Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells

Deze video demonstreert een methode om de invasie van een endotheelcellaag door kankercellen te monitoren met behulp van een real-time techniek op basis van elektrische impedantie. Ten eerste worden menselijke navelstrengendotheelcellen, aangeduid als VE, geplaatst in 16-well EPL's die zijn gecoat met gouden elektroden op de bodem van de well. Om een confluente monolaag te genereren worden kankercellen toegevoegd, die zich hechten aan de VE en de HVAC-monolaag binnendringen, waardoor de verbindingen tussen de endotheelcellen worden verstoord. Vervolgens worden impedantiemetingen uitgevoerd, die afhankelijk zijn van het totale oppervlak van de wellbodem dat door cellen wordt bedekt.

De mate van invasie kan vervolgens worden bepaald op basis van veranderingen in de elektrische impedantie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals void chamber- en METROGEL-assays, is dat de interacties tussen endotheelcellen en tumorcellen het in vivo metastatische proces nauwer nabootsen, en dat de gegevens in realtime worden verkregen en gemakkelijker kwantificeerbaar zijn in tegenstelling tot de eindpuntanalyse bij andere methoden. Deze methode kan inzicht bieden in de invasie van kankercellen.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals het onderzoeken van cel-celinteracties in het immuunsysteem. Bovendien kan de beginfase van het experiment, waarin we de groei van UX-cellen observeren, worden gebruikt om de celproliferatie van elke cellijn te evalueren zonder verdere invasiestappen; de procedure zal worden gedemonstreerd door Rahim, een promovendus uit mijn laboratorium. Alle stappen van dit protocol moeten onder steriele omstandigheden in een weefselkweekkast worden uitgevoerd.

Het Xcel-systeem dat voor dit experiment wordt gebruikt, wordt permanent bewaard in een incubator van 37 °C en 5% CO2, die bij het eerste gebruik uitsluitend voor dit instrument is gereserveerd. Het instrument moet gedurende ten minste 16 uur in de incubator blijven om te equilibreren met de nieuwe temperatuur- en vochtigheidsomgeving. Bereid vervolgens Thence EPL 16 voor door het gedurende één uur bij 37 °C te coaten met 0,1% gelatine.

Zodra de plaat is gecoat, wordt deze één keer gewassen met PBS. Voeg vervolgens 100 µL gereconstitueerd e gm two medium toe om een blanco-meting uit te voeren, teneinde de achtergrondimpedantie in afwezigheid van cellen te meten.

Plaats de EPL in het Excel agent-systeem op de computer. Open de Excel agent-software door op het RTCA-software-icoon op het bureaublad in het softwarevenster te klikken. Klik op het tabblad layout en selecteer de wells die monsters bevatten.

Om de frequentie van de realtime gegevensacquisitie te programmeren: klik op het tabblad 'schedule' en klik vervolgens op het icoon 'add a step'. 'Sweeps' geeft het aantal metingen aan en 'intervals' geeft het tijdsinterval tussen de metingen aan. Deze zijn automatisch respectievelijk ingesteld op één en 1.00 minuut.

Hiermee wordt het systeem geprogrammeerd om een achtergrondmeting uit te voeren. Klik op 'stap toevoegen' en voer 300 in bij het vak 'sweeps' en 10 minuten bij het vak 'intervallen'. Hiermee wordt het instrument geprogrammeerd om impedantiemetingen uit te voeren gedurende maximaal 50 uur.

Om het experiment te starten, klikt u op het pictogram voor het starten van een stap. De achtergrondimpedantie van elke well wordt gemeten nadat de achtergrondmeting is uitgevoerd. Het venster geeft het bericht weer.

Klik om door te gaan naar de volgende stap. De volgende stap kan nu worden gestart. Op dit moment kunnen de cellen worden toegevoegd en kan de vorming van een monolaag worden gemonitord zoals beschreven.

In de volgende sectie worden de hier gebruikte menselijke navelstrengader-endotheelcellen of VE gekweekt in EGM-2 medium, gereconstitueerd met de EGM-2 bullet kit die groeifactor-supplementen bevat, en 5% FBS. De cellen moeten worden bewaard in een incubator op 37 °C in de aanwezigheid van 5% koolstofdioxide. Controleer op de dag van het experiment de confluentie van de HUVEC onder een microscoop; de cellen moeten een laag passagesnummer hebben, bij voorkeur niet meer dan zes, en minder dan 75% confluent zijn. Om een HUVEC-monolaag te genereren, worden de cellen geoogst met trypsine. Zodra de cellen los zijn geraakt van de kolf, moeten alle sporen van trypsine worden verwijderd door centrifugatie bij 200 ×g. Was de cellen na het centrifugeren één keer met PBS.

Resuspendeer vervolgens de cellen en het gereconstitueerde EGM-2 medium tot een concentratie van 2,5 × 10⁵ cellen per milliliter. Zodra de cellen zijn geresuspendeerd, verwijdert u de gekalibreerde achtergrond-EPL uit het EXOGEN-systeem en voegt u 100 µL van de HX-suspensie toe aan de 100 µL EGM-2 medium die al in de plaat aanwezig is. Plaats de EPL onmiddellijk in de Excel-systeemcelanalyser.

Begin met het verzamelen van impedantiemetingen door op de startknop in het softwarevenster te klikken. Laat de endotheelcellen groeien. Het systeem blijft elke 10 minuten impedantiemetingen uitvoeren.

Uve vertoont een kenmerkende tijdelijke afvlakking van de celindex vier tot zes uur na het uitplaten, gevolgd door een verdere stabilisatie na 16 tot 18 uur. Daarom is het belangrijk om de cellen ten minste 18 uur de tijd te geven om een confluente monolaag te vormen. Zodra er een monolaag is gevormd, kunnen de invaderende cellen worden toegevoegd ter voorbereiding op de invasie-assay.

Bereid de invaderende tumorcellen voor. In dit geval worden osteosarcoomcellen gebruikt. Begin met het oogsten van de cellen met trypsine.

Verwijder alle sporen van trypsine door de cellen te centrifugeren bij 200 G en één keer te wassen met PPS. Hang na de wasstap de cellen op tot een uiteindelijke dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per milliliter in het medium dat is gebruikt voor het kweken van de tumorcellen, zoals RPMI- of DMEM-medium met 10% FBS. Pauzeer het experiment door op het pictogram voor de pauzestap in het softwarevenster te klikken.

Verwijder de EPL en aspireer het EGM two medium uit de vac monolayer. Voeg 100 µL tumorcelсусpensie toe die 1 × 10⁴ cellen bevat. Over het algemeen werkt een ratio van 1:2,5 tumorcellen ten opzichte van endotheelcellen het beste voor de assay.

De ratio kan echter worden geoptimaliseerd voor individuele cellijnen. Plaats de EPL terug in het Excel agent-systeem in de incubator. Klik op de vervolgstap om door te gaan met het uitvoeren van impedantiemetingen met intervallen van 10 minuten.

Monitor de invasie in real-time gedurende de volgende zes tot 12 uur. Een daling in de celindex zal het gevolg zijn van de retractie van endotheelverbindingen en penetratie door invaderende tumorcellen. Wanneer het experiment is voltooid, gebruik dan de Exergen-software om de resultaten te normaliseren naar het tijdstip van toevoeging van de invaderende tumorcellen.

De exergen-software maakt normalisatie mogelijk naar elk tijdstip waarop VEX op het exergen-systeem werden gekweekt, zoals in deze video wordt getoond; na de vorming van de monolayer werden er ofwel K seven M two-cellen of K 12-cellen toegevoegd. Zoals hier te zien is, treedt er binnen enkele uren na de introductie van K seven M two-cellen een steile daling van de celindex op. K seven M two is een zeer metastatische osteosarcoom-cellijn.

Deze cellen brengen hoge niveaus van het cytoskelet-linkerprotein ene tot expressie, wat verantwoordelijk is voor de invasieve eigenschappen van de cellijn. K 12-cellen daarentegen zijn minder metastatisch en zijn niet in staat om de endotheliale monolaag zo efficiënt te penetreren als K seven M two-cellen. Dit wordt weergegeven door een minder sterke afname van de celindex, zoals hier getoond.

De hier getoonde controle vertegenwoordigt de impedantie van de uve-monolaag. In afwezigheid van kankercellen werden de experimenten in triplicaat uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het in real-time meten van invasie door het genereren van een endotheelcelmonolaag en het uitdagen van deze monolaag met kankercellen.

De beginstappen van het experiment met betrekking tot de vorming van HU XL-monolagen kunnen worden gebruikt om de celproliferatie via impedantie te evalueren. Twee.