Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om meerdere macrofaagculturen te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van ratlevercellen zonder dat hiervoor complexe apparatuur of vaardigheden nodig zijn. Dit wordt bereikt door eerst volwassen ratlevercellen te dissociëren via collagenaseperfusie, gevolgd door de isolatie van de parenchymale hepatocytfractie. Vervolgens worden de cellen geïncubeerd in T 75-weefselkweekflesjes met groeimedium om gemengde primaire culturen van levercellen te vestigen.

Na vervolgens 10 tot 12 dagen kweken worden de kweekflessen geschud om de overdracht van de macrofagen naar plastic schaaltjes te vergemakkelijken, waarna ze na een korte incubatieperiode door selectieve adhesie worden geoogst. Ten slotte kunnen er meer dan 10 van de zes cellen herhaaldelijk worden geoogst uit dezelfde T 75 weefselkweekflessen met intervallen van twee tot drie dagen gedurende meer dan twee weken. Isolatiemethoden voor levermacrofagen zijn uitvoerig beschreven.

De meeste eerdere methoden vereisen echter geavanceerde apparatuur, zoals een centrifuge-illustrator, en verfijnde technische vaardigheden. Hier presenteren wij een eenvoudige en nieuwe methode om levermacrofagen in voldoende aantal en zuiverheid te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van adult omhulde levercellen, waarvoor geen speciale apparatuur of geavanceerde laboratoriumvaardigheden nodig zijn. De dissectie van dieren, perfusie van de lever en preparatie van cyten zullen worden gedemonstreerd door doktoren Norco, Yamanaka en Miko yoshioka bij het National Institute of Animal Health.

Vervolgens zal Dr. Taketo Takeno van het National Institute of Agro Biological Sciences de isolatie en zuivering van levermacrofagen uit kweekrisico's demonstreren. Laten we beginnen. Ter voorbereiding op de perfusie van de rattenlever begint u met het voorverwarmen van één fles wasoplossing en één fles collagenase-oplossing.

Bevestig vervolgens de sedatie door middel van een huidknijptest, plaats een geanestheseerde volwassen mannelijke rat in een roestvrijstalen pan en spuit 70% ethanol op de buik en thorax. Maak daarna met een dissectieschaar een kleine incisie in het midden van de buik en pel de huid terug. Open vervolgens de buikholte met de schaar en bevestig de locatie van de vena portae.

Haal vervolgens de chirurgische hechtdraad onder de poortader door en trek deze los aan. Klem daarna het distale deel van de vena cava inferior en de vena mesenterica af met een mosquito-klem om bloedreflux naar de lever te voorkomen. Open de borstholte door het diafragma met een schaar door te knippen en leg het hart vrij; maak vervolgens een kleine incisie in de poortader met een oogheelkundige schaar, voer een plastic katheter van twee millimeter in de ader in en knoop de draad stevig rond de katheter vast.

Vul een perfusiesysteem met de voorverwarmde wasoplossing en sluit dit vervolgens aan op de katheter. Begin de perfusie in C twee met een snelheid van 10 milliliters per minuut. Maak tegelijkertijd een incisie in de wand van het rechteratrium met dissectiescharen.

Zet de perfusie voort gedurende 10 minuten en vervang vervolgens de perfusieoplossing door de collagenase-oplossing en perfuseer gedurende 10 tot 20 minuten. Vul een steriel bekerglas met 25 milliliters collagenase-oplossing met een snelheid van 10 milliliters per minuut. Verwijder daarna de geperfuseerde lever en plaats deze voorzichtig in het bekerglas.

Snijd de lever met een schaar in kleine stukjes. Voeg 75 milliliters koud MEM toe aan de resulterende celsuspensie. Filtreer de suspensie na voorzichtig pipetteren door een 100 micrometer cell strainer.

Om het bindweefsel in de onverteerde weefselfragmenten te verwijderen, wordt het filtraat opgevangen in conische buizen van 50 milliliter. Breng het filtraat over in conische buizen van 50 milliliter en was de cellen vier keer door de cellen eerst te centrifugeren bij 50 Gs gedurende één minuut bij vier graden Celsius. Gooi met de rem uitgeschakeld voorzichtig het supernatant weg en resuspendeer de pellet vervolgens in koud MEM; centrifugeer de cellen na de laatste wasbeurt opnieuw.

Resuspendeer de levercellen in groeimedium. Zaai de cellen vervolgens uit in vijf tot 10 T 75 weefselkweekflessen met een dichtheid van 6,7 x 10⁴ cellen per vierkante centimeter. Plaats de kweekflessen in een incubator en vervang het groeimedium elke twee tot drie dagen.

Na één dag cultuur verspreiden de parenchymale hepatocyten zich over het oppervlak van de kolf en vertonen ze een typische polygonale, op copaalsteen lijkende morfologie met één of twee ronde kernen. Binnen enkele dagen van cultuur verliezen de parenchymale hepatocyten hun epitheliale celmorfologie en transformeren ze in meer afgeplatte fibroblastische cellen. Rond dag zes beginnen, in fasecontrast, heldere ronde macrofaagachtige cellen te prolifereren op het fibroblastische cellaag. De groei van de macrofaagachtige cellen bereikt rond dag 12 een maximum.

Het aantal macrofaag-achtige cellen neemt af rond dag 19, wanneer de fibroblastische cellaandoening begint te degenereren. Daarom suspenderen we, na ongeveer zeven tot 10 dagen cultuur, de macrofagen die op de cellaandoening zijn geprolifereerd in het cultuurmedium door de cultuurkolfen 30 minuten lang wederzijds te schudden nadat de macrofagen zijn geresuspendeerd. Vul elke van de 100 millimeter plastic schalen (niet-tissue culture grade) met het medium uit twee T 75-kolven.

Vul de kweekflessen opnieuw met groeimedium en plaats ze terug in de incubator. Incubeer de plastic schalen gedurende 30 minuten na de incubatieperiode; was de schalen drie keer door het medium af te zuigen en de plastic schaal voorzichtig te spoelen met PBS, zoals hier te zien is. Al na 10 minuten na het uitplaten hechten macrofaag-achtige cellen zich aan het oppervlak van de schaal, terwijl andere contaminerende fibroblastische cellen in suspensie blijven. Na het spoelen met PBS wordt een zeer gezuiverde macrofaagpopulatie verkregen.

Zoals in deze figuur te zien is, verkrijgen de cellen na 40 minuten cultuur een typische macrofaagmorfologie en mitotische cellen worden frequent waargenomen, zoals aangegeven door de pijlen. Om deze nieuwe, sterk gezuiverde macrofaagpopulatie te oogsten, voegt u één milliliter trip LE Express-oplossing toe aan de gewassen cellen en plaatst u de schalen voor nog eens 10 minuten terug in de incubator. Na deze incubatieperiode voegt u negen milliliter groeimedium toe en schraapt u vervolgens de aangehechte macrofagen voorzichtig los met de celschraper, om ze daarna over te brengen naar een 15 milliliter conische centrifugebuis en het supernatant weg te gooien.

Voeg één milliliter van het groeimedium toe, dissocieer de resuspendeerde celklonten tot enkelvoudige cellen door krachtig te pipetteren, en tel het aantal cellen met een hemocytometer zoals getoond in deze grafiek; meer dan 10^6 cellen kunnen herhaaldelijk met intervallen van twee tot drie dagen gedurende meer dan twee weken worden geoogst uit een T 75-kweekfles, wat een totale celopbrengst van 10^7 per T 75-kweekfles mogelijk maakt. Zoals te zien is op deze afbeeldingen, zijn de geïsoleerde cellen immunogekleurd met monoklonale antilichamen tegen rat-macrofaagantigenen zoals CD 68 of ED 1 en CD 1 72 A or OX 41. Deze cellen bezitten functionele eigenschappen van macrofagen, zoals actieve fagocytose van FITC-gelabelde microbeads.

In deze video hebben we een eenvoudige en efficiënte methode gepresenteerd om macrofagen te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van levercellen van volwassen rode vissen. Onze procedure vereist geen complexe apparatuur of vaardigheden, maar levert voldoende aantallen pure macrofagen op die herhaaldelijk kunnen worden geoogst uit dezelfde kweek. Deze methode kan worden toegepast op andere zoogdierensoorten.

Bedankt voor het bekijken van de video en veel succes met uw toekomstige experimenten. Groeten.