Aseptische Laboratoriumtechniek: Volume Transfers met serologische Pipetten en Micropipettors

Deze demonstratie presenteert aseptische laboratoriumtechnieken voor volumetrische overdrachten met serologische pipetten en micropipetten op de laboratoriumbank. Werk binnen het steriele veld dat wordt gecreëerd door de vlam van een bunsenbrander. Selecteer het passende instrument voor volumetrische overdracht voor de specifieke toepassing.

Gebruik deze vervolgens op de juiste wijze zonder de steriliteit in gevaar te brengen, terwijl u de cultuurreagentia en materialen steriel houdt en vloeistoffen met precisie samen opzuigt. Deze procedures zijn essentieel om bronnen van contaminatie te minimaliseren en precisie te bieden voor basale experimenten. In het begin is het uitdagend om instrumenten nauwkeurig in te stellen en af te lezen, en om bewegingen met de instrumenten en laboratoriummaterialen te coördineren zonder de steriliteit van de overgebrachte vloeistoffen in gevaar te brengen.

Het toepassen van een aseptische techniek in het laboratorium is essentieel voor het experimentele succes bij het werken met levende specimens; neem daarom de tijd om deze procedures te leren, zodat ze in uw natuur komen. Tijdens het werken aan de bench zal dr. Chris Reddy, mijn laboratoriumcoördinator, de protocollen demonstreren. Was altijd grondig de handen met antiseptische zeep en warm water voordat u met laboratoriumprocedures begint. Maak eerst de handen nat onder warm stromend water.

Breng vervolgens zeep aan en verdeel deze grondig en krachtig. Wrijf de handen door wrijving te creëren op alle oppervlakken, inclusief de duimen, de ruggen van de vingers, de handruggen en onder de vingernagels. Spoel daarna grondig af om zeepresten te verwijderen en droog de handen met papieren handdoeken uit een dispenser.

Sluit ten slotte de kraan af met een schoon papieren handdoekje en maak het werkgebied op de laboratoriumbank leeg. Haal vervolgens een vochtig desinfecterend doekje uit de houder en neem het gehele oppervlak af. Laat het desinfectiemiddel verdampen met behulp van een ontstekingslamp.

De bunsenbrander. Stel de vlam zo in dat er een blauwe kegel in het midden ontstaat. Plaats alle voor de procedure benodigde materialen nabij het steriele veld van de laboratoriumbank.

Zorg er daarnaast voor dat alle materialen correct zijn gelabeld. Er zijn veel soorten serologische pipetten beschikbaar, van kunststof of glas, wegwerp of herbruikbaar, met of zonder stop. De verschillende maten zijn gekalibreerd met stoppen die fungeren als barrière om overvullen van de pipet te voorkomen.

Let op dat serologische pipetten ook op twee manieren zijn gekalibreerd. TD-pipetten, herkenbaar aan de dubbele ringen aan de bovenzijde, zijn zo gekalibreerd dat het volume in de tip niet wordt afgeleverd. Dit wordt hier niet getoond, maar TC-pipetten moeten worden uitgeblazen omdat ze zijn gekalibreerd om het volledige volume af te leveren. Gebruik bij de aseptische techniek met een individueel verpakte steriele plastic serologische pipet het afgesloten uiteinde om het papier voorzichtig af te pellen.

Verwijder niet de gehele huls. Bescherm alleen de punt van de pipethendel — enkel het bovenste gedeelte van de pipet boven de maatstrepen — en bevestig een pipethulp, zoals een pipetbol of een pipetpistool, aan het bovenste uiteinde van de serologische pipet. Houd de pipethulp in één hand en verwijder met de andere hand de papieren huls van de plastic pipet.

Maak voor glazen serologische pipetten die in metalen bussen zijn bewaard de bovenkant van de bus los en verwijder de dop; vlam de open uiteinden van zowel de dop als de bus. Plaats de dop vervolgens op zijn zijkant op de gedesinfecteerde werkbank. Houd de bus horizontaal en schud deze zodat de bovenkanten van één of twee pipetten zichtbaar worden.

Laat ongeveer een inch uitsteken. Leg de canister op zijn zijkant en verwijder één pipet zonder de andere pipetten aan te raken. Zorg dat de onderste punt van de pipet geen contact maakt met handen of niet-steriele oppervlakken.

Bevestig vervolgens de pipethulp. Verhit daarna het onderste derde deel van een glazen pipet gedurende één tot drie seconden in de vlam van de bunsenbrander door de blauwe kegel te passeren. Verwijder nu de dop van de fles met steriel medium.

Houd de fles tussen de ringvinger en de palm van één hand, terwijl u met de duim, wijsvinger en middelvinger van dezelfde hand de pipethulp bedient; houd met de andere hand de fles in een hoek van 45 graden en ga met de rand van de fles door de vlam van de bunsenbrander. Plaats de steriele pipetpunt in het medium. Aspireer vervolgens met de pipethulp om de flow aan de hand van de schaalverdeling te controleren.

Houd het volume dat in de pipet wordt opgezogen nauwkeurig in de gaten om het volume precies af te lezen. Houd de pipet verticaal en bekijk de meniscus van de vloeistof recht voor u op ooghoogte. Haal vervolgens opnieuw de rand van de fles door de vlam van de bunsenbrander.

Sluit het vervolgens af met een dop. Zet de fles met medium apart. Neem daarna een steriele buis en werk aseptisch.

Verwijder de dop zoals eerder beschreven. Creëer een steriel veld door de rand van de buis te vlammen. Dispenseer het medium vanuit de pipet in de buis, waarbij de monsterstroom wordt gecontroleerd om spatten te voorkomen.

Vlam de rand. Plaats vervolgens de dop opnieuw en zet de buis opzij. Verwijder nu de pipetteervulpomp, gooi plastic pipetten in een daarvoor bestemde container voor scherpe voorwerpen en dompel glazen pipetten onder in een 10% bleekoplossing.

Een micropipet maakt het nauwkeurig meten en dispenseren van minimale volumes mogelijk met instrumenten van verschillende formaten voor specifieke volumebereiken. Gebruik voorgesteriliseerde buisjes en plastic tips. Gebruik daarnaast een voorgevochtigde desinfecterende doek om de micropipetten af te nemen. Let op.

De Volter toont drie getallen die geïnterpreteerd moeten worden op basis van het type micropipet, waarbij de nauwkeurigheid wordt weerspiegeld in de kleinste schaalverdeling. Merk bijvoorbeeld op dat de P 20 wordt gebruikt voor volumes tussen 2,0 en 20,0 microliters. Het bovenste getal in het zwart staat voor tientallen microliters.

Het tweede zwarte getal geeft het volume in microliters aan. Het rode getal markeert tienden van een microliter, waardoor elk schaalstreepje gelijk staat aan een increment van 0,02 microliters. Draai eerst aan de instelknop om het volume van de dispenser in te stellen zoals aangegeven op de numerieke volumemeter.

Draai bij het verlagen van de volumestelling van de micropipet het duimwiel langzaam naar beneden tot aan de maatstreep. Draai bij het verhogen van de volumestelling het wiel naar boven tot u met een derde slag voorbij de gewenste maatstreep bent. Draai vervolgens het duimwiel langzaam naar beneden om het beoogde volume te bereiken.

Gebruik te allen tijde steriele plastic wegwerptips. Bevestig een tip stevig op het uiteinde van de cilinder van de micropipet. Druk naar beneden en draai lichtjes om een luchtdichte afsluiting te garanderen.

Houd de micropipet in een verticale positie. Let op dat de micropipet drie posities heeft: de ruststand, de eerste aanslag en de tweede aanslag.

Druk de knop van de zuiger vanuit de rustpositie in tot de eerste aanslag om een hoeveelheid lucht te verplaatsen die gelijk is aan het ingestelde volume. Dompel nu de tip in de vloeistof terwijl de knop tot de eerste aanslag wordt ingedrukt. Laat de knop langzaam los om de vloeistof in de tip op te zuigen.

Wanneer de drukknop de rustpositie bereikt, dient men voldoende tijd te laten om de vloeistof in de tip op te zuigen. Verwijder vervolgens de tip uit de vloeistof. Controleer visueel hoeveel vloeistof er in de tip is opgenomen en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Plaats de tip in een hoek van 10 tot 45 graden tegen de wand van de buis waarin de vloeistof wordt overgebracht. Druk vervolgens langzaam de knop van de zuiger in tot de eerste stop, om de vloeistof uit te stoten.

Druk na een moment de plunjer in tot de tweede stop om eventueel resterend vloeistof te verdrijven. Verwijder vervolgens de tip uit de vloeistof en laat de plunjer terugkeren naar de rustpositie. Gooi de tips ten slotte weg in de daarvoor bestemde container voor scherpe voorwerpen door op de uitwerpklnop van de micropipet te drukken.

Zet eerst de bunsenbrander uit. Ruim alle benodigdheden en reagentia op en maak de buitenkant van het LabWare schoon met een desinfecterend doekje voordat u deze naar de opslagplaats verplaatst. Plaats vervolgens besmet glaswerk en gevaarlijke afvalmaterialen in de juiste afvalbak.

Veeg vervolgens het gehele werkgebied nogmaals af en laat het desinfectiemiddel verdampen. Was tot slot de handen grondig met antiseptische zeep en warm water. Zonder aseptische techniek kunnen culturen besmet raken, wat vertraging in de experimenten kan veroorzaken.

Het aseptisch overbrengen van vloeistoffen met serologische pipetten is essentieel bij het vermeerderen van zuivere bacteriële culturen, zoals deze preparatie van 25 milliliter E. coli. Daarnaast maken serologische pipetten de aseptische overdracht van vloeistoffen naar steriele reageerbuizen mogelijk. Dit voorbeeld demonstreert een zuivere versus een gecontamineerde cultuur van E. coli bij de punt-naar-punt levering van medium in de buizen.

Soms zijn nauwkeurige volumes vereist. In dit geval is er duidelijk sprake van een onnauwkeurige overdracht van media. Dit voorbeeld toont een incorrect overgedragen volume buffer.

In plaats van 12,5 µL te dispenseren, dispenseerde de student 125 µL. Hoewel de getallen op de volumeregelaar identiek waren ingesteld, was de verkeerde micropipet voor de taak gekozen. Na het bekijken van deze video moet u over de nodige basiskennis beschikken om een aseptische techniek toe te passen bij routinematige laboratoriumprocedures, zoals het overbrengen van oplossingen en culturen met serologische pipetten en micropipetten zonder de steriliteit in gevaar te brengen.

Het doel is dat voorzorgsmaatregelen, zoals het vlammen van glaswerk, pipetpunten, kweekbuizen en kolven, evenals het werken binnen de grenzen van een steriel veld op de laboratoriumbank, bij elk experiment tot gewoonte worden. Daarnaast is het essentieel dat volumes nauwkeurig en precies worden gemeten en gedoseerd bij het uitvoeren van experimenten. Het leren correct gebruiken van deze instrumenten voor volumetransfer zal de betrouwbaarheid van de experimentele resultaten verbeteren.