Name: Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer een impedantie-gebaseerde techniek om in real-time de invasie van kankercellen door een endotheelmonolaag te meten met HUVEC-cellen. Deze methode biedt kwantitatieve data over metastatische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door fondsen van Children&#39;s Cancer Foundation (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) en NIH (R01CA108641). Wij danken dr. Anton Wellstein en leden van zijn laboratorium voor het delen van hun ervaring en ons te helpen om gepresenteerde methoden te optimaliseren.

1. Voorbereiding <ol><li> Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een weefselkweek kap. </li><li> De xCELLigence station is geplaatst in een 37 ° C incubator in aanwezigheid van 5% CO2. </li><li> Met lage passage HUVEC cellen, bij voorkeur niet meer dan passage 6. Zorg er ook voor dat de cellen niet meer dan 75% samenvloeiing op het moment van de oogst. </li><li> HUVEC cellen worden gekweekt in EGM-2 media gereconstitueerd met EGM-2 bullet kit (Lonza Biosciences) die groeifactoren, supplementen en 5% foetaal runderserum. </li><li> Alle sporen van trypsine dienen van celsuspensies worden verwijderd door het draaien cellen bij 200xg, eenmaal wassen met PBS, en resuspenderen naar opgegeven celdichtheden. </li><li> Coat xCELLigence E-plaat 16 met 0,1% gelatine gedurende 1 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C. Was plaat met PBS en voeg 100 pi gereconstitueerde EGM-2-media. Voer een blanco lezing over de xCELLigence systeem om achtergrond te metenimpedantie in afwezigheid van cellen. </li></ol> 2. Het genereren van HUVEC monolaag <ol><li> Oogst een sub-confluente kolf van HUVEC cellen door behandeling met trypsine. Resuspendeer cellen in gereconstitueerde EGM-2 medium tot een uiteindelijke dichtheid van 2,5 x 10 5 cellen / ml. </li><li> Aan elk putje van een achtergrond gekalibreerde E-plaat met 100 ul EGM-2 media, voeg 100 ul van de celsuspensie HUVEC (2,5 x 10 4 cellen HUVEC). </li><li> Direct te installeren E-Plate in de xCELLigence instrument. </li><li> Programma xCELLigence software om impedantie metingen uitvoeren met een interval van 10 minuten. </li><li> Laat de endotheelcellen groeien 18-21 uur totdat ze een monolaag, zoals blijkt uit een afvlakking van celindex (figuur 2). </li></ol> 3. Toevoeging van binnendringende cellen en data normalisatie. <ol><li> Zodra een stabiele HUVEC monolaag heeft gevormd, oogst tumorcellen door behandeling met trypsine en resuspendeer tot een uiteindelijke holenheid van 1 x 10 5 cellen / ml in medium gebruikt om tumorcellen (bijvoorbeeld RPMI of DMEM medium met 10% FBS) groeien </li><li> Pauze impedantie metingen op het xCELLigence software en verwijder E-Plate van het station. </li><li> Verwijder de EGM-2 medium door aspiratie. Voeg 100 pl van tumorcel suspensie bevattende 1 x 10 4 cellen. Algemeen een 1:2,5 verhouding van tumorcellen: endotheelcellen gezaaid beste werkt voor de assay. Echter kan de verhouding worden geoptimaliseerd voor individuele cellijnen. </li><li> Plaats de E-plaat op het xCELLigence systeem in de couveuse en blijven impedantie metingen met een interval van 10 minuten. </li><li> Invasion kunnen worden in real-time de komende 6-12 uur als een daling celindex door het terugtrekken van endotheliale knooppunten en penetratie door binnendringende tumorcellen. </li><li> Normaliseren resultaten na het toevoegen van de binnendringende tumorcellen. De xCELLigence software maakt normalisering tot elk tijdstip en resultatenkunnen direct bekeken worden in de software-venster. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van HUVEC monolaag invasie van metastatische en niet-metastatische cellen wordt getoond in figuur 3. K7M2 is een gemetastaseerd osteosarcoom cellijn. Deze cellen brengen hoge niveaus van het cytoskelet linker eiwit Ezrin, die goed is voor de invasieve eigenschappen van deze cellijn 13,14. Wanneer HUVEC cellen uitgedaagd met K7M2 cellen, er een daling in de elektrische weerstand binnen 6 uur. Deze daling van de elektrische weerstand vertegenwoordigt de invasie van HUVEC monolaag door de binnendringende tumorcellen. De K12 cellijn, anderzijds, drukt veel lagere Ezrin en bijgevolg minder metastatische 13. Het uitdagen van de HUVEC monolaag met K12 cellen resulteert in een minder sterke daling van de weerstand als de cellen niet in staat zijn zich te houden aan of bedreigen via de HUVEC monolaag (Figuur 3). <imgsrc files alt='"Figuur'></imgsrc> Figuur 1. Schematische weergave van workflow-proces voor een invasie van de endotheelcellen door tumorcellen. HUVEC cellen worden uitgeplaat op met gelatine beklede E-platen en toegestaan ​​om een ​​confluente monolaag te vormen. Kwaadaardige cellen worden toegevoegd nadat een monolaag heeft gevormd en invasie in real-time de celindex verandert wegens invasie van endotheliale monolaag. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. HUVEC monolaag formatie. Veranderingen in cel index HUVEC cellen hechten aan en verspreiden op gelatine-beklede gouden elektroden. De vorming van een confluente monolaag wordt vertegenwoordigd door een stabilisatie van celindex na 18 uur. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Invasie van HUVEC cellen door K7M2 en K12 osteosarcoomcellen. Een sterke daling van de cell-index zich voordoet binnen een paar uur van de invoering van zeer metastatische K7M2 cellen. K12 cellen, daarentegen, zijn minder metastatische en zijn niet in de endotheliale monolaag zo efficiënt K7M2 cellen doordringen. Dit is weergegeven door een minder sterke daling celindex wanneer HUVEC monolaag cellen uitgedaagd met K12. Controle vertegenwoordigt impedantie van HUVEC monolaag in afwezigheid van kankercellen. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

<ol><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+The+metastasis+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. The metastasis cascade.</a> Science. 321, 1785-1787 (2008).</li>
<li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).</li>
<li>Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+cancer+cells+and+the+endothelium+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis.</a> J Pathol. 190, 310-329 (2000).</li>
<li>Bacac, M., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Metastatic cancer cell.</a> Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).</li>
<li>Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+signals+from+the+invasive+front%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New signals from the invasive front.</a> Nature. 441, 444-450 (2006).</li>
<li>Kramer, R. H., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+tumor+cells+with+vascular+endothelial+cell+monolayers%3A+a+model+for+metastatic+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li>
<li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time%3A+assessment+of+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).</li>
<li>Whipple, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+promotes+tubulin+Detyrosination+and+Microtentacles+that+enhance+endothelial+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement.</a> Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).</li>
<li>Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-microelectronic+sensing+technique+for+profiling+cytotoxicity+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals.</a> Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).</li>
<li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li>
<li>Ren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin-cytoskeleton+linker+protein+ezrin+is+regulated+during+osteosarcoma+metastasis+by+PKC%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC.</a> Oncogene. 28, 792-802 (2009).</li>
</ol>

De publicatie kosten voor dit manuscript werd vriendelijk verschaft door Roche Applied Science.

De real-time HUVEC invasie assay is een eenvoudige, maar krachtige methode voor het bewaken invasie. Het levert resultaten in real-time, hetgeen een significant voordeel boven andere traditionele technieken die afhankelijk eindpunt-analyse. De test kan worden aangepast om te testen geneesmiddelen, antilichamen, liganden eiwitten en remmers of stimulatoren van metastase. Het effect van verschillende agenten endotheliale / kankercel overspraak kan ook worden beoordeeld. Bij de introductie van exogene middelen zoals groeifactoren en drugs in het kweekmedium is het belangrijk dat zij geen invloed hebben op de integriteit van de HUVEC monolaag. Verstoring van de HUVEC monolaag kan worden getest door het introduceren exogene middel in afwezigheid van binnenvallende cellen, en zorgen ervoor dat er geen verandering in cel index. Daarom moeten passende controles te worden opgenomen als onderdeel van de experimentele opzet. Verschillende cellijnen tonen verschillende cel-index bochten als ze vormen een confluent monolaag. De vorm van de curve, en het maximum cel-index bereikt is celtypespecifieke. HUVEC cellen een kenmerk voorbijgaande vlakkere celindex 4-6 uur na het uitzaaien, gevolgd door een stabilisatie bij een hogere celindex na 16-18 uur. Daarom is het belangrijk te laten de cellen vormen een confluente monolaag ten minste 18 uur vóór de toevoeging van tumorcellen. Aangezien de cel index is afhankelijk van de ionische omgeving aan de elektrode / cel interfase verschillende factoren zoals cel-morfologie en de kwaliteit van cel-cel adhesie beïnvloeden cel-index, in aanvulling op het gebied van de goed gevulde bodem. Dus de afname celindex, hetgeen gebeurt bij tumorcel invasie, is een functie van verscheidene factoren, die het terugtrekken van endotheliale kruispunten en daaropvolgende tumorcelinvasie omvatten. De xCELLigence instrument wordt vervaardigd in drie verschillende configuraties: realtime cell analyzer(RTCA) SP, RTCA MP en RTCA DP. Het RTCA SP instrument houdt een 96-well E-plaat terwijl het RTCA MP instrument kan maximaal zes 96-well E-platen tegelijk. Dit maakt high-throughput screening van geneesmiddelen en verbindingen. De experimenten die in dit artikel worden uitgevoerd met behulp van de RTCA DP-instrument, dat drie 16-well E-platen kan houden. Elke E-plaat voorhanden station kunnen onafhankelijk van elkaar worden bediend, die het mogelijk maakt meerdere gebruikers experimenten tegelijk draaien. De RTCA DP instrument kan ook worden gebruikt om migratie met CIM-plaat onderzoeken. Dit zijn 16-well platen met bovenste en onderste kamers gescheiden door een polyethyleentereftalaat (PET) membraan met een gemiddelde poriegrootte van 8um. De elektronische sensoren bevinden zich aan de onderkant van het poreuze membraan van de bovenste kamer. De onderste kamer dient als een reservoir voor de chemoattractant voor cellen in de bovenste kamer. Echter, een groot voordeel van de HUVEC invasieanalyse via CIM-platen die de tumorcel invasie in de voormalige iis niet beperkt door de poriegrootte, zoals endotheelcellen invasie afhankelijk overspraak tussen de tumor en endotheelcellen. De HUVEC invasie assay kan ook worden uitgevoerd op ECIS Z instrument, vervaardigd door Applied Biophysics (Troy, NY). De ECIS Z instrument maakt gebruik van een technologie vergelijkbaar met de xCELLigence instrument, met verschillen in de array en elektrode configuraties. We hebben met succes uitgevoerd HUVEC invasie assays met de 8-well ECIS arrays. Het is belangrijk op te merken dat de goed onderste oppervlak is groter in het ECIS arrays, die een groter aantal endotheliale cellen en tumorcellen vereist geplateerd: 2,5 x 10 5 en 1 x 10 5 cellen respectievelijk.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence RTCA DP station</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469759001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA controle-unit</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05454417001</td><td>Notebook met vooraf geïnstalleerde RTCA-software</td></tr><tr><td>E-Plate 16</td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469830001</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC-cellen</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 medium</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 bullet kit</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatine in steriel H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>EMD Millipore</td><td>MCPROTO045</td><td></td></tr></tbody></table>

een real-time elektrische impedantie gebaseerd techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door cancer cells

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatische verspreiding van kwaadaardige cellen vereist afbraak van basaalmembraan, hechting van tumorcellen voor vasculair endotheel, terugtrekken van endotheliale kruispunten en tenslotte invasie en migratie van tumorcellen door de endotheliale laag opgenomen in de bloedstroom als vervoermiddel naar afgelegen plaatsen in het ontvangende 1-3. Eenmaal in de bloedsomloop, kankercellen zich aan capillaire wanden en extravasatie het omringende weefsel om metastatische tumoren 4,5 vormen. De verschillende componenten van tumorcel-endotheelcel interactie in vitro worden gerepliceerd door tegen een monolaag van humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) met kankercellen. Studies uitgevoerd met elektronen en fase-contrast microscopie suggereren dat de in vitro opeenvolging van gebeurtenissen tamelijk vertegenwoordigen de in vivo metastatische proces 6. Hier beschrijven we een elektrisch-impedantie gebaseerde techniek die controleert en kwantificeert in real-time de Invasion van endotheelcellen van kwaadaardige tumorcellen. Giaever en Keese eerst beschreven een techniek voor schommelingen in impedantie, een populatie cellen groeien op het oppervlak van de elektroden 7,8. De xCELLigence instrument, vervaardigd door Roche, maakt gebruik van een soortgelijke techniek om veranderingen in elektrische impedantie meten en cellen hechten en verspreiden in een kweekschaal bedekt met een gouden micro-elektrode array die ongeveer 80% van het gebied omvat op de bodem van een put. Als cellen hechten en verspreid over het elektrodeoppervlak, leidt tot een toename in elektrische impedantie 9-12. De impedantie wordt weergegeven als een dimensieloze parameter genaamd cel-index, die recht evenredig met de totale oppervlakte van weefsel-kweek en die onder cellen. Derhalve kan de cel-index worden gebruikt voor celadhesie, verspreiding, morfologie en celdichtheid controleren. De invasie assay beschreven in dit artikel is gebaseerd op veranderingenin elektrische impedantie aan de elektrode / cel interfase, als een populatie van kwaadaardige cellen binnen te dringen door een monolaag HUVEC (Figuur 1). De verstoring van endotheliale kruispunten terugtrekken van endotheliale monolaag en vervanging door tumorcellen leiden tot grote veranderingen in impedantie. Deze veranderingen direct correleren met het invasieve vermogen van tumorcellen, dwz invasie door zeer agressieve cellen leiden tot grote veranderingen in cel impedantie en vice versa. Deze techniek geeft een tweevoudige voordeel boven bestaande meetmethoden invasie, zoals Boyden-kamer en Matrigel assays: 1) de endotheelcel-tumorcel interactie nauwer bootst de in vivo werkwijze, en 2) de gegevens verkregen in real- tijd en is gemakkelijker kwantificeerbaar tegenover eindpunt analyse andere wijzen.

Dit artikel beschrijft een<em&gt; In vitro</em&gt; Techniek voor bewaking kankercellen invasie door een monolaag van endotheelcellen. De gegevens worden verkregen in real time als functie van veranderingen in impedantie op het oppervlak van de elektroden aan de putbodem.

Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells

Metastatische verspreiding van maligne cellen vereist degradatie van het basaalmembraan, hechting van tumorcellen aan het vasculair endotheel, retractie van ...

Deze video demonstreert een methode om de invasie van een endotheelcellaag door kankercellen te monitoren met behulp van een real-time techniek op basis van elektrische impedantie. Ten eerste worden menselijke navelstrengendotheelcellen, aangeduid als VE, geplaatst in 16-well EPL's die zijn gecoat met gouden elektroden op de bodem van de well. Om een confluente monolaag te genereren worden kankercellen toegevoegd, die zich hechten aan de VE en de HVAC-monolaag binnendringen, waardoor de verbindingen tussen de endotheelcellen worden verstoord. Vervolgens worden impedantiemetingen uitgevoerd, die afhankelijk zijn van het totale oppervlak van de wellbodem dat door cellen wordt bedekt.De mate van invasie kan vervolgens worden bepaald op basis van veranderingen in de elektrische impedantie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals void chamber- en METROGEL-assays, is dat de interacties tussen endotheelcellen en tumorcellen het in vivo metastatische proces nauwer nabootsen, en dat de gegevens in realtime worden verkregen en gemakkelijker kwantificeerbaar zijn in tegenstelling tot de eindpuntanalyse bij andere methoden. Deze methode kan inzicht bieden in de invasie van kankercellen.Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals het onderzoeken van cel-celinteracties in het immuunsysteem. Bovendien kan de beginfase van het experiment, waarin we de groei van UX-cellen observeren, worden gebruikt om de celproliferatie van elke cellijn te evalueren zonder verdere invasiestappen; de procedure zal worden gedemonstreerd door Rahim, een promovendus uit mijn laboratorium. Alle stappen van dit protocol moeten onder steriele omstandigheden in een weefselkweekkast worden uitgevoerd.Het Xcel-systeem dat voor dit experiment wordt gebruikt, wordt permanent bewaard in een incubator van 37 °C en 5% CO2, die bij het eerste gebruik uitsluitend voor dit instrument is gereserveerd. Het instrument moet gedurende ten minste 16 uur in de incubator blijven om te equilibreren met de nieuwe temperatuur- en vochtigheidsomgeving. Bereid vervolgens Thence EPL 16 voor door het gedurende één uur bij 37 °C te coaten met 0,1% gelatine.Zodra de plaat is gecoat, wordt deze één keer gewassen met PBS. Voeg vervolgens 100 µL gereconstitueerd e gm two medium toe om een blanco-meting uit te voeren, teneinde de achtergrondimpedantie in afwezigheid van cellen te meten.Plaats de EPL in het Excel agent-systeem op de computer. Open de Excel agent-software door op het RTCA-software-icoon op het bureaublad in het softwarevenster te klikken. Klik op het tabblad layout en selecteer de wells die monsters bevatten.Om de frequentie van de realtime gegevensacquisitie te programmeren: klik op het tabblad 'schedule' en klik vervolgens op het icoon 'add a step'. 'Sweeps' geeft het aantal metingen aan en 'intervals' geeft het tijdsinterval tussen de metingen aan. Deze zijn automatisch respectievelijk ingesteld op één en 1.00 minuut.Hiermee wordt het systeem geprogrammeerd om een achtergrondmeting uit te voeren. Klik op 'stap toevoegen' en voer 300 in bij het vak 'sweeps' en 10 minuten bij het vak 'intervallen'. Hiermee wordt het instrument geprogrammeerd om impedantiemetingen uit te voeren gedurende maximaal 50 uur.Om het experiment te starten, klikt u op het pictogram voor het starten van een stap. De achtergrondimpedantie van elke well wordt gemeten nadat de achtergrondmeting is uitgevoerd. Het venster geeft het bericht weer.Klik om door te gaan naar de volgende stap. De volgende stap kan nu worden gestart. Op dit moment kunnen de cellen worden toegevoegd en kan de vorming van een monolaag worden gemonitord zoals beschreven.In de volgende sectie worden de hier gebruikte menselijke navelstrengader-endotheelcellen of VE gekweekt in EGM-2 medium, gereconstitueerd met de EGM-2 bullet kit die groeifactor-supplementen bevat, en 5% FBS. De cellen moeten worden bewaard in een incubator op 37 °C in de aanwezigheid van 5% koolstofdioxide. Controleer op de dag van het experiment de confluentie van de HUVEC onder een microscoop; de cellen moeten een laag passagesnummer hebben, bij voorkeur niet meer dan zes, en minder dan 75% confluent zijn. Om een HUVEC-monolaag te genereren, worden de cellen geoogst met trypsine. Zodra de cellen los zijn geraakt van de kolf, moeten alle sporen van trypsine worden verwijderd door centrifugatie bij 200 ×g. Was de cellen na het centrifugeren één keer met PBS.Resuspendeer vervolgens de cellen en het gereconstitueerde EGM-2 medium tot een concentratie van 2,5 × 10⁵ cellen per milliliter. Zodra de cellen zijn geresuspendeerd, verwijdert u de gekalibreerde achtergrond-EPL uit het EXOGEN-systeem en voegt u 100 µL van de HX-suspensie toe aan de 100 µL EGM-2 medium die al in de plaat aanwezig is. Plaats de EPL onmiddellijk in de Excel-systeemcelanalyser.Begin met het verzamelen van impedantiemetingen door op de startknop in het softwarevenster te klikken. Laat de endotheelcellen groeien. Het systeem blijft elke 10 minuten impedantiemetingen uitvoeren.Uve vertoont een kenmerkende tijdelijke afvlakking van de celindex vier tot zes uur na het uitplaten, gevolgd door een verdere stabilisatie na 16 tot 18 uur. Daarom is het belangrijk om de cellen ten minste 18 uur de tijd te geven om een confluente monolaag te vormen. Zodra er een monolaag is gevormd, kunnen de invaderende cellen worden toegevoegd ter voorbereiding op de invasie-assay.Bereid de invaderende tumorcellen voor. In dit geval worden osteosarcoomcellen gebruikt. Begin met het oogsten van de cellen met trypsine.Verwijder alle sporen van trypsine door de cellen te centrifugeren bij 200 G en één keer te wassen met PPS. Hang na de wasstap de cellen op tot een uiteindelijke dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per milliliter in het medium dat is gebruikt voor het kweken van de tumorcellen, zoals RPMI- of DMEM-medium met 10% FBS. Pauzeer het experiment door op het pictogram voor de pauzestap in het softwarevenster te klikken.Verwijder de EPL en aspireer het EGM two medium uit de vac monolayer. Voeg 100 µL tumorcelсусpensie toe die 1 × 10⁴ cellen bevat. Over het algemeen werkt een ratio van 1:2,5 tumorcellen ten opzichte van endotheelcellen het beste voor de assay.De ratio kan echter worden geoptimaliseerd voor individuele cellijnen. Plaats de EPL terug in het Excel agent-systeem in de incubator. Klik op de vervolgstap om door te gaan met het uitvoeren van impedantiemetingen met intervallen van 10 minuten.Monitor de invasie in real-time gedurende de volgende zes tot 12 uur. Een daling in de celindex zal het gevolg zijn van de retractie van endotheelverbindingen en penetratie door invaderende tumorcellen. Wanneer het experiment is voltooid, gebruik dan de Exergen-software om de resultaten te normaliseren naar het tijdstip van toevoeging van de invaderende tumorcellen.De exergen-software maakt normalisatie mogelijk naar elk tijdstip waarop VEX op het exergen-systeem werden gekweekt, zoals in deze video wordt getoond; na de vorming van de monolayer werden er ofwel K seven M two-cellen of K 12-cellen toegevoegd. Zoals hier te zien is, treedt er binnen enkele uren na de introductie van K seven M two-cellen een steile daling van de celindex op. K seven M two is een zeer metastatische osteosarcoom-cellijn.Deze cellen brengen hoge niveaus van het cytoskelet-linkerprotein ene tot expressie, wat verantwoordelijk is voor de invasieve eigenschappen van de cellijn. K 12-cellen daarentegen zijn minder metastatisch en zijn niet in staat om de endotheliale monolaag zo efficiënt te penetreren als K seven M two-cellen. Dit wordt weergegeven door een minder sterke afname van de celindex, zoals hier getoond.De hier getoonde controle vertegenwoordigt de impedantie van de uve-monolaag. In afwezigheid van kankercellen werden de experimenten in triplicaat uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het in real-time meten van invasie door het genereren van een endotheelcelmonolaag en het uitdagen van deze monolaag met kankercellen.De beginstappen van het experiment met betrekking tot de vorming van HU XL-monolagen kunnen worden gebruikt om de celproliferatie via impedantie te evalueren. Twee.

a-real-time-electrical-impedance-based-technique-to-measure-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes an invasion assay using a three-chambered array based on electrical impedance. This technique measures the invasive potential of cancer cells under the influence of soluble factors secreted by the resident stromal cells in tumor microenvironments.

Three-Chambered Array-Based Impedance Assay: A Real-Time Analysis Technique to Assess Invasive Potential of Cancer Cells by Measuring Electrical Impedance

Source: Mudduluru, G., et. al. Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates an impedance-based assay to measure glioblastoma cell invasion and migration. Cells degrade the extracellular matrix, move through microporous membranes, and adhere to electrodes, generating impedance. This real-time analysis reflects their invasive potential for cancer research applications.

Impedance-Based Measurements of Brain Cancer Cell Invasion

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Kanker is een dodelijke ziekte als gevolg van zijn vermogen om uitzaaiingen naar verschillende organen. Het bepalen van het vermogen van kankercellen om te migreren en binnen te vallen onder verschillende behandelingsvoorwaarden is cruciaal voor het beoordelen van therapeutische strategieën. Dit protocol presenteert een methode om de real-time gemetastaseerde vermogens van een glioblastoom kanker cellijn te beoordelen.

Impedantie-gebaseerde Real-time meting van kanker cel migratie en invasie

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Veel opgereguleerde genen stimuleren de migratie en invasie van tumorcellen, wat leidt tot een slechte prognose. Het is van cruciaal belang om te bepalen welke genen de migratie en invasie van tumorcellen reguleren. Dit protocol presenteert een methode om de effecten van de verhoogde expressie van een gen op de migratie en invasie van tumorcellen in realtime te onderzoeken.

Real-time kwantitatieve meting van tumorcelmigratie en -invasie na synthetische mRNA-transfectie

Hier demonstreren we de techniek van het gebruik van op impedantie gebaseerde biosensoren: ECIS en cellZscope, voor het meten van de sterkte van de endotheliale barrière van de hersenen. We beschrijven de voorbereiding en techniek van het toevoegen van verschillende stimuli aan een in vitro model van het hersenendotheel. We meten, registreren en geven een representatieve analyse van de bevindingen.

Het meten van veranderingen in de integriteit van de endotheliale barrière van de hersenen met twee op impedantie gebaseerde biosensoren als reactie op kankercellen en cytokines

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Een uitgebreid overzicht van de technieken die betrokken zijn bij het genereren van een muismodel van orale kanker en kwantitatieve controle van de tumor invasie in de tong door middel van multi-foton microscopie van gelabelde cellen wordt gepresenteerd. Dit systeem kan dienen als een nuttig platform voor de moleculaire beoordeling en werkzaamheid van het geneesmiddel van anti-invasieve verbindingen.

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Leer een impedantie-gebaseerde techniek om in real-time de invasie van kankercellen door een endotheelmonolaag te meten met HUVEC-cellen. Deze methode biedt kwantitatieve data over metastatische processen.

Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells

Meer video's verkennen