Name: Hele Mount In situ Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Leer whole mount in situ hybridisatie voor genexpressiepatronen in muisembryo's (E8.5-E11.5). Deze methode maakt betrouwbare visualisatie van genfunctie tijdens embryogenese mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R21MH082360 (BGC) en R01HD056315 (NRM) en de Universiteit van Georgia.

<ol><li>Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+non-radioactive+in+situ+hybridization+in+human+airway+tissues%3A+use+of+PCR-generated+templates+for+synthesis+of+probes+and+an+antibody+sandwich+technique+for+detection+of+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Logel, J., Dill, D., Leonard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cRNA+probes+from+PCR-generated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA.</a> Biotechniques. 13, 604-610 (1992).</li>
<li>Maddox, D. M., Condie, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+a+glutamate+decarboxylase+gene+in+multiple+non-neural+tissues+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development.</a> BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).</li>
<li>Conlon, R. A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+retinoic+acid+rapidly+induces+anterior+ectopic+expression+of+murine+Hox-2+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo.</a> Development. 116, 357-368 (1992).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pax%5Bzf-a%5D%3A+a+paired+box-containing+gene+expressed+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube.</a> EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110, 325-330 (1990).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+Brachyury+gene+in+whole-mount+TWis%2FTWis+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos.</a> Development. 113, 913-917 (1991).</li>
<li>Conlon, R. A., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+postimplantation+embryo+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).</li>
<li>Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Wnt+genes+exhibit+discrete+domains+of+expression+in+the+early+embryonic+CNS+and+limb+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds.</a> Development. 119, 247-261 (1993).</li>
<li>Rosen, B., Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+in+the+mouse+embryo%3A+gene+expression+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions.</a> Trends Genet. 9, 162-167 (1993).</li>
<li>Quiring, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Neidhardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screen+for+genes+controlling+mammalian+embryogenesis%2C+using+high-throughput+gene+expression+analysis+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal.</a> 103, 141-143 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De methoden die in dit protocol zijn op basis van een aantal verschillende bronnen en geoptimaliseerd voor ganse berg E8.5-E11.5 dagen oude muis embryo&#39;s. Methoden voor het ganse berg in situ hybridisatie van gewervelde embryo&#39;s verscheen voor het eerst in de vroege jaren 1990 2,5-12. Dit protocol werd aangepast hoofdzakelijk van methoden ontwikkeld voor Xenopus embryo 7,8 en muis 2,11. In ons protocol veel nadruk wordt gelegd op zorgvuldige kwaliteitsbeoordeling van de ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam </th><th> Type </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Digoxigenine-11-uridine-5&#39;-trifosfaat </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11209256910 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleoside trifosfaat Set </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11277057001 </td><td></td></tr><tr><td> Snelle Draai Kolommen voor radioactief gelabelde RNA zuivering </td><td> Leveren </td><td> Roche </td><td> 11274015001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td></td></tr><tr><td> T3 RNA polymerase </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> CTP, [α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml, 250 uCi </td><td> Reagens </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU008X250UC </td><td></td></tr><tr><td> DNase I recombinant, RNase-free </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 4716728001 </td><td></td></tr><tr><td> Ureum, kleurloze tot witte kristallen of kristallijn poeder </td><td> Reagens </td><td> Visser </td><td> BP169-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gel laadbuffer </td><td> Reagens </td><td> Ambion </td><td> AM8547 </td><td></td></tr><tr><td> Hybond-N +, Amersham </td><td> Leveren </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN82B </td><td></td></tr><tr><td> UV Stratalinker 2400 </td><td> Uitrusting </td><td> Stratagene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonaat </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> D5758-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Heparinenatrium </td><td&gt; Reagent </td><td> Acros </td><td> 41121-0010 </td><td></td></tr><tr><td> waterstofperoxide 30% in water </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gluteraldehyde, 8% EM graad </td><td> Reagens </td><td> Polysciences </td><td> 0/710 </td><td> Gebruik voorzichtig volgens vervaardiging instructies </td></tr><tr><td> Blokkerend reagens </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td> Maak in 5% van de aandelen en bewaar bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 3115852001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10109142001 </td><td> Maak als 10 mg / ml bouillon en bewaar bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> RNase T1 </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 10109193001 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Formamide </td><td> Reagens </td><td> Invitrogen </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> Levamisol hydrochloride </td><td> Reagens </td><td> ICN Biomedicals. Inc </td><td> 155228 </td><td></td></tr><tr><td> Ribonucleïnezuur van Torula gist, Type VI </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> R6625 </td><td> fenol / chloroform geëxtraheerd en geprecipiteerd meerdere malen, opnieuw gesuspendeerd in met DEPC dH2O en opgeslagen bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenine-AP Fab fragmenten </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11093274910 </td><td></td></tr><tr><td> BM Purple AP Substraat, precipiterende. Kant-en-klare oplossing. </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 11 442 074 001 </td><td></td></tr><tr><td> 4 ml, Clear, Gesloten Top, opslag Vial Convenience Kit </td><td> Leveren </td><td> Nationale wetenschappelijke </td><td> B7800-2 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Schud N Bake hybridisatie oven </td><td> Uitrusting </td><td> Boekel Wetenschappelijke </td><td> 136400 </td><td></td></tr><tr><td> Biopsie Sure-Tek </td><td> Leveren </td><td> Fisherbrand </td><td> 15-200-402C </td><td></td></tr><tr><td> Paraplast Plus weefsel inbedding medium </td><td> Reagens </td><td> Fisherbrand </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> Peel-A-Way wegwerp plastic weefsel inbedding mallen </td><td> Leveren </td><td> Polysciences </td><td> 18646A </td><td></td></tr><tr><td> Colorfrost Plus Objectglaasjes </td><td> Leveren </td><td> Fisherbrand </td><td> 12-550-17 </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> N8002 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Reagens </td><td> Richard-Allan Wetenschappelijke </td><td> 8310-16 </td><td></td></tr></tbody></table>

hele mount<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie van e8.5 aan e11.5 muis embryo&#39;s

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridisatie is een zeer informatieve benadering voor het definiëren van genexpressie patronen in embryo&#39;s. De in situ hybridisatie procedures lang zijn en technisch veeleisend met meerdere belangrijke stappen die gezamenlijk bijdragen aan de kwaliteit van het eindresultaat. Dit protocol beschrijft in detail een aantal belangrijke kwaliteitscontrole stappen voor het optimaliseren van sonde etikettering en prestaties algemeen., Ons protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van de kritische stappen die nodig zijn om reproduceerbaar te verkrijgen resultaten van hoge kwaliteit. Eerst beschrijven we de generatie van digoxigenine (DIG) gemerkte RNA probes via in vitro transcriptie van DNA templates gegenereerd door PCR. We beschrijven drie kritische kwaliteitscontrole assays om de hoeveelheid, integriteit en specifieke activiteit van het DIG gemerkte probes bepalen. Deze stappen zijn belangrijk voor het genereren van een probe voldoende gevoeligheid voor endogene mRNA te detecteren in een geheel muizenembryo.Daarnaast beschrijven we methoden voor de fixatie en opslag van E8.5-E11.5 dagen oude muizenembryo&#39;s in situ hybridisatie. Vervolgens beschrijven we Methoden voor beperkte proteinase K digestie van het gerehydrateerde embryo gevolgd door de gegevens van de hybridisatieomstandigheden, post-hybridisatie wassingen en RNase behandeling van niet-specifieke probe hybridisatie verwijderen. Een AP-geconjugeerd antilichaam wordt gebruikt om de gelabelde probe visualiseren en het expressiepatroon van de endogene transcript onthullen. Representatieve resultaten worden getoond van succesvolle experimenten en typische suboptimale experimenten.

Deze hele mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie protocol bespreekt kritische stappen die reproduceerbare resultaten van hoge kwaliteit voor genexpressie studies te waarborgen in E8.5-E11.5 dagen oude muis embryo&#39;s.

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

Whole mount in situ hybridisatie is een zeer informatieve methode om genexpressiepatronen in embryo's te bepalen. De in situ hybridisatieprocedures ...

Het algemene doel van deze procedure is het definiëren van genexpressiepatronen in volledige muizenembryo's. Dit wordt bereikt door eerst een specifieke riboprobe te ontwerpen en te genereren voor het gen van belang. Vervolgens worden de embryo's verzameld en behandeld voor hybridisatie.Vervolgens wordt de gelabelde probe gehybridiseerd met de embryo's. De laatste stap is het visualiseren van de gehybridiseerde probe door middel van immunohistochemische detectie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die genexpressiepatronen in volledige embryo's of embryonale secties laten zien.Na beeldvorming met een stereodissectiemicroscoop of een reguliere brightfield-microscoop, zullen personen die nieuw zijn met deze methode over het algemeen moeite hebben omdat de in situ hybridisatieprocedures langdurig en technisch veeleisend zijn; er zijn meerdere belangrijke stappen die gezamenlijk bijdragen aan de kwaliteit van het uiteindelijke resultaat. Genereer eerst template-DNA door de sequentie van belang te amplificeren met genspecifieke PCR-primers die zijn ontworpen met farge-transcriptiepromotorsequenties aan de 5'-uiteinden. Zuiver vervolgens het PCR-product en voeg een proteinase

whole-mount-in-situ-hybridization-of-e85-to-e115-mouse-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont twee-kleuren ganse berg in situ hybridisatie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressie patroon van twee verschillende genen kunnen worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham en David Ish-Horowicz.

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.

Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo&#39;s

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor...

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

We presenteren hier een geoptimaliseerd protocol om foetale muizen te genotyperen, kleuren en voorbereiden voor de beeldvorming van perifere nociceptor axon projecties in het hele dier, als een effectieve methode om sensorische axon groei fenotypen te beoordelen in zich ontwikkelende genetisch gemodificeerde muizen.

Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties

We demonstreren een methode voor het enten van gekweekte cellen in specifieke delen van vroege muis-embryo's om hun in vivo potentieel te bepalen. We introduceren ook een geoptimaliseerde elektroporatiemethode die glazen capillairen van bekende diameter gebruikt, waardoor de nauwkeurige levering van exogeen DNA in een paar cellen in de embryo's mogelijk wordt.

Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo&#39;s

We beschrijven een gedetailleerd protocol met behulp van hoog-resolutie episcopische microscopie om driedimensionale (3D) beelden van muis-embryo's te verkrijgen. Dit verbeterde protocol maakt gebruik van een gemodificeerde weefselvoorbereidingsmethode om de penetratie van de fluorescente kleurstof te verbeteren, waardoor morfometrische analyse van zowel kleine als grote specimen mogelijk wordt gemaakt.

Rapid Overname van 3D-beelden met behulp van hoge-resolutie episcopische Microscopie

Het knooppunt en de notochordal plaat zijn voorbijgaande signalering organisatoren in het ontwikkelen van muis-embryo's die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van verschillende technieken. Hier beschrijven we in detail hoe uit te voeren van twee van de technieken voor het bestuderen van hun structuur en morfogenese: 1) scanning elektronen microscopie (SEM); en 2) hele mount immunofluorescentie (WMIF).

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

We presenteren de protocollen te onderzoeken muis hart ontwikkelen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende op muis embryo's ontleed van ventriculaire specifieke MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen. Deze methode laat ons direct visualiseren van elke fase van de ventriculaire formatie tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis zonder arbeidsintensieve histochemische methoden.

Analyse van de ontwikkeling van de cardiale kamer tijdens muis embryogenese met hele Mount Epifluorescence

Klassiek is het endocardium van de embryonale klep primordium van de muis geanalyseerd met behulp van transversale, coronale of sagittale secties. Onze nieuwe benadering voor en face, tweedimensionale beeldvorming van het endocardium in valvulogene gebieden maakt planaire polariteit en celherschikkingsanalyse van het endocardium mogelijk tijdens de ontwikkeling van de klep.

En Gezicht Endocardiale kussenvoorbereiding voor planaire morfogeneseanalyse bij muizenembryo's

Dit artikel stelt een pijplijn op voor hoogwaardige eencellige en kernsuspensies van gastrulerende muizenembryo's voor sequencing van individuele cellen en kernen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

Leer whole mount in situ hybridisatie voor genexpressiepatronen in muisembryo's (E8.5-E11.5). Deze methode maakt betrouwbare visualisatie van genfunctie tijdens embryogenese mogelijk voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Hele Mount

Meer video's verkennen