Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR
July 30th, 2011
Microarray analyse werd uitgevoerd om genetische expressie profielen bepalen C. elegans, En real-time PCR werd gebruikt om te valideren en te kwantificeren microarray data.
Het algemene doel van deze procedure is om genexpressieprofielen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan talrijke fenotypes of metabolische routes. Dit wordt bereikt door eerst mRNA te isoleren van twee contrasterende nematodensoorten. De tweede stap van de procedure is om CD NA te synthetiseren met S SI drie of SFI capture sequenties en deze te hybridiseren met een microarray.
De derde stap van de procedure is om de microarray te hybridiseren met anti-capture sequenties die S SI drie en SCIFI fluoro viers bevatten. De laatste stap van de procedure is om de microarray te scannen en gegevens te analyseren met behulp van bioinformaticatools zoals de magic tool software. Uiteindelijk worden kandidaatgenen die het biologische fenomeen onder onderzoek bemiddelen geïdentificeerd en kunnen worden gevalideerd en gekwantificeerd door alternatieve technieken zoals real-time PCR.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode worstelen omdat de gespoten nucleotiden niet zichtbaar zijn voor de gebruiker, dus het is moeilijk om een homogeen hybridisatiemengsel op de 23.000 plus te overlayen. Uniek bedrukte nucleotiden Begin met het verzamelen van RNA van gezonde gesynchroniseerde nematoden. Eerst worden ze gewassen, opgehangen in 15 milliliter buisjes en gepelleteerd wormpellets worden opgehangen in zeven milliliter 0,1 molair natriumchloride en zeven milliliter ijskoud, 60% gewicht per volume sucrose.
Na een incubatie van 15 minuten op ijs worden de wormen opnieuw gepelleteerd. Nu zullen bacterievrije wormen omhoog zwemmen, worden verzameld, gewassen in RNAs, vrij water en gepelleteerd. Opnieuw wordt het schone, losjes gecompacteerde pellet overgebracht naar een microcentrifugebuisje dat 30 seconden op maximale snelheid wordt rondgedraaid.
Aspireer en bewaar in 10 volumes RNA later bij vier graden Celsius totdat u klaar bent om verder te gaan. Om totale RNA-monsters voor te bereiden, centrifugeert u de voorbereide pellets op maximale snelheid, gooit u de supernatant weg en voegt u een snuifje moleculair maalresin toe aan de pellet. Bevriest vervolgens de mix met vloeibaar stikstof met behulp van een stamper.
Maal de bevroren worm suspensie tot een fijn poeder en vloeibaar stikstof zoals nodig is om het poeder na het malen koud te houden. Zet het extract vijf minuten op ijs. Na vijf minuten, meng het extract met 700 microliter R-L-T-B-M-E en 472 microliter 100% ethanol totaal.
RNA kan nu worden geïsoleerd met behulp van een commercieel verkrijgbaar kit tot een eindvolume van 60 microliter geïsoleerd RNA per biologisch monster. Voordat u verdergaat, verwijdert u mogelijke genomische DNA-besmetting door te behandelen met DNAS een, gevolgd door het gebruik van een commercieel verkrijgbaar RNA-opruimingskit. Voltooi de kit door te verwijzen naar een 60 microliter volume.
Bepaal ten slotte de RNA-concentratie en evalueer de integriteit van het RNA door behandeling met glyoxal monsterbelasting, kleurstof en gelanalyse voorafgaand aan microarray-hybridisatie. Met conventionele methoden wordt gezuiverd RNA omgekeerd getranscribeerd in complementair DNA, dat gezuiverd is van de gedegradeerde template met een commercieel verkrijgbaar kit en verwezen naar een volume van 60 microliter. Begin de microarray-hybridisatie door zeeelegantie te blokkeren. Microarray-dia's met gesoniceerde zalmzaad DNA. Na een uur tip de geblokkeerde dia's in dubbel gedistilleerd water en draai.
Droog de dia's in 50 milliliter kegelbuisjes gevoed door een kimdoekje. Bereid nu een twee x formamide-gebaseerde hybridisatiebuffer voor. Verwarm het eerst 10 minuten tot 55 graden Celsius om de kristallen volledig op te lossen.
Centrifugeer het vervolgens gedurende één minuut bij 10.000 gs. Meng vervolgens 25 microliter CD NA met 25 microliter hybridisatiebuffer en schud het mengsel voorzichtig. Voer nu een snelle spin van het mengsel uit en incubeer het gedurende 10 minuten bij 80 graden Celsius.
Na de incubatie pipetteer voorzichtig het gehele CDNA-monster op de microarray-dia zonder de dia aan te raken. Om het monster gelijkmatig op de microarray-dia te verspreiden. Laat een dekglas voorzichtig op de dia zakken met behulp van een spuitnaald voordat het dekglas volledig is neergelaten, trek het terug omhoog en laat het weer zakken met de naald zodat het dekglas zachtjes op zijn plaats valt.
Deze techniek minimaliseert de vorming van luchtbellen. Plaats nu de dia horizontaal in een 50 milliliter kegelbuisje onder de dia bij 50 microliter dubbel gedistilleerd water en laat het een nacht incuberen bij 37 graden Celsius de volgende dag. Er wordt een tweede hybridisatie uitgevoerd kort nadat de dia is gewassen.
Meerdere keren in SSC, het tweede buffer, dat lichtgevoelige opname reagentia en een Antifa reagent bevat, wordt toegepast met behulp van dezelfde techniek gevolgd door een korte incubatie, meer wasbeurten en drogen. De dia kan vervolgens worden gescand. Afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd met behulp van de gratis software met open source magic tool.
Maak onder het projecttabblad een nieuw project en sla het op onder het tabblad expressieprofiel bouwen, selecteer laad afbeeldingspaar en selecteer het rode afbeeldingsbestand als rood en het groene afbeeldingsbestand als groen. Selecteer vervolgens het tabblad expressieprofiel bouwen. Kies genenlijst laden om een C elegance genlijstbestand te uploaden dat is verkregen van de GCAT-website om de microarray-afbeelding aan te pakken en in te roosteren.
Selecteer het tabblad expressieprofiel bouwen en maak de optie raster bewerken. Bewerk nu het raster. Stel het dialoogvenster in met 48 voor het aantal rasters, 22 rijen en 22 kolommen voor elk raster en kies ervoor om de spots van links naar rechts en van boven naar beneden te nummeren.
Verhoog de procentuele contrastverandering en zoom in op het raster tot de individuele spots gemakkelijk te onderscheiden zijn. Maak de rasters door het selecteren van de bovenste linker spot op het linkerpaneel en vervolgens het centrum van de bovenste linker spot te klikken, gevolgd door de bovenste rechter spot en de onderste rij op raster één. Herhaal deze rasterprocedure voor elk van de 48 rasters die van links naar rechts en van boven naar beneden gaan.
Bewaar vervol
Overzicht
Deze studie onderzoekt genexpressieprofielen in C. elegans met behulp van microarray-analyse en real-time PCR voor validatie. De methodologie omvat het isoleren van mRNA uit verschillende nematodenstammen om onderliggende biologische fenomenen te begrijpen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genetica
- Microarray-technologie
Achtergrond
- C. elegans dient als modelorganisme voor het bestuderen van genexpressie.
- Microarray-analyse maakt het mogelijk om duizenden genen tegelijkertijd te onderzoeken.
- Real-time PCR wordt gebruikt om microarray-bevindingen te bevestigen.
- Het begrijpen van genexpressie kan metabolische paden en fenotypen verduidelijken.
Doel van het onderzoek
- Om kandidaatgenen te identificeren die betrokken zijn bij specifieke biologische processen.
- Om microarray-gegevens te valideren door middel van real-time PCR.
- Om het begrip van genetische expressie in nematoden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van mRNA uit contrasterende nematodenstammen.
- Synthese van cDNA en hybridisatie op microarrays.
- Gebruik van bioinformatica-tools voor gegevensanalyse.
- Validatie van resultaten door middel van real-time PCR.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van kandidaatgenen die biologische fenomenen mediëren.
- Succesvolle validatie van microarray-gegevens met real-time PCR.
- Inzichten in genexpressieprofielen tussen verschillende stammen.
- Gebruik van bioinformatica-tools voor uitgebreide gegevensanalyse.
Conclusies
- De studie biedt een raamwerk voor het analyseren van genexpressie in C. elegans.
- Real-time PCR dient als een effectieve validatiemethode voor microarray-resultaten.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van genetische mechanismen in nematoden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to profile gene expression changes in model organisms, supporting target validation by identifying differentially expressed genes linked to phenotypic outcomes. By combining microarray screening with real-time PCR confirmation, it provides a scalable approach for mechanistic de-risking in early discovery, helping prioritize targets with stronger predictive confidence before lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing gene expression shifts associated with enhanced synaptic connectivity in mutant models.
- Operational Value: Enables pathway clarification through systematic screening of thousands of genes to pinpoint candidates like MSP-32 for further functional study.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming gene induction via orthogonal real-time PCR validation.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility through dye-swap controls and triplicate measurements, reducing false positives in target identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by linking synaptic phenotypes to MSP signaling pathways, which have conserved roles in neuromuscular junction regulation across species.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker exploration by identifying secreted signaling molecules like MSPs that may serve as measurable indicators of pathway activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to lead identification, where expression profiling informs target selection and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by connecting genetic perturbations to molecular phenotypes through expression profiling.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via microarray intensity measurements and real-time PCR quantification, enabling condition comparisons.
- Analytics: Highlights bioinformatic-driven readouts such as fold-change thresholds and statistical significance, aiding in hit selection and prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying evolutionarily conserved signaling families (e.g., MSP/Eph) with relevance to human synaptic biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling genetic responses across diverse phenotypes, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by validating microarray hits with real-time PCR, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through standardized RNA isolation, labeling, and hybridization protocols applicable across strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-modal evidence (transcriptomic + qPCR) for target prioritization, lowering late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by distinguishing robust expression changes from noise, supporting data-driven resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA handling, and microarray hybridization techniques to ensure sample integrity and data quality.
- Dependent on access to microarray scanners, bioinformatic software (e.g., Magic Tool), and real-time PCR instrumentation for end-to-end execution.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for RNA isolation, labeling, and data analysis to ensure reproducibility across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems or tissue types due to variability in RNA yield and hybridization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for technical skill in grid alignment and spot flagging during microarray analysis, which can affect data accuracy if not performed correctly.
