Name: Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer een eenvoudige methode om macrofagen te isoleren uit primaire levercelculturen van ratten zonder geavanceerde apparatuur. Deze techniek levert zuivere cellen op voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door een onderzoekssubsidie ​​en een Grant-in-Aid van het Voedsel-Nanotechnologie Project van het ministerie van Landbouw, Bosbouw en Visserij van Japan.

1. Perfusie van de lever <ol><li> Verdoven een volwassen mannelijke Sprague-Dawley rat (bij 10 tot 15 weken oud; lichaamsgewicht 150-200 g) door een intraperitoneale injectie van een natriumpentobarbital oplossing (50 mg natrium-pentobarbital / kg lichaamsgewicht). </li><li> Plaats het dier in een roestvrijstalen pan en spuit 70% ethanol op zijn buik en thorax. </li><li> Maak een klein sneetje en afschilferen van de huid. Open de buik van de snede met een schaar. </li><li> Bevestig de locatie van de poortader, langs een chirurgische draad onder de poortader en losjes klomp. </li><li> Clump het distale deel van de vena cava inferior en mesenteriale ader om bloed reflux te voorkomen in de lever. Open de borstholte door het snijden van het diafragma met een schaar, en bloot het hart. </li><li> Plaats een plastic katheter (2 mm diameter) in de poortader en draai de draad stevig rond de katheter. </li><li> Sluit de katheter om een perfusie systeem dat is geladen met wasoplossing (Ca 2 +-Mg 2 + gratis HBSS met 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES en 4,2 mM NaHCO 3, pH 7,2) voorverwarmd bij 37 ° C. </li><li> Begin perfusie in situ met een snelheid van 10 ml / min. Op hetzelfde moment, maak een snede in de rechterboezem muur. Blijven perfusie gedurende 10 minuten. </li><li> Schakel de perfusie oplossing voor collagenase oplossing [HBSS met 10 mM HEPES en 4.2mm NaHCO 3, aangevuld met Type I collagenase (0,05%) en trypsine-remmer (50 ug / ml); pH 7,5], en perfuseren voor 10 - 20 minuten bij een snelheid van 10 ml / min, totdat de lever zwelt een beetje en toont het teken voor de desintegratie van de lever structuur onder sereuze membraan. </li></ol> 2. Voorbereiding van parenchymale Hepatocyte-rijke Cell Fraction <ol><li> Verwijder voorzichtig de lever over in een steriele beker met 25 ml collagenase oplossing. Mince in kleine stukjes door de schaar. </li><li> Voeg 75 ml koud MEM in de resulterende celsuspensie. Na de zachte pipetteren, filtraat door middel van een cel zeef (100 micrometer) om bindweefsel en onverteerd weefsel fragmenten te verwijderen. </li><li> Breng het filtraat in 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 50 xg gedurende 1 min bij 4 ° C (rem uit). </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatans. Resuspendeer de pellet met koud MEM. </li><li> Herhalen 2.4) drie keer. </li></ol> 3. Gemengde Primaire Cultuur van de levercellen <ol><li> Hang de cellen verkregen in 2.5) in het groeimedium bestaat uit DMEM met 10% hitte-geïnactiveerd FCS, aangevuld met 100 uM β-mercapto-ethanol, 10 ug / ml insuline, 100 ug / ml streptomycine en 100 U / ml penicilline, en het zaad in vijf voor tien weefselkweek kolven (oppervlakte: 75 cm 2) bij een dichtheid van 6,7 x 10 4 cellen / cm 2 (5 x 10 6 cellen / fles / 12 -15 ml medium). </li><li> Incubeer de cultuur flasksat 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2 - 95% lucht. </li><li> Vervang het groeimedium om de 2 tot 3 dagen intervallen. </li></ol> 4. Selectieve Isolatie van macrofagen <ol><li> Na 12 dagen van cultuur, macrofagen verspreiden op de cel vel. Deze cellen worden geschorst door wederkerige schudden van de cultuur kolven bij 80 tot 120 slagen per minuut gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Overdracht het kweekmedium in 100 mm niet-weefselkweek bestemde plastic schaaltjes. Het zwembad van het medium uit twee T75 flessen in een plastic schaaltje. Refill cultuur kolven met het medium en stuur ze terug naar de incubator. </li><li> Incubeer plastic schaaltjes gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2 - 95% lucht. Macrofagen gemakkelijk hechten aan niet-weefselkweek bestemde plastic schaaltjes onder deze inleggen, terwijl andere contaminerende cellen niet. </li><li> Zuig het medium en zacht spoel de plastic schotel met PBS. Herhaal deze stap drie keer. </li><li> Voeg 1 ml van TrypLE Express-oplossing in de schaal, en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2 - 95% lucht. </li><li> Voeg 9 ml van het groeimedium. Voorzichtig schrapen de bijgevoegde macrofagen door een cel schraper. </li><li> Breng de celsuspensie in een 15 ml conische buis en centrifugeer op 180 xg gedurende 5 minuten bij 25 ° C (rem op). </li><li> Verwijder het supernatant en voeg 1 ml van het groeimedium. Dissociëren in enkele cellen door krachtig pipetteren. Inventariseer het aantal cellen met een hemocytometer tellen. </li><li> Isolatie stappen kunnen worden herhaald met dezelfde cultuur kolven twee tot drie dagen intervallen van meer dan twee weken. </li><li> Geïsoleerde macrofagen kunnen worden gekweekt in het groeimedium wordt beschreven in 3.1. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van een gemengde primaire cultuur van volwassen ratten levercellen is weergegeven in figuur 2. Parenchymale hepatocyten verliest de epitheliale cel morfologie binnen een paar dagen in cultuur en gedegenereerde of transformeren tot fibroblast-achtige cellen.Dan, rond dag 6 tot 12 fase-contrast-heldere, ronde macrofaag-achtige cellen vigourouly prolifereren op de fibroblastische cel blad. Door schudden van de cultuur flacons, zijn macrofagen gemakkelijk opgehangen in het kweekmedium, en de daaropvolgende overdracht en incubatie in plastic borden leiden tot een selectieve hechting van macrofagen (figuur 3). De macrofaag-achtige cellen kunnen worden geoogst vanaf dag 8, en de nummers maximale niveaus bereikt over dag 12 tot 14. Meer dan 10 6 cellen kunnen worden geoogst uit een T75 cultuur fles herhaaldelijk op 2 tot 3 dagen voor de intervallen van meer dan twee weken, waarvan een totale cel opbrengst per fles van 10 7 per T75 cultuur kolf (figuur 3). De zuiverheden van de geïsoleerde macrofagen waren 95 tot 99%, zoals geëvalueerd door flowcytometrie of immunocytochemie met ratten macrofaag-specifieke antilichamen, zoals ED-1 (figuur 4), ED-3, OX-41 (figuur 4) en Iba1 9. de geïsoleerde cellen vertonen typische kenmerken van macrofagen, zoals actieve fagocytose van polystylene kralen (figuur 5), proliferatieve respons op recombinant GM-CSF, secretie van inflammatoire / anti-inflammatoire cytokines na stimulatie met LPS, en de vorming van meerkernige reuscellen 9. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een regeling voor selectieve isolatie en zuivering van macrofaag-achtige cellen uit gemengde primaire cultuur van de levercellen. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Primaire cultuur van levercellen en de proliferatie van macrofaag-achtige cellen. Pijl geeft een multinucleaire gigantische cel. Schaalbalk = 100 micrometer. Overgenomen uit het Journal of immunologische methoden, Vol.360, 47-55 (2010) 9 met toestemming van Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Selectieve isolatie van macrofaag-achtige cellen door het schudden en gehechtheid methode. Cellen werden gesuspendeerd in het kweekmedium door schudden van de kolven, en vervolgens overgebracht in niet-weefselkweek bestemde plastic schaaltjes, en geïncubeerd bij 37 ° C. Zo vroeg als 10 min na plating, macrofaag-achtige cellen aan de schotel oppervlak, terwijl de andere contaminerende fibroblastische cellen bleven opgeschort. Na het spoelen met PBS, was een sterk gezuiverd macrofaag bevolking verkregen. Deze cellen opgedaan typische macrofaag morfologie na 40 min van de cultuur, en de mitotische cellen werden vaak waargenomen (pijlen). Latere wijzigingen in de cel aantallen hersteld van kolven op andere cultuur periodes worden weergegeven. Waarden zijn een gemiddelde ± SD drie tot vijf flessen. Experimenten werden drie keer herhaald en de gegevens worden aangegeven met verschillende symbolen. Schaalbalk = 100 micrometer. Overgenomen uit het Journal of immunologische methoden, Vol.360, 47-55 (2010) 9 met toestemming van Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Immunocytochemische kleuring van macrofaag-achtige cellen met monoklonale antilichamen tegen rat macrofagen. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Fagocytose van FITC-gelabelde microbolletjes van macrofaag-achtige cellen.

<ol><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+as+a+lymphoid+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li>
<li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li>
<li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver%3A+An+organ+with+predominant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li>
<li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li>
<li>Olynyk, J. K., Clarke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat Kupffer cells.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).</li>
<li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li>
<li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li>
<li>Gorrell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%3A+the+hepatocyte+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li>
</ol>

Alle dieren werden gehouden en geëxploiteerd in het dier faciliteit in de National Institute of Animal Health, volgens de richtlijnen en verordeningen weer door het Comite van de instelling voor dierproeven.

Hier melden wij een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen te verkrijgen van de gemengde primaire culturen van volwassen ratten levercellen. Onze methode berust eerst op de roman proliferatieve activiteit van macrofagen in de gemengde cultuur van levercellen, en vervolgens de daaropvolgende isolatie en zuivering van deze cellen op basis van hun biologische kenmerken als macrofagen 9. Het kan mogelijk zijn de macrofagen verspreidden zich in de gemengde primaire cultuur van volwassen levercellen kunnen afkomstig zijn van Kupffer of verwante cellen die besmet in de parenchymale hepatocyten fractie. De macrofagen zou hebben gereageerd op specifieke veranderingen in het milieu veroorzaakt door de transformatie van de parenchymale hepatocyt 10 en andere fibroblastische cellen in de gemengde primaire culturen. Tot slot, onze methode biedt de isolatie van macrofaag-achtige cellen in voldoende aantal en de zuiverheid van de primaire cultuur van rat lever cellswithout met behulp van geavanceerde apparatuur en technische vaardigheden. Bovendien kan de isolatie procedure worden herhaald met dezelfde cultuur kolf gedurende meer dan twee weken. Deze methode zou kunnen worden voor andere zoogdieren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Natriumpentobarbital oplossing </td><td> Kyoritsu Seiyaku </td><td> Somnopentyl Injectie </td><td></td></tr><tr><td> Gebalanceerde zout Hank&#39;s oplossing (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> 032-10534 </td><td> Cel dissociatie kwaliteit (Lot check nodig) </td></tr><tr><td> Trypsine-remmer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9128 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum van essentieel belang Eagle&#39;s medium (MEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-4655 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s gewijzigd Eagle&#39;s medium (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-6459 </td><td> Hoge glucose-type </td></tr><tr><td> Foetaal kalf serum (FCS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td> Warmte geïnactiveerd bij 56 ° C gedurende 30 minuten. (Lot check nodig) </td></tr><tr><td> TrypLE Express </td><td> Invitrogen </td><td> 12605 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td> Ca 2 +-Mg 2 + gratis </td></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-7522 </td><td> Voorraad: 100 mM in gedestilleerd water </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-5500 </td><td> Voorraad: 10 mg / ml in 0,1 N HCl </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Cel zeef </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Maaswijdte: 100 micrometer </td></tr><tr><td> Weefselkweek fles </td><td> Sumitomo Bakelite Co, Ltd </td><td> MS-21250 </td><td> Oppervlakte: 75 cm 2 </td></tr><tr><td> Niet-weefselkweek plastic schaaltjes </td><td> BD Biosciences </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Celschraper </td><td> Corning Inc </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Wederzijdse shaker </td><td> TAITEC </td><td> NR-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen isolaat van mixed primaire culturen van adult levercellen

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffercellen zijn lever-specifieke inwoner macrofagen en spelen een belangrijke rol in de fysiologische en pathologische functies van de lever 1-3. Hoewel de isolatie methoden van de lever macrofagen zijn goed beschreven 4-6, de meeste van deze methoden vereisen geavanceerde apparatuur, zoals een centrifugaal elutriator en technische vaardigheden. Hier bieden we een nieuwe methode om de lever macrofagen te verkrijgen in voldoende aantal en de zuiverheid van de gemengde primaire culturen van volwassen ratten levercellen, zoals schematisch weergegeven in Figuur 1. Na dissociatie van de levercellen door twee-staps methode perfusie 7,8, een fractie voornamelijk uit parenchymale hepatocyten wordt voorbereid en gezaaid in T75 weefselkweek kolven met kweekmedium uit DMEM en 10% FCS.Parenchymal hepatocyten verliest de epitheliale cel morfologie binnen een paar dagen in cultuur en gedegenereerde of transformeren tot fibroblast-achtige cellen (figuur 2). Als de cultuur opbrengst, rond dag 6, fase-contrast-heldere, ronde macrofaag-achtige cellen beginnen te woekeren op de fibroblastische cel sheet (figuur 2). De groei van de macrofaag-achtige cellen voort te zetten en te komen tot een maximale niveaus rond dag 12, die de cel vel op de kolf oppervlak. Door schudden van de cultuur flacons, zijn macrofagen gemakkelijk opgehangen in het kweekmedium. Daaropvolgende overdracht en korte incubatie in plastic borden leiden tot een selectieve hechting van macrofagen (figuur 3), waar hij als andere contaminerende cellen blijven geschorst. Na meerdere keren wordt gespoeld met PBS, zijn bevestigd macrofagen geoogst. Meer dan 10 6 cellen kan herhaaldelijk worden geoogst uit dezelfde T75 weefselkweek kolf bij twee tot drie dagen intervallen van meer dan twee weken (figuur 3). Zuiverheden van de geïsoleerde macrofagen waren 95 tot 99%, zoals geëvalueerd door flowcytometrie of immunocytochemie met ratten macrofaag-specifieke antilichamen (figuur 4). De geïsoleerde cellen vertonen actieve fagocytose van polystylene kralen (figuur 5), proliferatieve respons op recombinant GM-CSF, secretie van inflammatoire / anti-inflammatoire cytokines na stimulatie met LPS, en de vorming van meerkernige reuscellen 9. Tot slot bieden we een eenvoudige en efficiënte methode om de lever macrofagen te verkrijgen in voldoende aantal en zuiverheid, zonder ingewikkelde apparatuur en skills.This methode moet wellicht worden voor andere zoogdieren.

Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Kupffer-cellen zijn lever-specifieke residente macrofagen en spelen een belangrijke rol in de fysiologische en pathologische functies van de lever1-3. Hoewel ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om meerdere macrofaagculturen te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van ratlevercellen, zonder dat hiervoor complexe apparatuur of vaardigheden nodig zijn. Dit wordt eerst bereikt door dissociatie van levercellen van volwassen ratten via collagenaseperfusie, gevolgd door isolatie van de parenchymale hepatocytcellenfractie. Vervolgens worden de cellen geïncubeerd in T 75 weefselkweekflessen met groeimedium om gemengde primaire culturen van levercellen te vestigen.Na 10 tot 12 dagen kweken worden de kweekflessen geschud om de overdracht van de macrofagen naar plastic schaaltjes te vergemakkelijken, waarna ze na een korte incubatieperiode door selectieve adhesie worden geoogst. Uiteindelijk kunnen meer dan 10 van de zes cellen herhaaldelijk worden geoogst uit dezelfde T 75 weefselkweekflessen met intervallen van twee tot drie dagen gedurende meer dan twee weken. Isolatiemethoden voor levermacrofagen zijn uitvoerig beschreven.De meeste eerdere methoden vereisen echter geavanceerde apparatuur, zoals een centrifuge, en verfijnde technische vaardigheden. Hier presenteren wij een eenvoudige en nieuwe methode om levermacrofagen in voldoende aantal en zuiverheid te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van adult gewrapte levercellen, waarvoor geen speciale apparatuur of geavanceerde laboratoriumvaardigheden nodig zijn. De dissectie van dieren, perfusie van de lever en preparatie van cyten zullen worden gedemonstreerd door doktoren Norco, Yamanaka en Miko yoshioka aan het National Institute of Animal Health.Vervolgens zal dr. Taketo Takeno van het National Institute of Agro Biological Sciences de isolatie en zuivering van levermacrofagen uit culturele risico's demonstreren. Laten we beginnen. Om de perfusie van de rattenlever voor te bereiden, begint u met het voorverwarmen van één fles wasoplossing en één fles collagenase-oplossing.Bevestig vervolgens de sedatie door middel van een huidknijptest, plaats een geanestheseerde volwassen mannelijke rat in een roestvrijstalen pan en spray 70% ethanol op de buik en thorax. Maak daarna met dissectiescharen een kleine incisie in het midden van de buik en pel de huid terug. Open vervolgens de buikholte met de schaar en bevestig de locatie van de vena portae.Haal vervolgens de chirurgische hechtdraad onder de vena portae door en trek de draad losjes aan. Klem daarna het distale deel van de vena cava inferior en de vena mesenterica af met een mosquito-klem om bloedreflux naar de lever te voorkomen. Open de borgholte door het diafragma met een schaar door te snijden en leg het hart bloot; maak na het maken van een kleine incisie in de vena portae met oogheenscharen een plastic katheter van 2 mm in de vene in en trek de draad stevig rond de katheter aan.Vul een perfusiesysteem met de voorverwarmde wasoplossing en sluit dit vervolgens aan op de katheter. Start de perfusie in C twee met een snelheid van 10 milliliters per minuut. Maak tegelijkertijd met dissectieschaar een incisie in de wand van het rechteratrium.Zet de perfusie gedurende 10 minuten voort, schakel vervolgens de perfusie-oplossing over naar de collagenase-oplossing en perfuseer gedurende 10 tot 20 minuten. Vul een steriel bekerglas met 25 milliliters collagenase-oplossing bij een snelheid van 10 milliliters per minuut. Verwijder vervolgens de geperfuseerde lever en plaats deze voorzichtig in het bekerglas.Hak de lever met een schaar in kleine stukjes. Voeg 75 milliliters koud MEM toe aan de resulterende celсусpensie. Filter de suspensie na voorzichtig pipetteren door een 100 micrometer cell strainer.Om het bindweefsel in de onverteerde weefselfragmenten te verwijderen, wordt het filtraat opgevangen in conische buizen van 50 milliliter. Overbreng het filtraat naar conische buizen van 50 milliliter en was de cellen vier keer door de cellen eerst één minuut te centrifugeren bij 50 Gs bij vier graden Celsius. Terwijl de centrifuge tot stilstand komt, wordt het supernatant voorzichtig weggegooid, waarna het pellet opnieuw wordt geresuspendeerd in koud MEM; na de laatste wasbeurt worden de cellen opnieuw gecentrifugeerd.Resuspendeer de levercellen in groeimedium. Zaai de cellen vervolgens uit in vijf tot 10 T 75 weefselkweekflessen met een dichtheid van 6,7 × 10⁴ cellen per vierkante centimeter. Plaats de kweekflessen in een incubator en vervang het groeimedium elke twee tot drie dagen.Na één dag kweek verspreiden de parenchymale hepatocyten zich over het oppervlak van de fles en vertonen ze een typische polygonale, op copaalsteen lijkende morfologie met één of twee ronde kernen. Binnen enkele dagen kweek verliezen de parenchymale hepatocyten hun epitheliale celmorfologie en transformeren ze tot vlakkere fibroblastische cellen. Rond dag zes beginnen, bij fasecontrast, heldere ronde macrophage-achtige cellen te prolifereren op het vel fibroblastische cellen. De groei van de macrophage-achtige cellen bereikt rond dag 12 maximale niveaus.Het aantal macrofaagachtige cellen neemt af rond dag 19, wanneer de fibroblastische cellaag begint te degenereren. Daarom suspenderen we na ongeveer zeven tot 10 dagen kweek de macrofagen die op de cellaag zijn geprolifereerd in het kweekmedium door de kweekflessen 30 minuten lang wederkerig te schudden nadat de macrofagen zijn geresuspendeerd. Vul elke plastic schaal van 100 millimeter (niet-weefselkweekkwaliteit) met het medium van twee T 75-flessen.Vul de kweekflesjes opnieuw met groeimedium en plaats ze terug in de incubator. Incubeer de plastic schaaltjes gedurende 30 minuten na de incubatieperiode en was de schaaltjes drie keer door het medium af te zuigen en de plastic schaal voorzichtig te spoelen met PBS, zoals hier te zien is; reeds 10 minuten na het uitplaten zijn macrofaag-achtige cellen gehecht aan het oppervlak van de schaal, terwijl andere contaminerende fibroblastische cellen in suspensie blijven. Na het spoelen met PBS is een zeer gezuiverde populatie macrofagen verkregen.Zoals in deze figuur te zien is, verkrijgen de cellen na 40 minuten kweek een typische macrofaagmorfologie en worden er regelmatig mitotische cellen waargenomen, zoals aangegeven door de pijlen. Om deze nieuwe, sterk gezuiverde populatie macrofagen te oogsten, voegt u één milliliter trip LE Express-oplossing toe aan de gewassen cellen en plaatst u de schaaltjes gedurende nog eens 10 minuten terug in de incubator. Voeg na deze incubatieperiode negen milliliter groeimedium toe, schraap vervolgens de aanhechtende macrofagen voorzichtig los met de celschraper, breng deze over naar een kegelvormige buis van 15 milliliter, centrifugeer en gooi het supernatant weg.Voeg één milliliter van het groeimedium toe, dissocieer de resuspendeerde celklonters tot enkelvoudige cellen door krachtig te pipetteren, en bepaal het celgetal met een hemocytometer zoals weergegeven in deze grafiek; meer dan 10^6 cellen kunnen herhaaldelijk met intervallen van twee tot drie dagen gedurende meer dan twee weken worden geoogst uit een T 75-kweekfles, wat een totale celopbrengst van 10^7 per T 75-kweekfles mogelijk maakt. Zoals te zien is in deze afbeeldingen, zijn de geïsoleerde cellen immunogekleurd met monoklonale antilichamen tegen rattenmacrofaagantigenen zoals CD 68 of ED 1 en CD 1 72 A of OX 41. Deze cellen bezitten functionele eigenschappen van macrofagen, zoals actieve fagocytose van FITC-gelabelde microbeads.In deze video hebben we een eenvoudige en efficiënte methode gepresenteerd om macrofagen te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van rode levercellen van volwassen dieren. Onze procedure vereist geen complexe apparatuur of vaardigheden, maar levert voldoende aantallen pure macrofagen op die herhaaldelijk kunnen worden geoogst uit dezelfde cultuur van brass. Deze methode kan worden toegepast op andere zoogdiersoorten.Bedankt voor het bekijken van de video en veel succes met uw toekomstige experimenten. Groetjes.

a-simple-efficient-method-to-isolate-macrophages-from-mixed-primary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te...

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

Lever verwondingen worden begeleid door voorlopercellen cel expansie die een heterogene populatie cellen vertegenwoordigt. Nieuwe indeling van deze cellulaire compartiment zorgt voor de onderscheidende meerdere subsets. De hier beschreven methode laat de flowcytometrieanalyse en hoge zuiverheid isoleren van diverse subsets die kunnen worden gebruikt voor verdere tests.

Isolatie en Verrijking van Liver Progenitor subsets geïdentificeerd door een Novel Surface Marker Combinatie

Hier tonen wij een enzymatische benadering van primaire hepatocyten te isoleren van volwassen muizen, en beschrijven we de kwantificering van een ontstekingsreactie middels ELISA en real-time PCR.

Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen

Dit protocol kan een onderzoeker te isoleren en karakteriseren weefsel-ingezeten macrofagen in diverse hallmark ontstoken weefsels dieet-geïnduceerde modellen van metabolische wanorde is onttrokken.

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Presenteren we een protocol voor het verkrijgen van proteomic handtekeningen van menselijke macrofagen en dit toepassen op de bepaling van de invloed van een lage zuurstof milieu op macrophage polarisatie.

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Dit protocol is een efficiënte, kosteneffectieve en robuuste methode voor het isoleren van primaire microglia van levend, volwassen, menselijk hersenweefsel. Geïsoleerde primaire menselijke microglia kan dienen als een instrument voor het bestuderen van cellulaire processen in homeostase en ziekte.

Het verkrijgen van Human Microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Hier presenteren we een protocol om de interactie van primaire humane monocyt-afgeleide macrofagen met een tumorsferoïde in een driedimensionale (3D) collageen I-matrix te onderzoeken, met de mogelijkheid om de impact van oplosbare en fysische eigenschappen van de micro-omgeving op celinvasie te vergelijken.

Een macrofaag-tumor sferoïde co-invasietest

Leer een eenvoudige methode om macrofagen te isoleren uit primaire levercelculturen van ratten zonder geavanceerde apparatuur. Deze techniek levert zuivere cellen op voor immunologisch onderzoek.

Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen

Meer video's verkennen