Name: Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Verken genexpressieprofielen in C. elegans met microarray-analyse en real-time PCR-validatie. Deze methode identificeert kandidaatgenen en biedt inzicht in genetische mechanismen bij nematoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd uitgevoerd door studenten van Southwestern Oklahoma State University, Weatherford OK. Dit werk werd ondersteund door NSF RUI-0963258, NIH OK-INBRE 2P20RR016478, GCAT en OCAST HR09-137S. De vsm1 (ok1468) mutant werd geïsoleerd door de Oklahoma Gene Knockout Consortium. De auteurs danken Dan Stefanovic en Tanner Wheeler voor hun waardevolle hulp tijdens de uitvoering van het project.

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit onderzoek ontwikkelden we een eenvoudig, gebruiksvriendelijk protocol dat gebruikt kan worden om bepaald genexpressieprofielen ten grondslag liggen aan verschillende biologische fenomenen. In dit protocol werd totaal RNA voor het eerst geïsoleerd en behandeld worden met behulp van DNase I. Onze manier van RNA-isolatie is sterk vereenvoudigd door het weglaten van fenol extractie en het gebruik van harsen affiniteit voor het opruimen 5,6. Kortom, C. elegans cuticule en celmembranen waren gebarsten te openen door ze te bevriezen met vloeibare stikstof nematoden en slijpen met moleculaire hars. Vervolgens geëxtraheerde RNA werd behandeld met DNase ik al eerder cDNA synthese. De volgende stap werd toegevoegd aan niet-specifieke hybridisaties minimum te beperken; RNA-monsters besmet met genomisch DNA kunnen introduceren interferentie en produceren veel vals-positieven. Dan, wild type en VSM-1 (ok1468) mutant cDNA&#39;s werden getagd met Cy3 en Cy5 vastleggen sequenties en gehybridiseerd op C. elegans microarrays verkregen via de GCAT programma. Dit systeem is gevoeliger dan soortgelijke producten, en zijn twee kleuren ontwerp vermindert het aantal benodigde arrays, wat resulteert in meer tijd en kosten efficiency 7,8. Bovendien wordt dit systeem niet vereist dat de gespecialiseerde apparatuur van andere soortgelijke systemen; dan ook, deze procedure zou worden gebracht in elke standaard laboratorium setting 7. Ten derde, TL-gehybridiseerd reeks beelden werden geanalyseerd met behulp van de open source software MAGICTool, en genexpressie profielen werden gemaakt. MAGICTool is een gebruiksvriendelijk programma dat gemakkelijk wordt gebruikt door mensen van alle niveaus, van de undergraduate tot de post-doctoraat. Echter, optimale prestaties vereist grote geheugen beschikbaarheid. Ten slotte kandidaat-genen verkregen met behulp van microarray analyse werden gevalideerd met real time PCR. Hoewel de genomische benadering is een efficiënte methode voor het bestuderen van biologische verschijnselen, zijn er een aantal beperkingen een rekening moet worden gehouden. De eerste, ondanks de specificiteit van deze microarray protocol, afschriften binnen een familie zijn niet te onderscheiden van elkaar als de gedrukte oligonucleotide wordt genomen uit geconserveerde sequenties. Real time PCR compenseert overeenkomsten binnen een gen familie en kan zelfs onderscheid maken tussen specifieke isovormen van hetzelfde gen. Echter, met real time PCR is het een uitdaging om echte controles die worden uitgedrukt even het hele levensduur van een organisme te vinden. Vanwege dit, zullen de resultaten worden de relatieve. Een proteomics benadering is een alternatief voor onze techniek. Individuele eiwitten kunnen worden geïsoleerd met behulp van 2D-gelelektroforese en geïdentificeerd met massa-spectrometrie. Onze studies tonen aan dat met name veel leden van de Major Sperma Protein (MSP) familie worden geïnduceerd in VSM-1 mutant nematoden met verbeterde synaptische densiteit. MSP&#39;s zijn uniek voor C. elegans en zijn verantwoordelijk voor eicel rijping en ovulatie. Chai 1 heeft aangetoond dat de regulering van presynaptische Bouton aantal en grootte op de neuromusculaire junctie in fruitvliegen waarschijnlijk wordt gecontroleerd door moleculen die bestaan ​​uit Major Sperma Protein domeinen. Studies van Tsuda en zijn collega&#39;s hebben aangetoond dat twee Major Sperma eiwitdomeinen kunnen dienen als liganden voor Ephrine receptoren, triggering receptor tyrosine kinase signalering cascades. Bovendien, real-time PCR analyse gevalideerd en versmald microarray resultaten op een lid van het MSP-familie, MSP-32. Bij elkaar genomen, het werk dat hier wordt gepresenteerd is een genoom-brede analyse van een centrale neurowetenschap dilemma evenals de macht van de undergraduate onderzoek in het wetenschappelijke streven.

<table border="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> Catalog # </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> RNA Later </td><td> AM7020 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Moleculaire Slijpen Resin </td><td> 786-138 </td><td> Gbiosciences </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> 74104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNAse-vrij Agarose LE </td><td> AM9040 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> NorthernMax Gly 10X Gel Prep / Running Buffer </td><td> 8678 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> RNA Millennium Marker </td><td> AM7150 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> Glyoxal Sample Loading Dye </td><td> 8551 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> DNase set </td><td> 79254 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RNeasy MinElute Kit </td><td> 74204 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> RT Enzym en 5X reactiebuffer </td><td> RT300320 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> Array 350 </td><td> W300180 </td><td> Genisphere </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> 28104 </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> 20X SSC </td><td> 82021-4846 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Geschoren zalmsperma DNA </td><td> AM9680 </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> SDS-oplossing </td><td> V6551 </td><td> Promega </td></tr><tr><td> DTT EM </td><td> 3860 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> iScript cDNA synthese kit </td><td> 170-8890 </td><td> BioRad </td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> 170-8880 </td><td> BioRad </td></tr></tbody></table>

het bepalen van genetische expressie profielen in c. elegans met behulp van microarray en real-time pcr

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapsen zijn samengesteld uit een presynaptische actieve zone in de signalering cel en een postsynaptische terminal in de doelcel. In het geval van chemische synapsen, worden berichten gedragen door neurotransmitters vrijgelaten uit presynaptische terminals en ontvangen door postsynaptische receptoren op cellen. Onze vorige onderzoek in Caenorhabditis elegans heeft aangetoond dat VSM-1 negatief exocytose regelt. Bovendien, de analyse van synapsen in de VSM-1 mutanten toonde aan dat dieren die bij gebrek aan een volledig functionele VSM-1 zijn gestegen synaptische connectiviteit. Op basis van deze voorlopige bevindingen hebben we de hypothese dat C. elegans VSM-1 kan spelen een cruciale rol in synaptogenese. Om deze hypothese te testen, werd dubbel-gelabeld microarray analyse uitgevoerd, en gen expressie profielen werden bepaald. De eerste, totaal RNA werd geïsoleerd, omgekeerd getranscribeerd in cDNA, en gehybridiseerd met het DNA microarrays. Dan, in silico-analyse van de fluorescente probe hybridisatie bleek significante inductie van vele genen die coderen voor de leden van de grote sperma eiwitfamilie (MSP) in mutanten met verbeterde synaptogenese. MSP&#39;s zijn de belangrijkste component van het sperma in C. elegans en blijken nematoden eicel rijping en ovulatie signaal. In fruitvliegen, Chai en zijn collega&#39;s toonden aan dat een MSP-achtige moleculen presynaptische Bouton aantal en de grootte te regelen bij de neuromusculaire junctie. Bovendien, de analyse uitgevoerd door Tsuda en collega&#39;s twee gesuggereerd dat MSP&#39;s kunnen optreden als liganden voor Eph receptoren en activeren receptor tyrosine kinase signalering cascades. Ten slotte, real-time PCR-analyse bevestigd dat het gen dat codeert voor het MSP-32 is geïnduceerd in VSM-1 (ok1468) mutanten. Bij elkaar genomen, blijkt uit onderzoek uitgevoerd door ons laboratorium aangetoond dat de VSM-1 mutanten een aanzienlijke stijging van de synaptische densiteit, die kunnen worden gemedieerd door MSP-32 signaalfunctie.

Microarray analyse werd uitgevoerd om genetische expressie profielen bepalen<em&gt; C. elegans</em&gt;, En real-time PCR werd gebruikt om te valideren en te kwantificeren microarray data.

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

Synapsen bestaan uit een presynaptische actieve zone in de signalerende cel en een postsynaptische terminal in de doelcel. In het geval van chemische synapsen, ...

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van genexpressieprofielen die ten grond liggen aan talrijke fenotypes of metabole routes. Dit wordt bereikt door eerst mRNA te isoleren uit twee contrasterende nematode-stammen. De tweede stap van de procedure is het synthetiseren van cDNA dat ofwel S SI drie- of SFI-captursequenties bevat, en deze te hybridiseren met een microarray.De derde stap van de procedure is het hybridiseren van de microarray met anti-capturesequenties die S SI drie en SCIFI fluoro fours bevatten. De laatste stap van de procedure is het scannen van de microarray en het analyseren van de gegevens met bio-informatische tools, zoals de magic tool software. Uiteindelijk worden kandidaatgenen geïdentificeerd die het onderzochte biologische fenomeen bemiddelen, welke gevalideerd en gekwantificeerd kunnen worden met alternatieve technieken zoals real-time PCR.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben omdat de gespotte nucleotiden niet zichtbaar zijn voor de gebruiker, waardoor het moeilijk is om een homogeen hybridisatiemengsel over de ruim 23.000 uniek geprinte nucleotiden te plaatsen. Begin met het verzamelen van RNA uit gezonde gesynchroniseerde nematoden. Eerst worden ze gewassen, resuspendeerd in buisjes van 15 milliliter en gecentrifugeerd; de wormpellets worden vervolgens geresuspendeerd in 7 ml 0,1 M NaCl en 7 ml ijskoude, 60% w/v sucrose.Na een incubatie van 15 minuten op ijs worden de wormen opnieuw gecentrifugeerd tot een pellet. De nu bacterievrije wormen zullen naar boven zwemmen, worden verzameld, gewassen in RNAse-vrij water en opnieuw gecentrifugeerd. Vervolgens wordt de schone, los samengedrukte pellet overgebracht naar een microcentrifugebuisje en 30 seconden op maximale snelheid gecentrifugeerd.Gespireerd en bewaard in 10 volumes RNA later bij vier graden Celsius tot het moment van verwerking. Om totale RNA-monsters voor te bereiden, worden de bereide pellets op maximale snelheid gecentrifugeerd, waarna het supernatant wordt weggegooid en een snufje moleculaire maalgel op de pellet wordt gevoegd. Vries vervolgens het mengsel in met vloeibare stikstof met behulp van een stamper.Maal de bevroren wormsuspensie tot een fijn poeder; voeg indien nodig vloeibare stikstof toe om het poeder na het malen koud te houden. Plaats het extract vijf minuten op ijs. Meng na vijf minuten het extract met in totaal 700 µL R-L-T-B-M-E en 472 µL 100% ethanol.RNA kan nu worden geïsoleerd met behulp van een commercieel verkrijgbare kit tot een eindvolume van 60 µL geïsoleerd RNA per biologisch monster. Verwijder vóór het vervolgen van de procedure potentiële contaminatie met genomisch DNA door behandeling met DNase I, gevolgd door het gebruik van een commercieel verkrijgbare kit voor RNA-zuivering. Voltooi de kitprocedure door aan te vullen tot een volume van 60 µL.Bepaal tot slot de RNA-concentratie en evalueer de integriteit van het RNA door middel van behandeling met glyoxal, monstering van de loading dye en gelanalyse voorafgaand aan de microarray-hybridisatie. Met behulp van conventionele methoden wordt het gezuiverde RNA omgezet in complementair DNA, dat met een commercieel verkrijgbare kit wordt gezuiverd van het afgebroken template en wordt opgevuld tot een volume van 60 µL. Start de microarray-hybridisatie door de microarray-slides te blokkeren met gesoniceerd zalmsperma-DNA. Spoel de geblokkeerde slides na een uur af met dubbel gedestilleerd water en centrifugeer deze.Droog de coupes in conische buizen van 50 milliliter die zijn bekleed met een Kimwipe. Bereid vervolgens een 2x vormamide-gebaseerde hybridisatiebuffer. Warm deze eerst 10 minuten lang op tot 55 °C om de kristallen volledig op te lossen.Centrifugeer het vervolgens gedurende één minuut bij 10.000 gs. Meng daarna 25 µL CD NA met 25 µL hybridisatiebuffer en tik het mengsel voorzichtig aan. Voer nu een korte spin uit van het mengsel en incubeer dit gedurende 10 minuten bij 80 °C.Pipetteer na de incubatie voorzichtig de gehele CDNA-monster op de microarray-dia zonder de dia aan te raken, om het monster gelijkmatig over de microarray-dia te verspreiden. Plaats voorzichtig een dekglas op de dia met behulp van een injectienaald; trek de naald iets terug voordat het dekglas volledig is neergedaald en laat het dekglas vervolgens met de naald opnieuw voorzichtig op zijn plaats vallen.Deze techniek minimaliseert de vorming van luchtbellen. Plaats de objectglas nu horizontaal in een conische buis van 50 milliliter, voeg 50 µL dubbel gedestilleerd water toe onder het objectglas en laat dit een nacht incuberen bij 37 °C. De volgende dag wordt er kort na het wassen van het objectglas een tweede hybridisatie uitgevoerd.Meerdere keren in SSC wordt de tweede buffer, die lichtgevoelige capturereagentia en een Antifa-reagens bevat, aangebracht met dezelfde techniek, gevolgd door een korte incubatie, meer wasstappen en drogen. De slide kan vervolgens worden gescand. Afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd met de gratis software met open source magic tool.Maak kortstondig onder het tabblad project een nieuw project aan en sla dit op onder het tabblad build expression profile, selecteer 'load image pair' en selecteer het rode afbeeldingsbestand als rood en het groene afbeeldingsbestand als groen. Selecteer vervolgens het tabblad build expression profile. Kies 'load gene list' om een genenlijstbestand van C. elegans, verkregen van de GCAT-website, te uploaden om de microarray-afbeelding te adresseren en te rasteren.Selecteer het tabblad 'build expression profile' en de optie 'create edit grid'. Bewerk nu het raster. Stel het dialoogvenster in door 48 in te voeren voor het aantal rasters, 22 rijen en 22 kolommen per raster, en kies ervoor om de posities van links naar rechts en van boven naar beneden te nummeren.Verhoog het contrastpercentage en zoom in op het raster totdat de individuele spots gemakkelijk te onderscheiden zijn. Maak de rasters door in het linkerpaneel de optie voor de spot linksboven te selecteren en vervolgens op het midden van de spot linksboven te klikken, gevolgd door de spot rechtsboven en de onderste rij op raster één. Herhaal deze procedure voor elk van de 48 rasters, waarbij u van links naar rechts en van boven naar beneden werkt.Sla het resultaat vervolgens op door het tabblad 'file' te selecteren en te kiezen voor 'save current grid as' zodra het is opgeslagen. Selecteer het tabblad 'finished' om alle niet-relevante spots uit de analyse te verwijderen. Open het tabblad 'build expression profile' en selecteer onder de optie 'addressing gridding' de optie 'spot flagging'.Markeer nu eventuele strepen of achtergrondfluorescentie en sla dit op door 'save current flags' te selecteren. Ga vervolgens naar het tabblad 'file', waar de gemarkeerde bestanden gesegmenteerd moeten worden. Analyseer tot slot de genen die zijn geïnduceerd of onderdrukt door een specifieke factor door onder het tabblad 'expression' op 'explore' te klikken.Stel in het dialoogvenster 'Exploring' de criteria in voor het matchen van specifieke genen. Het aantal tweevoudige toenames of afnames in expressie. De intensiteit wordt aangeduid als x en de waarde van X vormt het criterium voor de verandering in expressie.X wordt ingevoerd als maximale waarde groter dan X voor geïnduceerde genen en minimale waarde kleiner dan x voor gerepresseerde genen. In dit experiment wordt een dye swap-controle uitgevoerd; de twee onafhankelijke isolaties van totaal RNA uit larven van stadium drie en stadium vier worden gehybridiseerd als groen mutant versus rood wild type, terwijl rood mutant versus groen wild type wordt gebruikt om veranderingen in genexpressie te bevestigen. Voer drie onafhankelijke isolaties van totaal RNA uit met dezelfde procedure, synthetiseer cDNA met een commercieel verkrijgbare kit, en voer voor elk cDNA-monster real-time PCR uit in triplikaat met drie housekeeping-genen als controles. Ter demonstratie worden de volgende resultaten van genexpressie onderzocht die zijn geïnduceerd in VSM one.AK 1468-mutanten zijn een nematodenstam die wordt gekenmerkt door verhoogde synaptische activiteit. Voorafgaand aan de microarray-analyse wordt de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA gecontroleerd met gelelektroforese. De aanwezigheid van twee intacte ribosomale subunits voor en na de DNase I-behandeling is indicatief voor een goed RNA-monster. In de microarray wordt wild-type cDNA rood gelabeld en VSM-1-mutant cDNA groen gelabeld. In één van de 48 grids die per microarray worden geanalyseerd, stelt elk klein vierkantje een enkel geprint oligonucleotide voor; in elke array is elk uniek oligonucleotide vertegenwoordigd.Nadat microarray-analyse van transcripten geïsoleerd uit stadium vier larven aantoont dat genen die coderen voor de belangrijkste spermaproteïnen (major sperm proteins) of MSP geïnduceerd zijn in VSM one-mutanten, onthult microarray-analyse van stadium drie larven eveneens expressieveranderingen binnen dezelfde genfamilie in de mutant. De voorspellingen uit de microarray, getoetst via real-time PCR-analyse, laten zien dat één lid van de MSP-genfamilie, MSP 32, geïnduceerd is in de VSM one-mutanten. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie replica's van real-time PCR uit dezelfde RNA-collectie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het gebruik van bioinformatische tools voor genoombrede analyse, zeker gezien de vele open-source bioinformatica-softwareprogramma's die beschikbaar zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap.

determining-genetic-expression-profiles-c-elegans-using-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. In dit rapport tonen we het gebruik van de qRT-PCR na te gaan mRNA niveaus in de verschillende weefsels en larvale ontwikkelingsstadia van de invasieve soorten insecten, smaragd as boor.

Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

We beschrijven een protocol met behulp...

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans</em

Deze video beschrijft een techniek om een enkel nematode snel te screenen op een genetische marker door PCR-screening. In het voorbeeldprotocol screenen we op CRISPR-gebaseerde genoombewerking.

Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken

Dit protocol beschrijft een snelle en materiaalbesparende procedure voor de integratie van transgene extrachromosomale arrays in het Caenorhabditis elegans genoom met behulp van ultraviolette (UV) bestraling. Bovendien is dit protocol bijzonder geschikt voor transgene lijnen die extrachromosomale arrays met een hoge snelheid overdragen.

Een snelle protocol voor de integratie Extrachromosomaal Arrays Met High Transmission Rate in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Genome

Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

In dit artikel wordt een protocol met hoge doorvoer beschreven voor een snelle en betrouwbare bepaling van de genexpressieniveaus in enkele of bulk C. elegansmonsters. Dit protocol vereist geen RNA-isolatie en produceert cDNA rechtstreeks uit monsters. Het kan worden gebruikt samen met high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie

Dit protocol beschrijft een RNA-interferentie en ChIP-test om de epigenetische overerving van RNAi-geïnduceerde uitschakeling en geassocieerde chromatinemodificaties in C. elegans te bestuderen.

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Dit protocol biedt een methode voor het meten van crossover-frequenties en -verdeling tijdens meiose in Caenorhabditis elegans. Genotypering van single-nucleotide polymorfisme met real-time PCR werd gebruikt om de oorsprong van de chromosomen te bepalen. De 4-punts mapping maakte het mogelijk om de crossover-verdelingen van de linkerarm-, midden- en rechterarmregio's van elk chromosoom te bepalen. ...

Frequentie en distributie van cross-overs in Caenorhabditis elegans Meiose door SNP-genotypering met behulp van real-time PCR

Verken genexpressieprofielen in C. elegans met microarray-analyse en real-time PCR-validatie. Deze methode identificeert kandidaatgenen en biedt inzicht in genetische mechanismen bij nematoden.

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

Meer video's verkennen