Name: Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T09:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Leer een niet-invasieve haarverzamelmethode voor populatiegenetisch onderzoek aan de Amerikaanse pika. Deze techniek minimaliseert verstoring en levert hoogwaardig DNA voor moleculaire analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag L. Evans, B. Granger, D. Riesling, Z. Sim, A. Goodwin, K. en D. Hayhurst Kuch bedanken voor hulp in het veld. K. Galbreath vriendelijk pika lever monsters die door het Bella Coola vallei. Met dank aan A. Gonçalves da Silva en K. Larsen voor interessante discussies die hebben bijgedragen aan het ontwerp van deze niet-invasieve genetische steekproefmethode. Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada Discovery, en UBC Okanagan Individual Research beurzen aan maart Een Zwitserse National Science Foundation Doctoral Fellowship PBSKP3_128523 ondersteund PH. Deze studie werd uitgevoerd naar aanleiding van de dierverzorging protocol van de Universiteit van British Columbia (certificaat nummer: A07-0126).

1. Haar snare Voorafgaand aan het opzetten van een snare, een ideale locatie moet worden bepaald binnen de pika habitat of talus helling. Dit geldt ook voor hooi palen, die zijn vegetatie caches dat de dieren te verzamelen in de nazomer evenals verse scats gevonden op latrine sites. Stroken tape (10-50cm in de lengte) worden opgerold om een ​​360 ° plakkerig oppervlak te verkrijgen en zijn gerangschikt in een web-achtige wijze envelop de ingang van hooi van de pika's paal (fig. 1) of latrine site. Afhankelijk van de configuratie van de rotsen, kan een stuk vislijn worden gebruikt om de structuur van het haar snare te ondersteunen, maar dit is vaak niet nodig als ingangen zijn vrij klein (&lt;30 cm in diameter), een volledige beschrijving van het gebruik van vislijn kan worden gevonden in Henry en Russello (2010) 3. Haar strikken worden zo vaak gecontroleerd als mogelijk, en haar monsters afgezet op de tape (fig. 2) worden vervolgens verzameld en gelabeld. Eenmaal terug naar het lab vervoerd, zijn haren uit het plakband met steriele pincet en overgebracht naar cryogene buizen en opgeslagen bij -20 ° C tot manipulatie. Haarmonsters samen gebundeld worden op een haar strik worden beschouwd als te behoren tot een enkel individu, terwijl de monsters onafhankelijk van elkaar geclusterd worden verondersteld te behoren tot verschillende individuen. In het laatste geval is het haar vervolgens in verschillende buizen. Deze veronderstellingen kunnen later worden getest door middel van DNA-vingerafdrukken en berekeningen van de waarschijnlijkheid van identiteit op basis van microsatelliet genotypische gegevens. 2. DNA-extractie Omdat pika haar is erg dun en bevat een kleine wortel gloeilamp, hebben we eerder aangetoond dat een minimum van 25 haren nodig zijn om voldoende hoeveelheden DNA te verkrijgen voor een goede kwaliteit downstream PCR-amplificatie 3. We gebruikten het DNA-IQ systeem (Promega, Madison, WI, USA) en een iets aangepaste versie van de instructies van de fabrikant voor DNA-isolatie uit haar monsters. Ten eerste is het haar monster afgedraaid in een micro-centrifuge om het verlies van haar te voorkomen, terwijl het openen van de buis. Dan is de incubatie-oplossing wordt bereid door het mengen van 80 ul van incubatie-oplossing met 10μl van DTT (1M) en 10μl van proteïnase K (18ng/ml) te resulteren in een uiteindelijke concentratie van 0,1 M DTT en 1.8ng/ml van proteïnase K. Incubation oplossing (100 ul) wordt toegevoegd aan het monster en geïncubeerd bij 56 ° C gedurende 1 uur. In de tussentijd is de lysis oplossing bereid door toevoeging van 1 pi van DTT (1M) voor elke 100 ul van lysis buffer, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 0,01 M DTT. Bereid lysis oplossing (200 ul) wordt vervolgens toegevoegd aan het monster, samen met zeven pi DNA IQ hars, gevortext gedurende 3 seconden op hoge snelheid en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Het monster wordt vervolgens gevortext 2 seconden en ingevoegd in de magnetische stand, waar de scheiding van magnetische beads uit de oplossing komt. De resterende oplossing wordt vervolgens afgezogen en weggegooid, dat evenwel niet tot de pellet van magnetische hars verstoren. Het monster wordt vervolgens behandeld met 100 ul van de bereide lysis oplossing, gevortext en keerde terug naar de magnetische staan ​​waar scheiding zich opnieuw voordoet. De lysis buffer is opgezogen en verwijderd, en deze stap wordt drie keer herhaald met behulp van een wasbuffer (100 pl). Het monster wordt vervolgens te drogen in de magnetische 15 minuten staan. Eenmaal droog is, wordt 100 ul elutiebuffer toegevoegd aan het monster en geïncubeerd bij 65 ° C gedurende 5 minuten. Het monster wordt gevortexed en ingevoegd in de magnetische stand. De oplossing nu met het geëlueerde DNA wordt vervolgens overgebracht naar een 1,5 ml Eppendorf buis en opgeslagen bij -20 ° C tot verdere manipulaties. DNA van de lever monsters werd ook geëxtraheerd met behulp van de DNA-IQ systeem en gebruikt als een positieve controle voor PCR amplificaties. 3. PCR-amplificatie De DNA verkregen uit onze niet-invasieve haren snare en lever monsters werden vervolgens gebruikt om een ​​reeks van veel gebruikte moleculaire merkers (microsatelliet, AFLP, mitochondriale cytochroom B en ZFX / ZFY geslachtsbepaling marker) te versterken. PCR's werden uitgevoerd met behulp van een Veriti thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in een 25 ul volume met: 10 - 20 ng DNA, 0,5 uM van elke primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 uM dNTPs, 10 μ bovine serum albumine (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) en 0,5 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems). Fietsen parameters voor de microsatelliet loci werden geoptimaliseerd met behulp van een touchdown fietsen programma (10 min bij 95 ° C, 35 cycli bij 95 ° C gedurende 30 s, 30 s gloeien, en 45 s bij 72 ° C, gevolgd door een laatste stap bij 72 ° C gedurende 10 min). De annealing temperatuur daalde met 1 ° C per cyclus 60 tot 55 ° C tot het bereiken van de zesde cyclus, op welk punt de 29 resterende cycli voortgezet bij 55 ° C. Fietsen parameters voor de mitochondriale fragmenten werden zoals hierboven beschreven, maar bestond uit 35 cycli met een gloeientemperatuur van 50 ° C. Amplified Fragment Length Polymorphism werd uitgevoerd volgens het protocol voor de gewervelde genomen beschreven door Bonin 4. Ten slotte werd de moleculaire geslachtsbepaling uitgevoerd met behulp van de PCR-RFLP van ZFX / ZFY loci met HinfI restrictie-enzym digestie 5. De PCR-producten uit de microsatelliet, AFLPs en cytochroom B sequenties werden uitgevoerd op een ABI 3130XL genetische analyzer (Applied Biosystems), terwijl verteerd ZFX / ZFX fragmenten werden uitgevoerd naast een 100 bp ladder (New England Biolabs) op een 3% agarose gel met 2,5% SYBR Safe DNA gel vlek (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en gevisualiseerd met behulp van een RODE persoonlijke gel imaging-systeem (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Microsatelliet en AFLPs werden gevisualiseerd met behulp van Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) en het mitochondriale DNA chromatogram werd gevisualiseerd met behulp van Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation, Ann Harbour, MI, USA). 4. Representatieve resultaten Het DNA uit haar monsters verkregen met behulp van onze niet-invasieve snare werden gebruikt om PCR versterken de verschillende type van moleculaire merkers. Als basis voor vergelijking, DNA geëxtraheerd met behulp van de lever monsters werd versterkt samen met ons haar monsters. Nucleaire microsatelliet loci werden met succes versterkt voor zowel haar en lever monsters (afb. 3). Hoewel de intensiteit van het signaal was groter bij gebruik van de lever monsters, heeft dit geen negatief effect op genotype scoren (afb. 3). Vergelijkbare resultaten werden bereikt bij het gebruik van AFLPs (afb. 4), mitochondriale DNA-sequenties (Fig. 5), en de ZFX / ZFY moleculaire marker geslachtsbepaling (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een voorbeeld van een niet-invasieve haar valstrik opgezet op een stapel hooi. Stroken van opgerolde duidelijk verpakkingstape zijn gerangschikt in een web-achtige manier naar de ingang van het hooi stapel omsluiten. Een stuk van de visserij lijn wordt hier gebruikt om extra steun voor het haar snare te bieden. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Een succesvol haar snare met een groot aantal van haar vast aan de tape te verwijderen. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Een vertegenwoordiger nucleaire microsatelliet chromatogram (Ocp6) 8 in zoals getoond in Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). De top chromatogram werd verkregen door het amplificeren van DNA van leverweefsel, en is heterozygoot (354/358) op dit locus. De onderste chromatogram staat voor een andere persoon vertoont een heterozygoot genotype (358/362) op basis van DNA uit haar. Terwijl het signaal van chromatogram van het haar monster heeft een lagere intensiteit dan de lever monster wordt genotype scoren niet nadelig beïnvloed door dit verschil in signaal. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Een vertegenwoordiger AFLP chromatogram (E31T32) zoals weergegeven in Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). De top chromatogram werd verkregen door het amplificeren van DNA van leverweefsel, de onderste chromatogram staat voor de DNA geëxtraheerd uit haar. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Een vertegenwoordiger mitochondriaal DNA-sequentie chromatogram (cytochroom B) zoals weergegeven in Sequencher v4.7 (Gene Code Corporation). De top chromatogram werd verkregen door het amplificeren van DNA van leverweefsel, de onderste chromatogram staat voor de DNA geëxtraheerd uit haar. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Een vertegenwoordiger moleculaire marker geslachtsbepaling (ZFX / ZFY) versterkt voor zowel de lever en haar monsters. Deze aanpak is gebaseerd op de waarneming dat het Y-chromosoom een ​​HinfI restrictieplaats in deze regio dat het X-chromosoom mist bezit. Dus, vrouwen produceren twee co-migratie van fragmenten van 432 bp, terwijl mannetjes produceren van fragmenten van 432 bp, 261 bp en 171 bp.

<ol><li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildlife+Manage%22%5BJournal%5D)">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li>
<li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size%2C+natal+philopatry%2C+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+%28Aquila+heliaca%29+in+central+Asia%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Genet%22%5BJournal%5D)">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li>
<li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li>
<li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Wildlife+Res%22%5BJournal%5D)">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li>
<li>Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+amplified+fragment+length+polymorphism+%28AFLP%29+markers+in+surveys+of+vertebrate+diversity.+Method+Enzymol+395%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395.</a> , 145-145 (2005).</li>
<li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexing+European+rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus%29%2C+European+brown+hares+%28Lepus+europaeus%29+and+mountain+hares+%28Lepus+timidus%29+with+ZFX+and+ZFY+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Wildl.+Res%22%5BJournal%5D)">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li>
<li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demographic+monitoring+of+an+entire+species+%28the+northern+hairy-nosed+wombat%2C+Lasiorhinus+krefftii%29+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li>
<li>Litvaitis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+range-wide+survey+to+determine+the+current+distribution+of+New+England+cottontails%5BTitle%5D)+AND+%22Wildlife+Soc+B%22%5BJournal%5D)">A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails.</a> Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).</li>
<li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika%2C+Ochotona+princeps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Notes%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li>
</ol>

Niet-invasieve genetische sampling is uitgegroeid tot een aantrekkelijk alternatief voor de traditionele leven de vangmethoden om verschillende redenen. Ten eerste door onopvallend te verzamelen biologisch materiaal (bv, uitwerpselen, haren, veren, speeksel en slijm) van wilde populaties, kunnen onderzoekers bestuderen deze soorten zonder storende, behandeling, of zelfs ze te observeren, waardoor de risico&#39;s voor zowel de dieren als onderzoekers. Ten tweede, niet-invasieve genetische monsters in staat stelt biologen bestuderen populaties van ongrijpbaar en zeldzame soorten, een taak die kan moeilijk blijken met meer traditionele live-trapping benaderingen 6. En ten derde, kan NGS potentie verhogen steekproeven door het verminderen van verstoring van dieren, bemonstering inspanningen en kosten, hetgeen zal bijdragen tot een minimum te beperken vertekening in de schattingen van de populatie-parameters 7. Dit laatste punt kan van doorslaggevend belang zijn bij de behandeling van bedreigde soorten, omdat bevooroordeelde schattingen van de bevolking van de parameters kan leiden tot onjuist beheer. In de huidige video-artikel beschrijven we een eenvoudige, nieuwe, goedkope en niet-invasieve methode om ongrijpbare kleine zoogdieren monster, met behulp van de Amerikaanse Pika als een voorbeeld. We laten zien dat DNA geëxtraheerd uit haar presteert vergelijkbaar met DNA uit de lever monsters met betrekking tot de microsatelliet, AFLP, mitochondriale en geslachtsbepaling markers, waardoor deze niet-invasieve methode van monsterneming een aantrekkelijk alternatief voor vangen of dodelijke monsters wonen. Over het algemeen verwachten we dat deze methode nuttig zal zijn bij de gegevensverzameling stadium van de bevolking van genetische en gedragsstudies van zeldzame of ongrijpbare kleine zoogdieren, terwijl het minimaliseren van invloed op de organismen onder studie.

Haar snare: <ul><li> Rollen van duidelijke tape (3M, St. Paul, MN, USA) </li><li> Vislijn (10 pond) </li><li> Cryogene buis (2 ml) </li><li> Steriele pincet </li><li> Vloeibare stikstof Dewar (optioneel) </li></ul> DNA-extractie: <ul><li> DNA-IQ systeem (Cat. # DC6701, Promega) met het weefsel en haar extractie kit (Cat. # DC6740, Promega). </li><li> MagneSphere Technology Magnetic Separation Stand (Cat. # Z5342; Promega) </li><li> Micro-centrifuge </li><li> Hybridisatie oven of waterbad </li><li> 1,5 ml Eppendorf buizen </li></ul>

een niet-invasieve hair samplingtechniek om high quality dna verkrijgen van elusive kleine zoogdieren

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Niet-invasieve genetische steekproef benaderingen worden steeds belangrijker om het wild populaties te bestuderen. Een aantal studies hebben gemeld met behulp van niet-invasieve technieken om steekproeven populatiegenetica en demografie van wilde populaties een te onderzoeken. Deze aanpak heeft bewezen vooral nuttig bij de behandeling van zeldzame of ongrijpbare soort 2. Terwijl een aantal van deze methoden zijn ontwikkeld om te proeven haren, uitwerpselen en ander biologisch materiaal van carnivoren en middelgrote zoogdieren, zijn ze grotendeels gebleven getest in ongrijpbaar kleine zoogdieren. In deze video, presenteren wij een nieuwe, goedkope en niet-invasieve haar snare gericht op een ongrijpbare kleine zoogdieren, de Amerikaanse pika (Ochotona princeps). Beschrijven we de algemene set-up van het haar snare, die bestaat uit stroken van tape gerangschikt in een web-achtige mode en geplaatst langs reizen routes in de Pikas &#39;habitat. Illustreren we de efficiëntie van de snare op het verzamelen van een grote hoeveelheid haar die vervolgens kan worden opgehaald en teruggebracht naar het lab. Vervolgens hebben we laten zien van het gebruik van de DNA-IQ systeem (Promega) om DNA te isoleren en showcase het nut van deze methode om de meest gebruikte moleculaire merkers met inbegrip van nucleaire microsatellieten, geamplificeerde fragment lengte polymorfismen (AFLPs), mitochondriale sequenties (800bp) en vergroten een moleculaire marker geslachtsbepaling. Over het algemeen tonen we het nut van deze roman niet-invasieve haar strik als een sampling techniek voor wildstand biologen. We verwachten dat deze aanpak zal van toepassing zijn op een verscheidenheid aan kleine zoogdieren, de opening van gebieden van onderzoek binnen natuurlijke populaties, terwijl het minimaliseren van invloed te studeren organismen.

Wij presenteren een niet-invasieve sampling aanpak voor een efficiënte haarmonsters te verzamelen van ongrijpbare kleine zoogdieren, zoals te zien voor de Amerikaanse pika. Tonen we het nut van deze methode door extractie DNA van bemonsterd haar en versterken van verschillende soorten van moleculaire merkers vaak gebruikt in studies van wilde dieren ecologie en natuurbehoud.

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Niet-invasieve genetische bemonsteringsmethoden worden steeds belangrijker voor het bestuderen van populaties wilde dieren. In een aantal studies is melding gemaakt van het gebruik van ...

Populatiegenetici van wilde dieren maken steeds vaker gebruik van niet-invasieve bemonsteringsmethoden om gegevens te verzamelen van de soorten waarin zij geïnteresseerd zijn. Dergelijke benaderingen zijn nuttig gebleken bij het onderzoeken van vragen over diergedrag, populatie, demografie en genetica, vooral bij zeldzame en schuwe dieren; door biologisch materiaal zoals haar op afstand te verzamelen, kunnen onderzoekers dieren bestuderen zonder hun doelsoort te storen, te schaden of zelfs maar waar te nemen. Hoewel deze technieken voornamelijk zijn toegepast op middelgrote tot grote carnivoren, zoals grizzlyberen, is er minder aandacht besteed aan kleinere herbivore zoogdieren om dit gat te overbruggen.Er worden nieuwe, innovatieve benaderingen ontwikkeld voor het bemonsteren van kleine zoogdieren. Dit video-artikel beschrijft een nieuwe en innovatieve manier om onopvallend haarmonsters te verkrijgen van kleine lagomorfen genaamd Amerikaanse pika's. Deze kleine zoogdieren komen voor in de bergketens van Noord-Amerika, van New Mexico en Californië tot centraal Brits-Columbia.Ze bewonen rotsachtige hellingen, genaamd Tala Slopes, die beschutting bieden tegen predatie en bescherming bieden tegen extreme omgevingsfactoren. Ze worden gewoonlijk aangetroffen op hoogtes boven de 2 500 meter boven zeeniveau in het zuidelijke deel van hun verspreidingsgebied, maar kunnen ook op zeeniveau worden gevonden in het uiterste noorden van hun verspreiding. Pika's hiberneren niet.Ze zijn gedurende de dag actief in de zomer, maar concentreren hun activiteit in de ochtend en avond. Wanneer de temperaturen lager zijn, trekken ze naar de weiden naast de Tali-helling om te foerageren op de omliggende vegetatie. Een bijzonder kenmerk van de PIKA is dat hij zijn voedsel niet simpelweg in de open lucht eet.Het brengt het terug naar zijn territorium in de Tallis en slaat het op in hooihopen. Hoewel de soort gemakkelijk te detecteren is, is hij van nature schuw en zal hij vaak de levendenvallen vermijden die door onderzoekers zijn uitgezet. Bovendien is gebleken dat pika's gevoelig zijn voor hantering, wat kan leiden tot de dood van het dier bij het bestuderen van een reeks ecologische, gedragsmatige en evolutionaire vragen.Om deze ongrijpbare kleine zoogdieren te bestuderen en tegelijkertijd de impact te minimaliseren, heeft PhD-kandidaat Philippe Henry van de Okanagan campus van de University of British Columbia een niet-invasieve bemonsteringstechniek ontwikkeld die goed is afgestemd op de soort. Voordat hij een val zet, zoekt hij naar bewijzen van actieve PIKA-territoria op de Tallis-helling. Dit omvat hooihopen, vegetatievoorraden die het dier in de late zomer verzamelt om de winter te overleven, en verse uitwerpselen.Deze worden gewoonlijk gevonden op specifieke holenlocaties. Zodra een potentiële piek van het habitat binnen de tlu is geïdentificeerd, wordt er strategisch een harenval bij de ingang geplaatst. Met een rol verpakkingsband rolt Philippe vakkundig stroken tape en arrangeert deze in een webvormig patroon om de opening te omsluiten.De ingang van de schuilplaatsvallen is vervaardigd in ingewikkelde ontwerpen die een opening bieden die niet te groot of te klein is voor het dier om doorheen te passen. Hypothetisch gezien zal een pika vervolgens door de strik gaan, waarbij een monster van zijn haar wordt achtergelaten terwijl hij ongestoord zijn dagelijkse bezigheden voortzet. Het haar zelf is zeer dun met een klein wortelbolletje.Om een representatief monster voor analyse te verkrijgen, is een minimum van 25 haren van hetzelfde individu gewenst. De impactlocaties moeten bovendien duidelijk verspreid over de tape liggen. Haren die onafhankelijk van elkaar geclusterd zijn, worden beschouwd als afkomstig van afzonderlijke individuen.Hoewel wordt aangenomen dat die welke bij elkaar gegroepeerd zijn identiek zijn, kan het verzamelde haar vervolgens voorzichtig met steriele pincetten van de tape worden verwijderd zonder de structuur van het monster te verstoren, in het bijzonder de haarbol die de hoogste concentratie nucleair DNA bevat. Vervolgens wordt het haar voorzichtig in een cryogene buis van twee milliliter geplaatst en bewaard in een vloeibare stikstofcontainer totdat het monster een laboratorium bereikt voor verdere analyse. Eenmaal in het laboratorium wordt het haarmonster gecentrifugeerd in een microcentrifuge om verlies van haar bij het openen van de buis te voorkomen. DNA wordt uit de haarmonsters geëxtraheerd met behulp van het Promega DNA IQ-systeem; de eerste stap omvat het bereiden van de oplossing bestaande uit 100 µL incubatiebuffer, 1,8 mg/mL proteinase K en 0,1 M DTT.Vervolgens worden 100 µL van de incubatieloplossing aan het haar toegevoegd en wordt dit gedurende één uur geïncubeerd bij 56 °C. Het monster wordt daarna verwerkt met 200 µL lysisbuffer bevattende 0,01 M DTT en zeven µL geresuspendeerde DNA IQ-resin. Het monster wordt vervolgens drie seconden op hoge snelheid gevortext en vijf tot 10 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur.Het gedigereerde monster wordt vervolgens twee seconden op hoge snelheid gevortext en in een magnetische scheidingsstatief geplaatst. Op dit punt wordt de magnetische hars die de DNA-fragmenten bevat onmiddellijk van de oplossing gescheiden en vormt deze een pellet op de bodem van de buis. De resterende oplossing wordt vervolgens verwijderd en weggegooid.Vervolgens wordt het monster opnieuw behandeld met 100 µL lysisbuffer, gevortexd en teruggeplaatst op het magnetische rek waar de scheiding plaatsvindt. Deze stap wordt vervolgens nog drie keer herhaald met gebruik van een wasbuffer. Na de laatste wasbeurt wordt het monster 15 minuten ter droging in het magnetische rek gelaten.Vervolgens worden 100 µL elutiebuffer aan het monster toegevoegd en wordt dit vijf minuten geïncubeerd bij 65 °C. Ten slotte wordt het monster twee seconden gevortext en in het magnetische rek geplaatst. De DNA-oplossing wordt daarna overgebracht naar een 1,5 mL Eppendorf-buisje en bewaard bij -20 °C.In afwachting van verdere analyse, mijn naam is Peter Bohi. Ik ben promotieonderzoeker in het laboratorium voor Ecologische en Conservatiegenomica van Dr. Michael Rosso aan de University of British Columbia, campus Okanagan. Het DNA dat is geëxtraheerd uit het haar dat we deze zomer hebben bemonsterd, werd vervolgens gebruikt voor PCR om diverse typen moleculaire markers te amplificeren.We hebben daarnaast levermonsters gebruikt als positieve controle en basis. Ter vergelijking met onze methode hebben we nucleaire microsatellietloci geamplificeerd die zullen worden gebruikt om de populatie- en genetische structuur van ons dier te bestuderen, evenals A FLP genomische scans die zullen worden gebruikt om de genetische basis van adaptatie langs een altitudinale gradiënt te bestuderen. We hebben ook mitochondriale DNA-sequenties tot 800 baseparen geamplificeerd die gebruikt kunnen worden om de fylogeografie van de soort te bestuderen, en we passen de moleculaire seksebepalingsmethode toe op basis van zinkvingersequenties en P-C-R-R-F-L-P om het geslacht van de individuen in onze populaties te identificeren.Voor alle geteste markers produceerde DNA geëxtraheerd uit haar- en levermonsters vergelijkbare niveaus van DNA-sequentie- en genotypekwaliteit. In deze video hebben we aangetoond dat deze niet-invasieve bemonsteringsmethode, in combinatie met het DNA IQ-extractieprotocol, effectief is voor het verkrijgen van voldoende hoeveelheden haar die DNA van adequate kwaliteit en kwantiteit opleveren voor PCR-amplificatie. Over het algemeen voorzien we dat deze methode nuttig zal zijn bij het faciliteren van gegevensverzameling ter ondersteuning van populatie-, genetische en gedragsstudies naar zeldzame of schuwe kleine zoogdieren, terwijl de impact op de bestudeerde soorten wordt geminimaliseerd.

a-noninvasive-hair-sampling-technique-to-obtain-high-quality-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

De Direct PCR hier gepresenteerde benadering vergemakkelijkt PCR-amplificatie rechtstreeks van kleine hoeveelheden ongezuiverd planten-en dierlijk weefsel.

Genotypering van plantaardige en dierlijke monsters zonder voorafgaande DNA-zuivering

Weefsel-specifieke analyse van een haarfollikel regeneratie model met behulp van lentivirus tot winst-of verlies-van-functie bemiddelen.

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

We beschrijven procedures voor etikettering en genotypering pasgeboren muizen en het genereren van primaire neuronale kweken van hen. De genotypering is snel, efficiënt en betrouwbaar, en maakt geautomatiseerde nucleïnezuur extractie. Dit is vooral handig neonataal dodelijke muizen en culturen die voorafgaande afronding genotyperen vereisen.

Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

Hier beschrijven we een optimale en efficiënte verwijdering strategie voor het verzamelen van onderhavige bio-deeltjes "raken DNA" monsters, tezamen met een verbeterde amplificatieprotocol waarbij in één stap 5 gl micro-volume lysis / STR amplificatie, het herstel van mogelijk short tandem repeat (STR) profielen van de bio-deeltje donor (en).

Verbeterde Genetische analyse van Single Human Bioparticles Hersteld door vereenvoudigd Micromanipulatie uit Forensisch &#39;Touch-DNA&#39; Evidence

In dit artikel tonen we hoe de absorberende microbiopsy-techniek is uitgevoerd en hoe de steekproef kan worden gebruikt voor RNA extractie voor eenvoudige en gelijktijdige sampling van huid en bloed op een minimaal invasieve manier.

Absorberend Microbiopsy bemonsterings- en RNA extractie voor minimaal invasieve, gelijktijdige bloed en huid analyse

Dit is een protocol voor de optimale weefsel voorbereiding voor genomische, transcriptomische en proteomische analyses van vleermuizen die in het wild zijn gevangen. Het omvat de protocollen voor de inname van vleermuis en dissectie, weefsel conservering, en celculturing van vleermuis weefsel.

Weefsel collectie van vleermuizen voor-omics analyses en primaire celcultuur

Het huidige protocol presenteert een snelle, efficiënte en zachte methode voor het isoleren van enkele cellen die geschikt zijn voor eencellige RNA-seq-analyse van een continu groeiende muizensnijtand, muizenkies en menselijke tanden.

Snelle isolatie van afzonderlijke cellen van muizen en menselijke tanden

Het protocol presenteert een reeks best practice-protocollen voor het verzamelen van botpoeder van acht aanbevolen anatomische bemonsteringslocaties (specifieke locaties op een bepaald skeletelement) over vijf verschillende skeletelementen van middeleeuwse individuen (radiokoolstof gedateerd op een periode van ca. 1040-1400 CE, gekalibreerd 2-sigmabereik).

Geoptimaliseerde botbemonsteringsprotocollen voor het ophalen van oud DNA uit archeologische overblijfselen

Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor niet-invasieve genetische bemonstering van vlinderpopulaties op basis van de veldverzameling van resterend eipuin. Het kan worden gebruikt om de identiteit van soorten te bevestigen en genetische variatie te kwantificeren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast aan bredere groepen voor betrokkenheid van de gemeenschap bij de wetenschap.

Gemeenschapswetenschappers inzetten om niet-destructieve genetische bemonstering van zeldzame vlinderpopulaties uit te voeren

Leer een niet-invasieve haarverzamelmethode voor populatiegenetisch onderzoek aan de Amerikaanse pika. Deze techniek minimaliseert verstoring en levert hoogwaardig DNA voor moleculaire analyses.

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Meer video's verkennen