Name: In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer stabiele in vivo beeldvorming van het muizenruggenmerg met twee-fotonmicroscopie. Deze methode minimaliseert ademhalingsartefacten met een aangepaste stabilisatieopstelling voor hoogresolutie longitudinale studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Multiple Sclerosis Society verlenen RG4595A1 / T naar DD en de NIH / NINDS beurzen NS051470, NS052189 en NS066361 naar KA figuren en films aangepast en / of overgenomen uit Davalos et al.., J ​​Neurosci Methods. 30 maart 2008, 169 (1) :1-7 Copyright 2008, met toestemming van Elsevier.

1. Het bouwen van de spinale stabilisatie-apparaat <ol><li> Bestel de Narishige STS-A Compact Spinal Cord klemmen en de Narishige MA-6N head holding adapter. </li><li> Op maat ontwerpen en maken een roestvrij stalen bodemplaat om de twee delen Narishige te houden op een lijn, zodat het dier het hoofd wordt ondersteund, terwijl de wervelkolom en de staart zijn geklemd. Houd er rekening mee dat het gehele apparaat moet onder de microscoop lens past meestal op een verlaagd microscoop podium. </li></ol> 2. Dier een operatie <ol><li> Verwarm de microscoop kamer met een luchtverwarming apparaat en handhaven bij 37 ° C. </li><li> Weeg het dier en maken het verdovingsmiddel mix met 100 mg ketamine, 15 mg en 2,5 mg xylazine acepromazine per kg lichaamsgewicht, verdund in 0,9% NaCl-oplossing onder steriele omstandigheden. </li><li> Verdoven van het dier door het inspuiten van de verdoving mix (KXA) intraperitoneaal. Regelmatig teen knijpen dient te worden uitgevoerd tot diep in de gehele narcosehet experiment. Te vullen met de helft van de oorspronkelijke dosis per uur of als dat nodig is. </li><li> Gebruik een klein dier verwarming pad om thermische ondersteuning te bieden tijdens het uitvoeren van de chirurgische procedure. </li><li> Pas kunstmatige tranen zalf op de ogen corneale uitdroging en beschadiging te voorkomen. </li><li> Eerste scheerbeurt de rug van het dier met een trimmen apparaat en vervolgens met een scherp mes om volledig haar te verwijderen uit het gebied rond de incisie. </li><li> Verwijder de haren geschoren en ontsmet de geschoren huid oppervlak met een alcoholdoekje. </li><li> Voer een klein (~ 1,5 cm) longitudinale incisie van de huid over het gewenste niveau van de wervelkolom (borstwervels hier afgebeeld). </li><li> Expose de rugspieren door voorzichtig het terugtrekken van de onderhuidse bindweefsel. </li><li> Haal voorzichtig het paravertebrale spieren van de wervelkolom op het gewenste niveau. Voer zo min mogelijk incisies om de spieren los te maken van beide zijden van elke processus spinosus en vervolgens de vrijstaande spieren schrapen eenweg van de laminaire oppervlak. </li><li> Kies de lamina dat wordt verwijderd en de voorbereiding van de plaatsen van binnenkomst voor de spinale klemmen aan weerszijden van de wervelkolom, onmiddellijk rostraal en caudaal van de laminectomie. Voorzichtig verplaatsen spierweefsel tot vier zakken waar de klemmen wordt ingevoegd maken. </li><li> Til de wervelkolom met de rechte vertanding-tip een tang om een ​​veilige plaatsing van de gebogen stompe-tip schaar onder de lamina toe zonder het aanraken van het ruggenmerg. Voer de laminectomie door langzaam te snijden op het bot aan de ene kant en daarna aan de andere kant. </li><li> Gebruik een wattenstaafje of voeg voorgesneden kleine gelfoam absorbeerbare gelatine spons stukken naast de incisies om kleine bloeden te beperken. Gebruik een klein schip cauterizer verder te bloeden onder controle te indien nodig. Gebruik voorverwarmde steriele kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) om weefsel te wassen. </li></ol> 3. Stabilisatie van de wervelkolom en de voorbereiding voor in vivo beeldvorming <ol><li> Plac e het dier op een hoogte pad op de bodemplaat van de spinale stabilisatie-apparaat en zet de kop in het hoofd holding adapter. </li><li> Plaats de spinale klemmen van de STS-A-apparaat langs de anterior-posterior as van het dier in de pre-en-klare zakken aan weerszijden van de laminectomie (figuur 1). De twee klemmen moet worden geplaatst onder een hoek van ~ 45 ° ten opzichte van rostro-caudale het dier as voldoende ruimte laten voor het verlagen van een onderdompeling in water lens over het blootliggende ruggenmerg (figuur 1). </li><li> Leg de derde klem van de STS-A-apparaat aan de basis van de staart, zodat het dier het lichaam kan worden opgeschort in de lucht na verwijdering van de hoogte pad voor de duur van de imaging experimenten (figuur 1). </li><li> Bouwen van een kleine bron van Gelseal (Amersham Biosciences Corp) rond de blootgestelde ruggenmerg naar het onderhoud van het ruggenmerg in ACSF en de onderdompeling van de microscoop lens in deze oplossing voor in vivo beeldvorming te vergemakkelijken. </li></ol>jove_title "&gt; 4. In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met twee-foton microscopie <ol><li> Breng het dier op de spinale stabilisatie-apparaat in de voorverwarmde kamer met betrekking tot de microscoop en zet het op een verlaagde microscoop podium plaatsen van de laminectomie recht onder de lens (zie figuur 1). </li><li> Voorzichtig lager een water-onderdompeling lens in de ACSF oplossing ervoor te zorgen dat het niet de ruggengraat klemmen of de Gelseal raken. </li><li> Gebruik epifluorescentie het gebied van interesse te identificeren en op te richten. Schakel over naar laser scanning mode en uit te voeren in vivo beeldvorming met behulp van de juiste twee-foton laser excitatie golflengte, koudlichtspiegel en bandpass filters voor de fluoroforen aanwezig in het verbeelde weefsel. </li></ol> 5. Repetitive beeldvorming en post-operatieve zorg <ol><li> Aan het einde van imaging experimenten, verwijder de muis van de spinale stabilisatie apparaat en zorgvuldig de Gelseal veeg uit het gebied rond de laminectomie.Reinig het gebied goed. </li><li> Te herstellen en hechtdraad de rugspieren over de laminectomie. </li><li> Te herstellen en hechtdraad de huid over de laminectomie, wattenstaafje met betadine. </li><li> Zorg voor een ml Ringers lactaat oplossing (Baxter Healthcare) als een nutriënt en hydratatie aan te vullen, evenals pijnstillende behandeling subcutaan (0,1 mg / kg buprenorfine). </li><li> Dien antiseptische behandeling intraperitoneaal (0,03 ml per muis, 2,27% enrofloxacine injecteerbare antibacteriële oplossing). </li><li> Plaats dier op een verwarmingselement tot volledig herstel van de anesthesie en vervolgens individueel huis is. </li><li> Dagelijks herhalen antiseptische administratie voor de eerste 3-5 dagen na de operatie en pijnstillende behandeling om de 8-12 uur gedurende 2-3 dagen post-operatief. Dagelijks te controleren dier om normaal gedrag en volledig herstel te verzekeren. </li><li> Voor de re-imaging via dezelfde laminectomie, de heropening van de gehechte huid en spieren en herhaal de stappen die worden beschreven in de punten 2 - 4. </li><li> Opnieuw vinden het vorige boekjaarously beeld gebracht gebied met behulp van het bloed vaatstelsel als een kaart, zoals eerder beschreven 10. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die door institutionele Animal Care en gebruik Commissies aan de Universiteit van Californië, San Francisco en zijn in overeenstemming met landelijke richtlijnen. Een foto van de spinale stabilisatie-apparaat en een schematische weergave van de positionering van een muis op het apparaat onder een microscoop lens is weergegeven in figuur 1. Het toestaan ​​van voldoende ruimte voor de ademhaling bewegingen onder het lichaam van het dier zorgt voor stabiel in vivo beeldvorming in het ruggenmerg. Figuur 2 toont de nauwe relatie tussen microglia en de bloedvaten zoals het was afgebeeld in vivo in het ruggenmerg van Cx3cr1 GFP / + transgene muizen 18, waarin de microglia zijn endogeen aangeduid met GFP. figuur 3 laat voorbeelden zien van repetitievein vivo beeldvorming als het was uitgevoerd in hetzelfde ruggenmerg gebieden in muizen die een fluorescerend eiwit in de wervelkolom axonen (YFP-H lijn 3) en microglia (in de Cx3cr1 GFP / + muizen). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stabilisatie van de wervelkolom muis voor in vivo beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie. (A) Een op maat gemaakte stalen bodemplaat wordt gebruikt ter ondersteuning en uitlijnen van de STS-A Narishige compacte ruggenmerg klemmen en de MA-6 N Narishige hoofd houden adapter zoals hier te zien. (B) De juiste plaatsing van volwassen transgene muizen verdoofd met een verdovingsmiddel KXA op de spinale stabilisatie-apparaat. De insert geeft de plaatsing van de wervelkolom klemmen onmiddellijk rostraal en caudaal aan de laminectomie en de blootgestelde ruggenmergweefsel. &lt;img alt = "Figuur 2" src = "/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg" /&gt; Figuur 2. In vivo beeldvorming van hoge dichtheid microgliale cellen en bloedvaten in het ruggenmerg van verdoofde muizen. Verwachte maar niet-gebonden z-stapels (A) zeer dichte GFP-positieve microglia (groen) in het ruggenmerg van een CX3CR1 GFP / + muis in de buurt met de bloedvaten (rood, gelabeld met iv injectie van rhodamine dextran). (B) High vergroting afbeelding gelabeld als in (A) van een enkele cel microgliale bevestigd aan de wand van een bloedvat met processen uitgebreid rond het schip en de richting van het ruggenmerg parenchym. Schaal van bars, 10μm. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Repetitive in vivo beeldvorming van dezelfde axonale segmenten en microglia zoals ze waren verplaatst en reimaged in het ruggenmerg van de verdoofde muizen op verschillende dagen. (A) YFP-lab eLED axonen op dag 0 en 5. (B). Dezelfde vasculaire structuren en microgliacellen om hen heen afgebeeld in vivo in het ruggenmerg van Cx3cr1 GFP / + muizen op dag 0 en 1. Schaal van bars, 10μm. Film 1. Vertegenwoordiger timelapse volgorde verworven in vivo van de muis ruggenmerg. Deze volgorde toont in detail fijn microgliacellen procesdynamica (groen) en hun interacties met het vaatstelsel (rood, gelabeld met een iv injectie van rhodamine dextran) na verloop van tijd in een tissue dichtbevolkt met fluorescerende structuren. De ruwe beelden zijn alleen gecorrigeerd voor achtergrondgeluid, helderheid en het contrast en de timelapse film werd gebouwd door het projecteren van z-volgorde opgenomen beelden, zonder beeld uitlijning, middeling of z-selectie van individuele vliegtuigen. Bloedvaten gaan door een vergelijkbare reeks van z vliegtuigen als de beelden van microglia. Z-vlak diepte: 38 micrometer.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "&gt; Klik hier om de film te bekijken. Movie 2. Timelapse volgorde tonen de rauwe stabiliteit van de imaging-methode op het niveau van een enkele z-vlak. Een snelle verwerving van datzelfde single z-vlak in het ruggenmerg van CX3CR1 GFP / + muizen op de spinale stabilisatie apparaat onder KXA verdoving, toont een minimale image verplaatsing tussen opeenvolgende frames met een scansnelheid van 1 frame / s die sneller is dan de ademhalingsfrequentie van de muis. De minor resterende verplaatsing is waarschijnlijk te wijten aan hartslag. <a alt="Movie 2" href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">Klik hier om de film te bekijken.</a>

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
<li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li>
<li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420, 812-816 (2002).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385, 161-165 (1997).</li>
<li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca2%2B+signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li>
<li>Christie, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+arrest+of+individual+senile+plaques+in+a+model+of+Alzheimer%27s+disease+observed+by+in+vivo+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy.</a> J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).</li>
<li>Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+amyloid+deposition+leads+to+local+synaptic+abnormalities+and+breakage+of+neuronal+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches.</a> Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Fractalkine+Receptor+CX3CR1+Function+by+Targeted+Deletion+and+Green+Fluorescent+Protein+Reporter+Gene+Insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat. Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Kim, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).</li>
<li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li>
<li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4%2B+T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 203, 505-511 (2006).</li>
<li>Lindquist, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).</li>
<li>Schwickert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode zorgt voor een stabiele en repetitieve in vivo beeldvorming van dichtbevolkte TL-cellulaire structuren in het ruggenmerg van verdoofde muizen met behulp van twee-foton microscopie. De bereikte stabiliteit is een gevolg van een custom-made spinale stabilisatie-apparaat en een verdovingsmiddel regime dat de luchtwegen veroorzaakte beweging artefact vermindert. De spinale stabilisatie-apparaat laat ademen ruimte onder de muis lichaam en kan worden gebouwd met behulp van commercieel verkr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Rhodamine B dextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 kDa, verdund in ACSF (3% w / v) </td></tr><tr><td> Ketamine HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC No: 67457-001-10 </td><td> Injecteerbare, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Labs </td><td> NADA No: 139-236 </td><td> Xylazine injecteerbare, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acepromazine </td><td> Vedco </td><td> NADA No: 117-531 </td><td> Injecteerbare, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Kunsttranen zalf </td><td> Phoenix farmaceutisch </td><td> NDC No: 57319-760 - 25 </td><td> Smeermiddel </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Visser </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson-Westcott Schaar </td><td> Wereld Precision Instrumenten </td><td> 555500S </td><td> Gebogen, stompe-tip schaar </td></tr><tr><td> Rechte Forceps </td><td> Wereld Precision Instrumenten </td><td> 555047FT </td><td> Getande tip tang </td></tr><tr><td> Klein schip uitbranden </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, Pfizer Inc </td><td> Mixer Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Compact ruggenmerg klemmen </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Hoofd houden adapter </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Lactaat Ringers </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc </td><td> NDC No: 12496 - 6757-1 </td><td> Buprenorfine, injecteerbare </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> NADA 140-913 </td><td> Enrofloxacin, antibacteriële injecteerbare 2,27% (20ml) </td></tr><tr><td> Verwarming pad - Grote </td><td> Fine Science Tools </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton microscopie

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie 1 in muizen die genetisch zijn gemanipuleerd om fluorescerende eiwitten uit te drukken in specifieke celtypen 2-3 aanzienlijk verbreed onze kennis van fysiologische en pathologische processen in een groot aantal weefsels in vivo 4-7. In studies van het centrale zenuwstelsel (CZS), is er sprake van een brede toepassing van in vivo beeldvorming in de hersenen, die heeft geleid tot een overvloed aan nieuwe en vaak onverwachte bevindingen over het gedrag van cellen zoals neuronen, astrocyten, microglia, onder fysiologische of pathologische condities 8-17. Echter, veelal technische complicaties beperkt de uitvoering van de in vivo beeldvorming in studies van de levende muis ruggenmerg. In het bijzonder, de anatomische nabijheid van het ruggenmerg naar de longen en het hart genereert belangrijke beweging artefact dat maakt beeldvorming van de woonkamer ruggenmerg een uitdagende taak. </p&gt; We ontwikkelden een nieuwe methode die de inherente beperkingen van het ruggenmerg imaging overwint door het stabiliseren van de wervelkolom, waardoor de luchtwegen veroorzaakte bewegingen te creëren, waardoor het gebruik van twee-foton microscopie aan het imago van de muis ruggenmerg in vivo. Dit wordt bereikt door het combineren van een op maat gemaakte spinale stabilisatie-apparaat met een methode van diepe verdoving, wat resulteert in een significante vermindering van de luchtwegen veroorzaakte bewegingen. Deze video laat zien hoe protocol aan de kaak een klein gebied van de levende ruggenmerg die kan worden gehandhaafd onder stabiele fysiologische omstandigheden gedurende langere tijd door het houden van weefselbeschadiging en bloeden tot een minimum. Vertegenwoordiger van RAW-afbeeldingen verworven in vivo detail in hoge resolutie de nauwe relatie tussen microglia en de bloedvaten. Een timelapse sequentie toont het dynamisch gedrag van microglia processen in de levende muis ruggenmerg. Bovendien is een continu scannen van dezelfde z-frame aan te tonens de uitstekende stabiliteit die deze methode kan bereiken stapels van beelden en / of timelapse films die niet nodig beelduitlijning na de overname te genereren. Tot slot laten we zien hoe deze methode gebruikt kan worden om opnieuw en Reimage hetzelfde gebied van het ruggenmerg op latere tijdstippen, waardoor voor longitudinale studies van lopende fysiologische of pathologische processen in vivo.

Een minimaal invasieve protocol om de muis te wervelkolom te stabiliseren en uit te voeren repetitieve<em&gt; In vivo</em&gt; Ruggenmerg beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie wordt beschreven. Deze methode combineert een spinale stabilisatie-apparaat en een verdoving regime aan de luchtwegen veroorzaakte bewegingen te minimaliseren en de productie van ruwe beeldgegevens dat er geen uitlijning of andere post-processing nodig.

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

In vivo imaging met behulp van tweefotonmicroscopie bij muizen die genetisch zijn gemodificeerd om fluorescerende eiwitten in specifieke celtypen te tot expressie te brengen, heeft ...

Het doel van deze procedure is om stabiele in vivo imaging in het ruggenmerg van de muis uit te voeren met behulp van tweefotonmicroscopie. Dit wordt bereikt door het dier eerst te anesthetiseren met een anestheticummengsel dat een gestaag maar rustig ademhalingsritme bewerkstelligt. De tweede stap van de procedure is het blootleggen van de wervelkolom op het gewenste niveau, gevolgd door een laminectomie om het onderliggende ruggenmerg bloot te leggen, zodat dit in vivo kan worden afgebeeld.De derde stap is het plaatsen van het dier op het apparaat voor spinale stabilisatie. De laatste stap is de isolatie van het blootgelegde segment van het ruggenmerg. Ter voorbereiding op in vivo beeldvorming kunnen uiteindelijk resultaten worden verkregen die het dynamische gedrag van cellen en hun interacties met andere celtypen of structuren in het levende ruggenmerg in detail beschrijven, middels time-lapse in vivo beeldvorming met tweefotonmicroscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van eerdere pogingen om het ruggenmerg in vivo in beeld te brengen, is dat het in vivo beeldgegevens genereert die geen nabewerking vereisen en onmiddellijk kunnen worden geëvalueerd en gebruikt voor verdere analyse. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de behandeling na letsel aan het ruggenmerg of ziekte, omdat het ons bijvoorbeeld in staat stelt om de progressie van axonale degeneratie of regeneratie na bijvoorbeeld een letsel in real-time te bestuderen, naast ruggenmergletsel. Deze techniek kan worden gebruikt om de progressie van inflammatoire of neurodegeneratieve processen in diermodellen van ziekten te bestuderen, zoals multiple sclerose of amyotrofische laterale sclerose, waarbij de pathologie van de ziekte prominent aanwezig is in het ruggenmerg.Begin de procedure door het dier te wegen. Anestheseer het dier vervolgens door het anestheticummengsel intraperitoneaal te injecteren. Voer regelmatig een knijptest bij de tenen uit om te controleren of het dier gedurende het gehele experiment diep onder narcose blijft, en vul dit indien nodig elk uur aan met de helft van de oorspronkelijke dosis anestheticum.Breng vervolgens kunsttranenzalf aan op de ogen om dehydratie en beschadiging van het hoornvlies te voorkomen. Trim het haar op de rug van het dier met een trimapparaat en scheer het resterende haar weg met een scherp mesje. Plaats het dier na desinfectie van het geschoren gebied onder een microscoop en begin de procedure door een kleine longitudinale incisie van ongeveer 1,5 centimeter te maken boven het gewenste spinale niveau.Leg de rugmusculatuur vrij door het subcutane bindweefsel voorzichtig te retraheren. Scheid vervolgens zorgvuldig de paravertebrale spieren van de wervelkolom op het gewenste niveau. Maak zo min mogelijk incisies om de spieren aan beide zijden van elke doornuitsteeksel los te maken.Schraap vervolgens de losgemaakte spieren van het laminaatoppervlak weg. Gebruik indien nodig een kleine vatcauterisator om geringe bloedingen te beheersen. Ga door met het schrapen van de spieren totdat het onderliggende laminaat voldoende is blootgelegd en u degene die u gaat verwijderen duidelijk kunt identificeren.Om de insteekplaatsen voor de spinale klemmen aan weerszijden van de wervelkolom voor te bereiden, steekt u de punten van een gebogen schaar tussen de paravertebrale spieren en verschuift u voorzichtig het spierweefsel om vier pockets te creëren waarin de klemmen worden geplaatst. Til de wervelkolom op met de rechte getande pincet om een veilige inbreng van de gebogen stompe schaar onder de lamina mogelijk te maken zonder het ruggenmerg te raken. Voer vervolgens de laminectomie uit door het bot langzaam aan één zijde en daarna aan de andere zijde door te snijden; gebruik een wattenstaafje of breng een voorgesneden klein stukje absorbeerbare gelatinespons van gelfoam aan naast de incisie om geringe bloedingen te beperken.Gebruik daarna de voorverwarmde steriele kunstmatige cerebrospinale vloeistof om het weefsel te wassen. Er is een op maat gemaakt spinaal stabilisatieapparaat ontworpen met als belangrijkste componenten de Nagate STSA complex spinal cord clamps en de Nagate MA six N head holding adapter. Er is een basisplaat van roestvrij staal gemaakt om twee naga-onderdelen in uitlijning te houden, zodat de kop van het dier wordt ondersteund terwijl de wervelkolom en de staart zijn vastgeklemd.Houd er rekening mee dat het gehele apparaat onder de microscooplens op een verlaagde microscooptafel moet passen om het dier te stabiliseren. Plaats het dier eerst op een verhoogd kussentje op de basisplaat van het ruggenmergstabilisatie-apparaat. Nadat de kop is vastgezet in de kophouderadapter, wordt de spinale klem van het SDSA-apparaat langs de anterieur-posterieure as van het dier in de vooraf geprepareerde pockets geplaatst, flankerend aan de laminectomie.Plaats de twee klemmen in een hoek van ongeveer 45 graden ten opzichte van de ROS cordale as van het dier, zodat er voldoende ruimte is om de waterimmersielens boven het blootgelegde ruggenmerg te laten zakken. Plaats vervolgens de derde klem aan de basis van de staart, zodat het lichaam van het dier kan worden opgehangen na verwijdering van het verhogingskussen tijdens het beeldvormingsexperiment. Bouw daarna een klein reservoir van gelseal rond het blootgelegde ruggenmerg om het in stand houden van het ruggenmerg in A CSF te vergemakkelijken.Verwijder vervolgens het verhogingskussen wanneer u klaar bent om te beginnen met de in vivo beeldvorming, breng het stabilisatieapparaat naar de voorverwarmde microscoopkamer en plaats het op de verlaagde microscooptafel. Zorg ervoor dat de laminectomie is uitgelijnd met de lens. Laat de waterimmersielens voorzichtig in de A CSF-oplossing zakken en zorg ervoor dat deze de spinale klemmen of de gelafdichting niet raakt.Gebruik epifluorescentie om het gebied van belang te identificeren en focus vervolgens hierop. Schakel over naar de laser-scanningmodus en voer in vivo imaging uit met de juiste twee-foton laser-excitatie, golflengte, dichroïsche spiegels en banddoorlaatfilters voor de fluoroforen die in het weefsel van het beeld aanwezig zijn. Verwijder het dier na afloop van de imaging-experimenten uit het apparaat voor spinale stabilisatie.Veeg de gelafdichting voorzichtig af van het gebied rond de laminectomie en maak dit schoon. Hecht de rugspieren zorgvuldig over de laminectomie heen. Hecht vervolgens de huidincisie en dep deze met Betadine, hier getoond als een projectie van Zack-beelden zoals deze in vivo vereist waren en vervolgens langs de Z-as werden geprojecteerd zonder beelduitlijning.De afbeelding toont zeer dichtbevolkte GFP-positieve microgliacellen in het groen, in nauwe nabijheid van bloedvaten in het rood in het ruggenmerg. Hier is een afbeelding met hoge vergroting van een enkele microgliacel die aan de wand van een bloedvat is gehecht, waarop in detail enkele van de uitlopers te zien zijn die rond het vat en sommige richting het parenchym van het ruggenmerg zijn uitgestrekt. Hier is een voorbeeld van repetitieve in vivo beeldvorming van dezelfde YFP-gelabelde axonale segmenten, terwijl deze werden herlokaliseerd en opnieuw werden afgebeeld in het ruggenmerg van dezelfde YFPH-lijn muis tijdens twee verschillende sessies met vijf dagen ertussen. Dit is een ander voorbeeld van repetitieve beeldvorming waarop dezelfde vasculaire structuren en microgliacellen in vivo in het ruggenmerg zijn afgebeeld op twee opeenvolgende dagen.Hier is een representatieve time-lapse sequentie die in vivo uit het ruggenmerg is verkregen. Deze sequentie toont in detail het dynamische gedrag van de fijnere uitlopers van microgliacellen in het groen en hun interacties met de vasculatuur in het rood. In de loop van de tijd werden de ruwe beelden alleen gecorrigeerd voor achtergrondruis, helderheid en contrast, en de time-lapse film werd geconstrueerd door sequentieel beeldstacks te samenvoegen zonder beelduitlijning.Gemiddeld over een selectie van individuele vlakken, waarbij bloedvaten een vergelijkbaar bereik van Z-vlakken doorlopen als de beelden van microglia. De diepte van het beeldvolume is 38 microns. Dit is een time-lapse sequentie die de stabiliteit van de beeldmethode op het niveau van een enkel Z-vlak laat zien.Snelle acquisitie van hetzelfde enkele Z-vlak in het ruggenmerg van een CX3CR1-GFP heterozygotische muis, geanestheseerd met de KXA-mix en geplaatst op het ruggenmergstabilisatieapparaat, laat een minimale beeldverschuiving zien tussen opeenvolgende frames. Opmerkelijk is dat de snelheid van deze sequentie één frame per seconde was, wat sneller is dan de ademhalingssnelheid van de muis. De geringe resterende verschuiving is waarschijnlijk te wijten aan de hartslag van het dier.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het aantal incisies tot een minimum te beperken en eventuele kleine bloedingen onmiddellijk te stelpen zodra deze optreden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van stabiele in vivo beeldvorming in het ruggenmerg van de muis met behulp van tweefotonmicroscopie.

in-vivo-imaging-of-the-mouse-spinal-cord-using-two-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Nishimura, C. et al. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (2016). This video demonstrates the in vivo visualization of cortical capillaries in the mouse brain using two-photon microscopy. It outlines the steps for injecting a fluorescent dye into an anesthetized mouse with a thin-skull cortical window, preparing the setup for imaging, and acquiring detailed images of brain...

 Two-Photon Microscopy for In Vivo Imaging of Mouse Brain Microvasculature 

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

In deze video, beschrijven we een werkwijze voor het implanteren van een chronische optische beeldvorming kamer via dorsale ruggenmerg van een levende muis. De kamer, chirurgische ingreep, en chronische beeldvorming worden beoordeeld en aangetoond.

Een procedure voor het implanteren van een Spinal Kamer voor Longitudinaal In Vivo Beeldvorming van de Muis Spinal Cord

Twee-foton intravital beeldvorming kan worden gebruikt om interacties tussen verschillende celtypen in het ruggenmerg in hun oorspronkelijke weefselomgeving in een botmerg chimerisch dier met een traumatische ruggenmergverplettering in de dorsale kolom te onderzoeken.

Intravitale Imaging van Axonale Interacties met Microglia en macrofagen in een muis Dorsale Column Crush Injury

Een nieuw ex vivo voorbereiding voor het afbeelden van de muis ruggenmerg. Dit protocol maakt twee-foton beeldvorming van levende cellulaire interacties gehele ruggenmerg.

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

We voeren een in vivo imaging methode met behulp van twee verschillende fluorescente kleurstoffen om dynamische spinale vasculaire wijzigingen na een contusive dwarslaesie bij volwassen Sprague-Dawley ratten te houden.

Een In Vivo Duo-kleur methode voor Imaging-vasculaire Dynamics na Contusive dwarslaesie

Dit protocol beschrijft implantatie van een glas venster op het ruggenmerg van een muis om visualisatie te vergemakkelijken door intravital microscopie.

Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.

Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen

Leer stabiele in vivo beeldvorming van het muizenruggenmerg met twee-fotonmicroscopie. Deze methode minimaliseert ademhalingsartefacten met een aangepaste stabilisatieopstelling voor hoogresolutie longitudinale studies.

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

Meer video's verkennen