Een eenvoudige en efficiënte methode om macrofagen Isolaat van Mixed primaire culturen van Adult levercellen
May 24th, 2011
Een nieuwe methode om macrofagen te verkrijgen van de primaire cultuur van de levercellen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van de proliferatie van macrofagen in de cultuur, gevolgd door het schudden van de cultuur kolven en zuivering door middel van selectieve gehechtheid aan plastic schaaltjes. Deze techniek biedt een efficiënte lever macrofagen, zonder ingewikkelde apparatuur en vaardigheden.
Het algemene doel van het volgende experiment is om meerdere macrofaagculturen te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van rattenlevercellen zonder de behoefte aan complexe apparatuur of vaardigheden. Dit wordt eerst bereikt door dissociatie van volwassen rattenlevercellen door middel van collageenase-perfusie, gevolgd door isolatie van de parenchymale hepatocytcellenfractie. Vervolgens worden de cellen geïncubeerd in T 75-weefselkweekkolven met groeimedium om gemengde primaire culturen van levercellen te vestigen.
Dan, na 10 tot 12 dagen cultuur, worden de kweekkolven geschud om de overdracht van de macrofagen naar plastic schalen te vergemakkelijken, van waaruit ze vervolgens worden geoogst door selectieve adhesie na een korte incubatieperiode. Ten slotte kunnen meer dan 10 van de zes cellen herhaaldelijk worden geoogst uit dezelfde T 75-weefselkweekkolven met tussenpozen van twee tot drie dagen gedurende meer dan twee weken. Isolatiemethoden voor levermacrofagen zijn goed beschreven.
Echter, de meeste van de vorige methoden vereisen geavanceerde apparatuur zoals een centrifuge-illustrator en verfijnde technische vaardigheden. Hier presenteren we een eenvoudige en nieuwe methoden om levermacrofagen in voldoende aantal en zuiverheid te verkrijgen uit gemengde primaire culturen van volwassen ingepakte levercellen die geen speciale apparatuur of geavanceerde laboratoriumvaardigheden vereisen. Dierdissocatie, leverperfusie en bereiding van cellen worden gedemonstreerd door artsen Norco, Yamanaka en Miko Yoshioka in het National Institute of Animal Health.
Vervolgens zal de isolatie en zuivering van levermacrofagen van culturele risico's worden getoond door Dr. Taketo Takeno in het National Institute of Agro Biological Sciences. Dus laten we beginnen. Om de profusie van de ratatlever voor te bereiden, begint u met het voorverwarmen van één fles wasoplossing en één fles collageenase-oplossing.
Vervolgens, na bevestiging van sedatie door een huidpin, plaatst u een verdovende volwassen mannelijke rat in een roestvrij stalen pan en spuit 70% ethanol op zijn buik en borst. Maak vervolgens een kleine snede in het midden van de buik met dissectiescharen en pel de huid terug. Open vervolgens de buik met de schaar en bevestig de locatie van de poortader.
Breng vervolgens de chirurgische draad onder de poortader en draai de draad losjes vast. Klem vervolgens het distale deel van de inferieure vanoc cava en mesenteriale ader met een muggenklem af om bloedreflux in de lever te voorkomen. Open de borstholte door het middenrif met schaar te snijden en leg het hart bloot na het maken van een kleine incisie in de poortader met oogheelkundige schaar, breng een twee millimeter plastic katheter in de ader en draai de draad stevig om de katheter.
Laad een perfusiesysteem met de voorverwarmde wasoplossing en verbind het vervolgens met de katheter. Begin de profusie in C twee met een snelheid van 10 milliliter per minuut. Tegelijkertijd maakt u een snede in de wand van het rechter atrium met dissectiescharen.
Ga door met de profusie gedurende 10 minuten, vervolgens schakelt u de profusie-oplossing om naar de collageenase-oplossing en perfuseert u gedurende 10 tot 20 minuten. Vul bij een snelheid van 10 milliliter per minuut een steriele beker met 25 milliliter collageenase-oplossing. Verwijder vervolgens en plaats de perfuse lever voorzichtig in de beker.
Snijd de lever in kleine stukjes met schaar. Voeg 75 milliliter koude MEM toe aan de resulterende celsuspensie. Filter na voorzichtig pipetten de suspensie door een 100 micrometer cellezaaier.
Om het bindweefsel in de onverteerbare weefselfragmenten te verwijderen, verzamel de filtraat in 50 milliliter conische buisjes. Breng het filtraat over in 50 milliliter conische buisjes en was de cellen vier keer door de cellen eerst een minuut bij vier graden Celsius bij 50 Gs naar beneden te spinnen. Met de pauze, gooi voorzichtig het supernatant weg en suspendeer vervolgens de pellet in koud MEM en spin de cellen weer naar beneden na de laatste wassing.
Suspendeer de levercellen in groeimedium. Zaai nu de cellen in vijf tot tien T 75-weefselkweekkolven met een dichtheid van 6,7 keer 10 tot de vierde cellen per vierkante centimeter. Plaats de kweekkolven in een incubator en vervang het groeimedium elke twee tot drie dagen.
Na één dag cultuur, verspreiden de parenchymale hepatocyten zich op het kolvenoppervlak en vertonen een typische polygonaal kopal-achtige morfologie met een of twee ronde kernen. Binnen een paar dagen cultuur verliezen de parenchymale hepatocyten hun epitheliale celmorfologie en transformeren in meer afgeplatte fibroblastische cellen. Rond dag zes beginnen fasecontrast, heldere ronde macrofaag-achtige cellen zich te vermenigvuldigen op het fibroblastische cellenblad. De groei van de macrofaag-achtige cellen bereikt maximale niveaus rond dag 12.
Het aantal macrofaag-achtige cellen neemt af rond dag 19 wanneer het fibroblastische cellenblad begint te degenereren. Dus rond zeven tot tien dagen cultuur, suspenderen we de macrofagen die zich op het cellenblad hebben vermenigvuldigd in het kweekmedium door de kweekkolven gedurende 30 minuten te schudden nadat de macrofagen opnieuw zijn gesuspendeerd. Bespeel elk van de 100 millimeter niet-weefselkweekkwaliteit kunststof schalen met het medium van twee T 75-kolven.
Vul de kweekkolven opnieuw met groeimedium en plaats ze terug in de incubator. Incubeer de plastic schalen gedurende 30 minuten na de incubatieperiode, was de schalen drie keer door het medium af te zuigen en spoel de plastic schaal voorzichtig met PBS af zoals hier te zien is, al binnen 10 minuten na het plateren van macrofaag-achtige cellen die aan het oppervlak van de schaal hechten, terwijl andere besmettende fibroblastische cellen in suspensie blijven. Na de PBS-spoeling wordt een hoog gezuiverde macrofaagpopulatie verkregen.
Zoals te zien is in deze figuur, verkrijgen de cellen na 40 minuten cultuur een typische macrofaagmorfologie en mitotische cellen worden vaak waargenomen zoals aangegeven door de pijlen. Om deze nieuwe hoog gezuiverde macrofaagpopulatie te verzamelen, voegt u
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het verkrijgen van macrofagen uit primaire culturen van ratlevercellen. De techniek omvat de proliferatie van macrofagen in cultuur, gevolgd door het schudden van de kolven en het zuiveren van de cellen door selectieve hechting aan plastic schalen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Isolatiemethoden voor levermacrofagen zijn eerder beschreven.
- De meeste bestaande methoden vereisen complexe apparatuur en geavanceerde vaardigheden.
- Deze studie heeft tot doel het proces van het verkrijgen van levermacrofagen te vereenvoudigen.
- De methode is ontworpen om toegankelijk te zijn voor onderzoekers met basislaboratoriumvaardigheden.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige methode te ontwikkelen voor het oogsten van levermacrofagen.
- Om de noodzaak voor geavanceerde apparatuur in het isolatieproces te elimineren.
- Om een betrouwbare bron van macrofagen voor onderzoeksdoeleinden te bieden.
Gebruikte methoden
- Dissociatie van ratlevercellen met behulp van collagenase-perfusie.
- Opzetten van gemengde primaire culturen in T 75 weefselkweekkolven.
- Schudden van kweekkolven om macrofagen te resuspenderen voor zuivering.
- Selectieve hechting aan plastic schalen voor het oogsten van gezuiverde macrofagen.
Belangrijkste resultaten
- Meer dan 10 miljoen macrofagen kunnen herhaaldelijk uit dezelfde kolven worden geoogst.
- De methode levert een sterk gezuiverde populatie macrofagen op.
- Macrofagen vertonen typische morfologie en proliferatieve kenmerken.
- Isolatie kan worden uitgevoerd zonder geavanceerde technische vaardigheden.
Conclusies
- Deze nieuwe methode biedt een efficiënte manier om levermacrofagen te verkrijgen.
- De techniek is toegankelijk voor onderzoekers met basislaboratoriumcapaciteiten.
- De aanpak kan verdere studies in immunologie en celbiologie faciliteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of liver macrophages enables robust target validation and mechanistic studies in hepatic immunobiology. This simplified protocol eliminates the need for specialized equipment, supporting scalable and reproducible workflows in early discovery and preclinical research. The method's accessibility enhances portfolio flexibility for teams investigating liver-specific immune responses and disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of Kupffer cells for pathway elucidation in liver immunology.
- Supports biological de-risking by providing high-purity macrophage populations for mechanistic assays.
- Facilitates predictive confidence in target validation through reproducible cell isolation.
Screening & Assay Development
- Provides a reliable source of primary macrophages for assay standardization and optimization.
- Ensures reproducibility and quantitative output by yielding consistent cell numbers and purity.
- Enables scalable preparation of validated cell systems for compound screening and functional assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by supplying authentic liver macrophages for translational studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation in hepatic inflammation and immune modulation research.
- Reduces risk in advancing liver-targeted therapeutics by enabling robust in vitro characterization.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a standardized approach for isolating liver macrophages, supporting both mechanistic studies and assay development.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification in hepatic immune mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity macrophages for assay readiness and quantitative evaluation.
- Analytics: Enables flow cytometry and immunocytochemistry-based purity assessment and functional readouts.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant hepatic models for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable protocol adaptable across research teams and liver disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in liver immunology research.
- Operational Value: Streamlines workflows by removing the need for complex instrumentation and specialized skills.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling rapid, reproducible cell isolation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of liver-targeted programs through robust in vitro data generation.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture expertise and standard laboratory infrastructure.
- Utilizes common tissue culture flasks and plasticware, minimizing capital investment.
- Demands cross-team standardization for consistent cell yield and purity.
- Adaptable to other mammalian species with protocol optimization as needed.
- Dependent on careful timing and handling to maintain macrophage viability and function.
