Een protocol voor het verzamelen en Kleuring Hemocytes uit de Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Het algemene doel van deze procedure is het verzamelen en kleuren van hemocyten uit muggen. Dit wordt bereikt door eerst een klein volume anticoagulant diluent in gekoelde muggen te injecteren. Om de hemocyten los te maken en alle hemocyten in oplossing te brengen.

De tweede stap van de procedure is het verwijderen van de poten, vleugels en de punt van het abdomen van de mug. Ten derde wordt er vers verdunner in een aparte plek van de mug gespoten om het perfusieproces te starten. De laatste stap is om de verdunde hemolymfe op een voorbereid objectglas te leiden, zodat de verzamelde hemocyten gefixeerd en gekleurd kunnen worden.

Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die via basis-glide-microscopie de belangrijkste typen en het aantal hemocyten-sites in de betreffende muggensoort laten zien. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals profusie is dat het de eenvoud van profusie combineert met de nauwkeurigheid van hoge injectiemethoden, maar met minder stappen tot het uiteindelijke doel. Ons doel is om de typen hemocyten en hun overvloed te identificeren als reactie op immuunutdagingen.

Deze techniek wordt gedemonstreerd door Amina Abdul Kum, een undergraduate student uit mijn laboratorium. Bereid vóór aanvang van het protocol de verdunningsoplossing voor hemolymfe in aliquots van één milliliter. Bewaar deze bij min 20 graden Celsius en vries ongebruikte delen van een aliquot niet opnieuw in.

Kras nu cirkels van één centimeter op microscoopglaasjes met een dikte van één millimeter. Er is één glaasje per mug nodig. Bereid getrokken naalden voor.

Breek de punt van elke getrokken naald af om een opening voor de naald te maken. Plaats één naald in de houder die is verbonden met de slang- en spuitcomponenten van een micro-injector. Verwijder vervolgens luchtbellen uit de assemblage van de slang en de naaldhouder met behulp van minerale olie.

Vul deze handspuit met minerale olie en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats iets onder de naald om druppelende olie op te vangen. Open dit onderdeel van de micro-injector en vul dit vervolgens met olie om eventuele luchtbellen te verwijderen.

En dit wordt gewoon op deze handinjectiespuit geklikt, net zoals bij de andere tip. Injecteer de minerale olie langzaam zodat deze door de plastic slang vloeit en eventuele aanwezige luchtbellen worden verwijderd. Vul vervolgens de bovenkant opnieuw met minerale olie tot het punt waarop het begint te druppelen.

Sluit dit vervolgens weer aan op deze glazen spuit om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Vul de geassembleerde componenten daarna aan met minerale olie totdat alle naaldbuisjes en de spuit volledig zijn gevuld. De micro-injector is nu klaar voor gebruik voor het toedienen van het verdunningsmiddel.

Bereid vervolgens de dieren voor door 15 volwassen vrouwtjes in een kleine, stevige kooi te zuigen, die vervolgens volledig in ijs wordt ondergedompeld. De muggen worden geanestheseerd wanneer ze door de kou immobiliseren, wat meestal acht minuten of minder duurt. Plaats een individuele geanestheseerde mug op een uitsparingplaatje waar de micro-injectie zal plaatsvinden.

Neem onder de microscoop 12 µL hemolymfe-verdunner op in de micro-injectorspuit. Zet de mug voorzichtig met een pincet onder de microscoop vast en injecteer drie tot 3,5 µL van de verdunner. Tussen het zevende en achtste abdominale segment zal het abdomen opzwellen.

Terwijl het verdunningsmiddel wordt geïnjecteerd, kunnen drie muggen worden geïnjecteerd. Plaats alle geïnjecteerde muggen, voordat de micro-injector opnieuw wordt geladen, in een schone plastic beker op ijs, waar de muggen ongeveer vijf minuten kunnen herstellen. Tijdens de incubatie zorgt het antistollingsverdunningsmiddel ervoor dat hemocyten die aan interne weefsels kleven, worden losgemaakt.

Terwijl de eerste groep dieren herstelt tijdens de incubatie, kunnen gewoonlijk nog eens drie tot vijf muggen worden geïnjecteerd. Bereid de geïnjecteerde muggen na vijf minuten, terwijl ze nog in het bekerglas zitten, voor door hun poten, vleugels en de uiteinden van hun abdomenen bij het achtste segment af te knippen met microscharen. Let erop dat de poten en vleugels niet te dicht bij de thorax of hemo worden afgeknipt.

Limp kan ontsnappen. Was nu een etsglaasje in 70% ethanol en droog het af met een Kimwipe. Positioneer onder de microscoop één gedissecteerde mug aan de buitenrand van de geëtste cirkel.

Vul de micro-injector met 12 µL vers verdunningsmiddel. Houd de muskiet vast met een pincet en injecteer acht tot 10 µL in de laterale zijde van de mesothorax. Zorg ervoor dat er na deze injectie geen minerale olie wordt geïnjecteerd.

Hemolymfe zal vanuit het abdomen in de etscirkel worden verzameld; knijp voorzichtig in het abdomen met een pincet om de stroom van de hemolymfe te sturen en te bevorderen. Laat de verzamelde hemolymfe nu op het preparaat drogen. Dit zou ongeveer 10 minuten duren.

Het is vervolgens klaar om gekleurd te worden. Kleur elk objectglas afzonderlijk met Hema three. Dompel elk objectglas vijf keer in het fixatief, telkens slechts een seconde per dompeling.

Volg dit met drie dompelbeurten van elk één seconde in oplossing één, en vervolgens in oplossing twee. Spoel nu alleen de achterzijde van het preparaatglas af met gedeïoniseerd water, niet de voorkant. Droog de voorzijde en monteer een dekglas met monteermedium; druk het dekglas voorzichtig aan zodat het medium het gekleurde weefsel volledig bedekt.

Laat het preparaat nu minimaal drie uur drogen voor optimale resultaten. Gekleurde hecytes moeten binnen twee weken na deze preparatie worden gevisualiseerd en gefotografeerd. Deze cellen van volwassen vrouwtjes werden geïdentificeerd met behulp van dit protocol.

De eerste afbeelding toont een pro-hematopoëtische site, gebaseerd op de fal-vorm en de hoge kern-cytoplasmaratio. Deze afbeelding is van een ENO-cyt, gebaseerd op de fal-vorm en de cytoplasma-kernratio. Tot slot is dit een granulocyten-type hematopoëtische site.

Het heeft een meer granulaire textuur en is qua vorm meer een OID vergeleken met eerdere injectiemethoden. Dit protocol leverde een vergelijkbaar totaal aantal hemocyten op en identificeerde op dezelfde wijze granulaire sites als het meest voorkomende celtype. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd voor ongeveer 15 tot 20 muggen, mits correct uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u muggen correct injecteert met dent, hoe u hun hemos verzamelt en hoe u deze hemos vervolgens voorbereidt voor visualisatie en beeldvorming.