Name: Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Leer de analyse van dendritische spine-morfologie in gekweekte CNS-neuronen met GFP-transfectie en confocale microscopie. Deze methode helpt onderzoekers synaptische plasticiteit en neurale functie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Kelly Jones voor een zorgvuldige bewerking. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01MH 071.316, Alzheimer&#39;s Association, de Nationale Alliantie voor onderzoek naar schizofrenie en depressie (NARSAD), en de Nationale Alliantie voor Autisme Research (naar) (PP), American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS), de Amerikaanse Heart Association Predoctorale Fellowship (KMW).

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

Productie van dit werk werd ondersteund door Metamorph (Molecular Devices, Inc.)

De hierboven beschreven technieken voor de gedetailleerde kwantitatieve analyse van dendritische wervelkolom morfologie, lineaire dichtheid en de beweeglijkheid in een van beide vaste of live primaire corticale neuronen zijn gericht op het begrijpen van de effecten van de post-synaptische mechanismen die kunnen bijdragen aan neuropathologieën. Een soortgelijke aanpak kan gebruikt worden om de wervelkolom morfologie of beweeglijkheid in een stekelige neuron, inclusief de hippocampus piramidale, Purkinje, of medium stekel...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> 18 mm ronde Cover glas No 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0714 (CS-18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22 mm vierkante Cover glas No 1.5 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64 tot 0,721 (CS-22S15) </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> Sigma </td><td> P-0899 </td><td> MW 70 ~ 150 kDa </td></tr><tr><td> Neurobasal Media </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L-APV (AP-5) </td><td> Ascent Wetenschappelijke </td><td> ASC-004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Mediatech Cellgro </td><td> 25 tot 060-C een </td><td> 1M, pH 7 </td></tr><tr><td> Formaldehyde-oplossing </td><td> Merck Chemicals </td><td> FX0415-5 </td><td> 36%, Histologie graad </td></tr><tr><td> Normaal Geiten Serum </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> Jackson Immunoresearch Labs </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC21568-2500 </td><td> Acros Organics </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG (H + L) sterk cross-geadsorbeerde </td><td> Invitrogen </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG (H + L) * zeer cross-geadsorbeerd * </td><td> Invitrogen </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold antifade reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> Speciale verpakking </td></tr><tr><td> Afgesloten beeldvorming stadium kamer </td><td> Warner </td><td> RC-30HV </td><td></td></tr><tr><td> Temperatuurregelaar unit </td><td> Warner </td><td> TC-344B </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph </td><td> Universal Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van de dendritische spine morfologie in gekweekte cns neuronen

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritische stekels zijn de websites van de meerderheid van prikkelende verbindingen in de hersenen, en vormen de post-synaptische compartiment van synapsen. Deze structuren zijn rijk aan actine en is aangetoond dat zeer dynamisch. In reactie op de klassieke Hebbian plasticiteit evenals neuromodulatory signalen, kan dendritische spines van vorm veranderen en het aantal, waarvan wordt gedacht kritisch te zijn voor de verfijning van neurale circuits en de verwerking en opslag van informatie in de hersenen. Binnen de dendritische spines, een complex netwerk van eiwitten koppelen extracellulaire signalen met het actine cyctoskeleton waardoor de controle van dendritische wervelkolom morfologie en nummer. Neuropathologische studies hebben aangetoond dat een aantal van de ziekte staten, variërend van schizofrenie tot autisme spectrum stoornissen, abnormale dendritische ruggegraat morfologie of cijfers weer te geven. Bovendien hebben recente genetische studies geïdentificeerd mutaties in tal van genen die eiwitten coderen synaptische, wat leidt tot suggesties dat deze eiwitten kunnen bijdragen aan afwijkende wervelkolom plasticiteit die voor een deel ten grondslag liggen aan de pathofysiologie van deze aandoeningen. Met het oog op onderzoek naar de mogelijke rol van deze eiwitten in het controleren van dendritische wervelkolom morfologie / nummer, het gebruik van gekweekte corticale neuronen biedt verschillende voordelen. Ten eerste is dit systeem zorgt voor hoge-resolutie beeldvorming van dendritische spines in vaste cellen als time-lapse imaging van levende cellen. Ten tweede, dit in vitro systeem maakt een eenvoudige manipulatie van proteïne functie door de expressie van mutant eiwitten, knockdown door shRNA constructen, of farmacologische behandelingen. Deze technieken kunnen de onderzoekers om te beginnen met de rol van de ziekte-geassocieerde eiwitten ontleden en te voorspellen hoe de mutaties van deze eiwitten kunnen functioneren in vivo.

Tal van recente studies hebben aangegeven mutaties in synaptische eiwitten in verband met de hersenen pathologieën. Primaire gekweekte corticale neuronen bieden een grote flexibiliteit in het onderzoeken van de effecten van deze ziekte-geassocieerde eiwitten op dendritische rug morfologie en beweeglijkheid.

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

Dendritische spines zijn de locaties van de meeste excitatoire verbindingen binnen de hersenen en vormen het postsynaptische compartiment van synapsen. Deze ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van diverse moleculaire en farmacologische manipulaties op de morfologie en mobiliteit van dendritische stekels te beoordelen. Dit wordt bereikt door primaire gecultiveerde corticale neuronen met GFP te transfecteren, met of zonder exogene expressie van DNA-plasmiden om de neuronale morfologie in kaart te brengen en de endogene eiwitexpressie en -functie te manipuleren. In de tweede stap kunnen de cellen farmacologisch worden behandeld en vervolgens worden gefixeerd voor immunokleuring of worden voorbereid voor time-lapse imaging.Vervolgens volgt de farmacologische behandeling, die de visualisatie van dendritische stekels en de geïnduceerde veranderingen in de morfologie en beweeglijkheid van deze stekels mogelijk maakt. Daarna worden Z-serie beelden van gefixeerde cellen of beelden van levende cellen, genomen op specifieke tijdstippen, vastgelegd met een confocale microscoop. Gedetailleerde metingen van de morfologie van dendritische stekels kunnen worden uitgevoerd op basis van 2D-projecties van Z-serie beelden.De verkregen resultaten tonen het effect van moleculaire of farmacologische manipulaties op de morfologie o

analysis-of-dendritic-spine-morphology-in-cultured-cns-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Pekarek, B. T., et. al., Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing. J. Vis. Exp. (2021)In this video, we demonstrate the preparation, imaging, and analysis of a cleared mouse brain to examine dendritic arbors, spine morphology, and neuronal distribution using confocal microscopy and 3D reconstruction techniques.

Confocal Microscopy Imaging of Intact Dendritic Arbors and Spine Morphology in a Cleared Mouse Brain

Source: Gouder, et. al. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the imaging and analysis of dendritic spines in transduced, immunolabeled pyramidal neurons using confocal microscopy. Background noise is reduced, and dendrites are traced by estimating their diameter and length. Automated spine segmentation involves setting parameters for dendrite and spine dimensions...

Quantification of Dendritic Spines Using Confocal Microscopy Imaging

Dit artikel beschrijft een werkprotocol op de foto dendritische stekels van hippocampale neuronen in vitro met behulp van Structured Illumination Microscopy (SIM). Superresolutietechnieken gebruik van SIM biedt beeldresolutie aanzienlijk verder gaan dan het licht limiet diffractie in alle drie ruimtelijke dimensies, waardoor de beeldvorming van individuele vertakte stekels met verbeterde details.

Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

We beschrijven twee methoden voor visualisatie en kwantificering van dendritische arborisatie in de hippocampus van muizenmodellen: real-time en extended depth of field beeldvorming. Terwijl de eerste methode geavanceerd topografisch traceren en kwantificering van de mate van vertakking toelaat, biedt de laatste snelle visualisatie van de dendritische boom.

Beoordeling van Dendritische arborization in de gyrus dentatus van de hippocampus regio in Muizen

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een Golgi-Cox protocol in uitgebreid detail. Deze betrouwbare weefselvlekmethode zorgt voor een hoogwaardige beoordeling van de cytoarchitectuur in de hippocampus, en door de hele hersenen, met minimale probleemoplossing.

Beoordeling van Hippocampale Dendritische Complexiteit in Oude Muizen Met behulp van de Golgi-Cox Methode

We presenteren een protocol voor het etiketteren en analyseren van piramidale neuronen, wat essentieel is voor het evalueren van potentiële morfologische veranderingen in neuronen en dendritische stekels die ten grondslag kunnen liggen aan neurochemische en gedragsafwijkingen.

Ballistische etikettering van piramidale neuronen in hersenschijfjes en in de primaire celcultuur

Dendritische stekels zijn belangrijke cellulaire kenmerken van het zenuwstelsel. Hier worden live beeldvormingsmethoden beschreven voor het beoordelen van de structuur en functie van dendritische stekels in C. elegans. Deze benaderingen ondersteunen de ontwikkeling van mutante schermen voor genen die de dendritische wervelkolomvorm of -functie definiëren.

Beeldvorming van dendritische stekels bij Caenorhabditis elegans

Het protocol beschrijft een wijziging van de snelle Golgi-methode, die kan worden aangepast aan elk deel van het zenuwstelsel, voor het kleuren van neuronen in de hippocampus en de mediale prefrontale cortex van de rat.

Snelle Golgi-vlek voor dendritische wervelkolomvisualisatie in hippocampus en prefrontale cortex

Dendritische stekels zijn postsynaptische compartimenten van de meeste excitatoire synapsen. Veranderingen in de morfologie van de dendritische wervelkolom treden op tijdens neurologische ontwikkeling, veroudering, leren en vele neurologische en psychiatrische aandoeningen, wat het belang van betrouwbare analyse van de dendritische wervelkolom onderstreept. Dit protocol beschrijft het nauwkeurig en reproduceerbaar kwantificeren van de morfologie van de dendritische wervelkolom met behulp van...

Kwantificering van de dendritische wervelkolom met behulp van automatische driedimensionale neuronreconstructiesoftware

Leer de analyse van dendritische spine-morfologie in gekweekte CNS-neuronen met GFP-transfectie en confocale microscopie. Deze methode helpt onderzoekers synaptische plasticiteit en neurale functie te bestuderen.

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

Meer video's verkennen