CD11b, en F4/80. Eerste gating werd uitgevoerd door het plotten van CD45, een marker voor immuuncellen, tegen voorwaartse verstrooiing (FSC), een indicator van de celgrootte (C). De CD45 hi (A, D), CD45 lo (B, E), en CD45 neg (F, G) populaties werden vervolgens geanalyseerd voor relatieve expressie niveaus van de monocyten en macrofagen markers Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), en CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + F4/80 CD11b + inflammatoire monocyten werden bijna uitsluitend in de CD45 hi bevolking (A, D), in overeenstemming met de infiltratie van deze cellen uit de periferie. Daarentegen werden Ly6C/G-F4/80 lo CD11b + macrofagen bijna uitsluitend te vinden in de CD45 lo (B, E) en CD45 neg (G) populaties, in overeenstemming met een inwoner fenotype. In tal van experimenten, hebben we nooit gezien CD45 hi cellen of Ly6C / G + + F4/80 CD11b + inflammatoire monocyten in de hersenen van niet-geïnfecteerde of sham-infectiesTed muizen (gegevens niet getoond).

<ol><li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picornaviruses+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li>
<li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li>
<li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropath.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li>
<li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li>
<li>Donovan, J., &amp, P. B. rown, , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+%26+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Handling & restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenteral+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li>
<li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li>
<li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
</ol>

We routinematig gebruik van flowcytometrie om zowel de kwaliteit van de hersenen infiltreren celpreparaat te bepalen, en om verschillende populaties van immuuncellen 2, 9 onderscheiden. Bij acute time-punten, onze Bils methode levert hoge percentages van inflammatoire monocyten binnen de CD45hi bevolking, evenals hoge percentages van macrofagen in de CD45lo bevolking. Dit geeft aan dat een reproduceerbare immuunrespons in de hersenen robuust kan worden gekenmerkt door onze methode. <p class="jove_content"...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> Howe Lab </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Daniel&#39;s stam </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isofluraan </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> ronde bodem Oak Ridge centrifugebuizen </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Roche </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan Blue 0,4% (w / v) </td><td> Mediatech </td><td> 25 tot 900-CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml conische buizen </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 ml glazen Pyrex merk Tenbroeck weefsel molen </td><td> Visser </td><td> 08 tot 414-10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 urn zeef cel </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml conische </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> bovine serum albumine </td><td> Sigma </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> natriumazide </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS buizen </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> foetaal runderserum </td><td> Sigma </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 hybridoma </td><td> ATCC </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar V-bodemplaat </td><td> Corning </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra X-22R centrifuge of een gelijkwaardig </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96-well plaat bak en rotor </td><td> Beckman </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> Vaste-hoek rotor </td><td> Beckman </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7.5 </td><td> Tree Star, Inc </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> kloon: 30-F11 </td></tr><tr><td> GR1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> kloon: RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> kloon: M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> kloon: BM8 </td></tr></tbody></table>

isolatie van brain-infiltrerende leukocyten

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We beschrijven een methode voor het bereiden van de hersenen infiltreren leukocyten (Bils) van muizen. Laten we zien hoe aan muizen infecteren met murine encephalomyelitis Theiler&#39;s virus (TMEV) via een snelle intracraniële injectie techniek en hoe je een leukocyten-verrijkte populatie van infiltrerende cellen uit hele brein te zuiveren. Kortom, muizen zijn verdoofd met isofluraan in een gesloten kamer en zijn de vrije hand ingespoten met een Hamilton spuit in de frontale cortex. Muizen worden dan gedood op verschillende tijdstippen na infectie door isofluraan een overdosis en de hele hersenen worden geëxtraheerd en gehomogeniseerd in RPMI met een tissue Tenbroeck slijpmachine. Hersenhomogenaten worden gecentrifugeerd door middel van een continu 30% Percoll helling aan de myeline en de andere cel vuil te verwijderen. De celsuspensie wordt vervolgens gespannen op 40 um, gewassen en gecentrifugeerd op een discontinue Ficoll-Paque Plus gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten. De leukocyten worden vervolgens gewassen en geresuspendeerd in de juiste buffers voor immunofenotypering door flowcytometrie. Flowcytometrie onthult een populatie van aangeboren immuuncellen in de vroege stadia van de infectie in C57BL / 6 muizen. Na 24 uur na infectie, meerdere subsets van immuuncellen aanwezig zijn in de Bils, met een verrijkte bevolking van Gr1 +, CD11b + en F4/80 + cellen. Daarom is deze methode is handig in het karakteriseren van de immuunrespons tegen acute infectie in de hersenen.

Een snelle methode om te infiltreren leukocyten te verkrijgen van de muis hersenen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van een continue en discontinue gradiënt Percoll Ficoll gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten-verrijkte laag. Geïsoleerde leukocyten kan dan worden gekenmerkt door flowcytometrische metingen.

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

Wij beschrijven een methode voor het prepareren van herseninfiltrerende leukocyten (BILs) van muizen. Wij demonstreren hoe muizen geïnfecteerd kunnen worden met het Theiler-muizen...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van een leukocytenverrijkte populatie van aangeboren immuuncellen uit de hersenen van muizen die acuut zijn geïnfecteerd met het thyer mirroring encephalomyelitis virus of TMEV. Dit wordt bereikt door muizen eerst intracraniaal te infecteren met TMEV. Vervolgens worden de hersenen 24 uur na de infectie geoogst en voorzichtig gehomogeniseerd.De derde stap van de procedure is om vervolgens een continu perca- en discontinu fol-gradiënt te gebruiken om de leukocytverrijkte cellaag selectief te zuiveren. Uiteindelijk kan het fenotype van de in het brein infiltrerende leukocytenpopulatie, die betrokken is bij de immuunrespons op de acute infectie van het brein, worden gekarakteriseerd via flowcytometrische analyse. Hallo, mijn naam is Dr. Charles Howe.De methode die we vandaag zullen demonstreren, kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de neuro-immunologie. Bijvoorbeeld: welke immuuncellen infiltreren de hersenen tijdens een acute infectie? De methode zal vandaag worden gedemonstreerd door Reagan, la France.Corey, een senior onderzoekstechnoloog in mijn laboratorium, om herseninfiltrerende leukocyten op te wekken. Bevestig een naald van 27 gauge aan een automatische Hamilton-spuit van één milliliter en stel de spuit in op 10 µL. Trek 10 µL DMEM, geïnfecteerd met 2 × 10⁵ PFU van de Daniel-stam van TMEV, of 10 µL schijn-geïnfecteerd DMEM in de spuit, waarbij nauwkeurig op luchtbellen wordt gelet.Anestheseer een muis van vijf tot zes weken oud en bevestig de sedatie door middel van een knijptest in de teen terwijl de muis onder anesthesie is. Bereid de muis voor op de injectie door snel de juiste coördinaten in de frontale cortexregio op het schedeldel te bepalen, de vacht van de muis te verschuiven met de naaldpunt langs beide AE's zoals passend voor de injectie, om de injectie zo te richten dat de naald loodrecht op de schedel staat, en druk de naald door de botbedekking tot een diepte van ongeveer 3 mm. Om het viraal geïnfecteerde DMEM of sham-geïnfecteerde DMEM in de hersenen te injecteren, drukt u op de knop van de Hamilton-spuit en wacht u twee seconden zodat het medium de hersenen kan binnendringen voordat u de naald terugtrekt.Verwijder voorzichtig de naald en plaats de muis in een schone, droge kooi. De muizen zullen snel ontwaken uit de anesthesie en binnen één minuut hun normale functies hervatten, 24 uur na de intracraniale virale infectie of sham-infectie. Vul, voorafgaand aan de isolatie van de in het brein infiltrerende leukocyten, een ronde Oakridge-centrifugebuis met 10 milliliters RPMI 1640, 9 milliliters per cell en één milliliter 10X PBS, en bewaar de buis bij kamertemperatuur.Breng de FI call pack plus naar kamertemperatuur en vul een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter RPMI; plaats deze op dit moment ook op ijs. Nadat het dier is geofferd door een gemodificeerde isofluoraan-overdosering, verwijdert u snel de hersenen en plaatst u deze in de conische buis van 15 milliliter die de vijf milliliter RPMI bevat. Draag de hersenen en de RPMI-oplossing vervolgens over naar een glazen Pyrex-merk weefselmaler van 7 milliliter met 10 tanden en homogeniseer de hersenen voorzichtig met 10 tot 15 slagen.Pipette vervolgens nog eens vijf milliliter RPMI in de homogenisator en pipette de oplossing twee keer op en neer. Breng de ongeveer 10 milliliter hersenhomogenaat over naar de eerder voorbereide centrifugebuis met ronde bodem en ribbels en keer de buis voorzichtig twee tot drie keer om om te mengen. Centrifugeer het hersenhomogenaat nu 30 minuten bij 7.800 Gs bij kamertemperatuur in een centrifuge met een vaste hoekrotor.Verwijder na centrifugatie het myeline-debris dat naar de bovenkant van de gradiënt is gedreven. De leukocytenlaag drijft boven het pellet van rode bloedcellen. Filtreer de leukocytenlaag door een celzeef van 40 micrometer in een conische buis van 50 milliliter.Vul de oplossing aan tot een volume van 50 milliliter. Centrifugeer de buis met de verdunde cel-suspensie in een klinische centrifuge bij 600 Gs gedurende vijf minuten. Aspireer bij kamertemperatuur het supernatant en verzamel de celpellet.Resuspendeer het pellet in één milliliter FACS-buffer en voeg de celсусpensie toe aan een FACS-buis met een ronde bodem van vijf milliliter. Leg voorzichtig één milliliter kamertemperatuur Ficoll-Pak Plus onder de suspensies. Centrifugeer de FACS-buizen gedurende 25 minuten bij 800 ×g in de klinische centrifuge.Verwijder bij kamertemperatuur, zonder onderbreking, de witte pluizige laag op de interface met een pipette van 1 mL en breng de laag over naar een nieuwe FACS-buis van 5 mL. Was de cellen met 4 mL FACS-buffer. Centrifugeer de buis vervolgens opnieuw in de klinische centrifuge om de cellen te pelletten.Aspire vervolgens het supernatant en verzamel de celpellet. Resuspendeer de leukocytpellet in blokkeringsbuffer en bewaar deze op ijs. Tel daarna de cellen.Nadat de herseninfiltrerende leukocyten zijn geïsoleerd en geteld, worden de cellen in een V-bodemplaat geplaatst ter voorbereiding op flowcytometrische immunofenotypering. Centrifugeer de cellen vervolgens in een klinische centrifuge.Resuspendeer de pellet in 200 µL blokkeringsbuffer en incubeer de cellen 30 minuten op ijs. Voeg vervolgens antilichamen toe in een concentratie van 1:200 en incubeer de cellen nogmaals 30 minuten op ijs, ditmaal in het donker. Centrifugeer daarna de gekleurde cellen in de klinische centrifuge en aspireer vervolgens het supernatant.Voeg 200 µL fax-buffer toe aan het pellet en pipetteer dit voorzichtig drie keer op en neer. Was de cellen vervolgens nog twee keer op dezelfde manier in de centrifuge. Resuspendeer de cellen na de laatste wasstap in een eindconcentratie van 2% paraformaldehyde en breng de gekleurde cellen over naar fax-buisjes. Dien de gefixeerde cellen tot slot in voor flowcytometrie en analyseer de bestanden offline met een fax-analyseprogramma.Muisleukocyten werden uit de hersenen geïsoleerd door middel van differentieel dichtheidscentrifugeren van weefselhomogenaat, bereid van dieren 24 uur na intracraniële infectie. Zoals te zien is in deze twee dot plots, werden LY6CG-positieve, F4/80-positieve, CD11b-positieve inflammatoire monocyten bijna uitsluitend aangetroffen in de CD45-hoge populatie, wat consistent is met de infiltratie van deze cellen vanuit de periferie. In contrast hiermee werden LY6CG-negatieve, F4/80-lage, CD11b-positieve macrofagen bijna uitsluitend aangetroffen in de CD45-lage populaties (linker twee panelen) en de CD45-negatieve populaties (uiterst rechtse paneel), wat consistent is met een resident fenotype.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u leukocyten bereidt uit de hersenen van acuut geïnfecteerde dieren.

isolation-of-brain-infiltrating-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In deze video laten we zien hoe de mononucleaire cellen van het centrale zenuwstelsel van ratten met experimentele auto-immune encephalomyelitis isoleren.

Isolatie van mononucleaire cellen uit het centrale zenuwstelsel van ratten met EAE

Het huidige artikel beschrijft een snelle protocol om efficiënt te isoleren mononucleaire cellen van hersenen en het ruggenmerg weefsels die effectief kan worden gebruikt voor flowcytometrische analyses.

Isolatie van hersenen en ruggenmerg mononucleaire cellen met behulp van Percoll Verlopen

In this video, we perform the isolation of mononuclear cells from a mouse’s brain using density gradient centrifugation. The isolated mononuclear cell suspension can be used for further downstream analysis.

Mononuclear Cell Isolation from Mouse Brain: A Density Gradient Centrifugation Technique to Isolate Brain Resident Mononuclear Cells

The video demonstrates the isolation of tumor-infiltrating peripheral blood mononuclear cells from a mouse brain using mechanical dissociation and enzymatic digestion. This is followed by density gradient centrifugation to collect the immune cells for further analysis.

Isolating Tumor-Infiltrating Immune Cells from a Murine Brain

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen...

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen

Brain myeloïde cellen karakterisatie volgende slag kan worden uitgevoerd door stereology de optische fractioneerinrichting methode of een flowcytometrische analyse van hersenen leukocyten suspensies. Beide zijn nuttige technieken om een ​​nauwkeurige fenotypische onderscheiding van de belangrijkste myeloïde cel subsets in de ischemische hersenen voeren.

Stereological en flowcytometrie Karakterisering van leukocytsubpopulaties in Modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie

Ontsteking speelt een centrale rol in de pathogenese van ischemische beroerte. Toenemend bewijs suggereert dat het als een tweesnijdend zwaard werkt, wat vroege hersenschade verergert, maar ook bijdraagt aan later herstel. Dit protocol beschrijft de isolatie van immuuncellen uit de ischemische hersenen en hun daaropvolgende flowcytometrische fenotypering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Dit artikel presenteert twee geoptimaliseerde protocollen voor het onderzoeken van residente en perifeer afgeleide immuuncellen in het centrale zenuwstelsel, waaronder de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen. Elk van deze protocollen helpt bij het vaststellen van de functie en samenstelling van de cellen die deze compartimenten bezetten onder steady state en ontstekingsomstandigheden.

Isoleren van weefsels van het centrale zenuwstelsel en bijbehorende hersenvliezen voor de downstream-analyse van immuuncellen

Deze studie maakt gebruik van flowcytometrie en twee verschillende gating-strategieën op geïsoleerde perfused muizen hersenen choroïde plexussen; dit protocol identificeert de belangrijkste immuuncelsubsets die deze hersenstructuur bevolken.

Isolatie en karakterisering van de immuuncellen van micro-ontleedde muischoroïde plexussen

Om de immuunrespons op hersenaandoeningen te onderzoeken, is een veelgebruikte benadering het analyseren van veranderingen in immuuncellen. Hier worden twee eenvoudige en effectieve protocollen gegeven voor het isoleren van immuuncellen uit muizen hersenweefsel en schedelbeenmerg.

Het isoleren van immuuncellen uit de hersenen en de schedel van muizen

Leer leukocyten te isoleren uit de hersenen van muizen met TMEV-infectie via gradientcentrifugatie. Deze methode maakt gedetailleerde immunofenotypering door flowcytometrie mogelijk.

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

Meer video's verkennen