HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

Het algemene doel van deze procedure is het gebruik van kunstmatige antigeenpresenterende cellen of een aAPC voor de ex vivo expansie van menselijke antigeenspecifieke CTL voor potentieel gebruik in adoptieve immunotherapie. Dit wordt bereikt door eerst HLA-A2-Ig en een anti-humane CD28 monoklonaal antilichaam te conjugeren aan magnetische Dynabeads om aAPC's te maken. De tweede stap van de procedure is het uitvoeren van kwaliteitscontrole en peptidebelading van de aAPC's. De derde stap van de procedure is het isoleren van humane perifere bloed CD8-positieve T-cellen. De laatste stap van de procedure is het incuberen van CD8-positieve T-cellen met aAPC's gedurende een week.

De CTL worden vervolgens geoogst en gekarakteriseerd voordat ze worden gebruikt of gedurende nog een week opnieuw worden gestimuleerd om het gewenste niveau van specificiteit en expansie te bereiken. Uiteindelijk kunnen resultaten van titratie of kleuring worden verkregen die aantonen dat CTL die zijn uitgebreid in de aanwezigheid van A A PC een verhoogde antigeenspecificiteit hebben. Vandaag ga ik u een HI IG-gebaseerd A A PC-systeem laten zien en hoe u dit systeem kunt gebruiken om CMV-specifieke menselijke CTL exvivo efficiënter uit te breiden in vergelijking met andere bestaande methoden.

Onze A A PC-technologie biedt verschillende belangrijke voordelen. Het is direct leverbaar, in onbeperkte hoeveelheid beschikbaar en A A PC kan worden gebruikt voor alle HRAA twee positieve donoren. Oké, laten we beginnen. Breng 1 mL M four 50 epoxy-beads uit een voorraad van ongeveer 400 miljoen beads over naar een steriel glazen flacon met schroefdop.

Was de beads één keer door één milliliter boid buffer toe te voegen en het glazen vial vervolgens tegen een dyin all magnet NBC one te plaatsen, terwijl de beads aan de wand van het vial kleven. Verwijder het supernatant door aspiratie. Resuspendeer de beads in een mengsel van boid buffer HLA A twee IG dimer en anti-human CD 28 monoklonaal antilichaam.

Om vervolgens de conjugatie van eiwit aan de kraal te vergemakkelijken, wordt het glazen vial 24 uur lang bij vier graden Celsius op een rotator gedraaid. Plaats de buis daarna in een MPC one magnet en verwijder alle boraatbuffer. Nadat de buffer is verwijderd, worden de kralen twee keer gewassen met één milliliter bead wash buffer.

Incubeer de kraaltjes nu in één milliliter bead wash buffer en roteer het vial bij vier graden Celsius gedurende nog eens 24 uur om de resterende eiwitbindingsplaatsen op de kraaltjes te blokkeren. Verwijder vervolgens de buffer uit het glazen vial en vervang deze door één milliliter verse bead wash buffer. Breng 100 microliters fax washing buffer over naar fax-buisjes en voeg vervolgens vijf keer 10⁵ kraaltjes toe.

Kleur de beads met één µL anti muse IgG, één PE en één µL anti muse IgG twee, waarna ze 20 minuten lang bij 4 °C worden gekleurd. Voeg drie mL fax-wasbuffer toe aan elk van de kleuringsmonsters. Pelleteer vervolgens de A A PC door te centrifugeren bij 300 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C.

Resuspendeer de A A PC in verse fax-buffer en lees het kleuringsresultaat onmiddellijk af met een flowcytometer. Was de beads tweemaal met steriele PBS zoals eerder beschreven. Laad de beads vervolgens met 10 µL CMV-peptide.

Tel de beads met een hemocytometer en label ze vervolgens met de datum en de concentratie van de beads, uitgedrukt in beads per milliliter. Incubeer de A A PC met het peptide gedurende ten minste drie dagen bij 4 °C. Centrifugeer ongeveer 100 milliliters vers perifeer bloed van een HLA A2-positieve donor in 10 sodiumheparine vacutainer-buizen bij 300 ×g gedurende 10 minuten.

Verwijder bij kamertemperatuur voorzichtig de bovenste plasmalaag door aspiratie. Vervang het verzamelde plasma door steriele PBS en breng het bloed over naar een steriele T 75 kweekfles. Meng het bloed en de PBS goed door middel van pipetteren zodra al het bloed is verzameld in 15 milliliter fial pack plus vier 50 milliliter conische buizen.

Breng langzaam 30 tot 35 milliliter van de bloedcellen aan bovenop het fial in elke buis. Centrifugeer het bloed en de fial-gradiënt bij 500 GS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, waarbij de interface tussen het fial en de bloedcellen duidelijk gescheiden blijft; stel de rem en de versnelling zo laag mogelijk in om een scherpe interface tussen de lagen te behouden. Aspireer na het centrifugeren de bovenste plasmalaag en gebruik vervolgens een serologische pipette om voorzichtig de PBMC-laag te aspireren. Draag de PBMC over naar een schone conische buis van 50 milliliter. Wanneer alle PBMC zijn geoogst, voeg dan 30 milliliter PBS toe aan de cellen en centrifugeer deze.

Vervolgens wordt het supernatant weggegooid en het pellet gewassen. Was nogmaals met 30 milliliters PBS om het resterende fi te verwijderen, en verrijk vervolgens de CD8-positieve T-celpopulatie met behulp van een Milton Human CD8-positieve T-cel isolatiekit. Tel de CD8-positieve T-cellen volgens het protocol van de fabrikant en bevestig de zuiverheid via FACS-analyse.

Suspendeer 1 miljoen CTL in acht milliliters T-celgroeifactor twee x culturemedium plus acht milliliters compleet RPMI-medium en voeg één keer 10^6 AP C-mix toe. Gebruik vervolgens een multichannelpipet om 160 µL cellen per putje uit te platen op een 96-wells U-bodem weefselkweekplaat. Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO₂ gedurende zeven dagen.

Voed de cellen op dag vier met 80 µL per well T-celgroeifactor 2 x cultuurmedium. Oogst de cellen op dag zeven en plaats de cellen vervolgens tegen de magneet om de oude A A PC te verwijderen wanneer alle beads aan de wand van het vial hechten.

Oogst de cellen en breng deze over naar een andere conische buis van 50 milliliter en tel het aantal cellen. Bepaal de antigeenspecificiteit van de A A PC via tetrameerkleuring volgens het protocol van de fabrikant. Herhaal de procedure met de geoogste cellen en nieuwe A A PC onder dezelfde omstandigheden om een hoger aantal cellen met antigeenspecificiteit te genereren.

Hier is een representatief tetrameerkleuringsresultaat van CMV-specifieke CTL's gegenereerd door A A PC na één week kweek. Hier wordt een representatief resultaat van intracellulaire cytokinekleuring getoond van CMV-specifieke CTL's gegenereerd door A-A-P-C-C-M-V; de specificiteit was 61% volgens tetrameerkleuring. Deze methode kan worden gebruikt om cruciale vragen in het T-celveld te beantwoorden, zoals hoe we de optimale kweekcondities kunnen identificeren en wat de vereisten zijn voor functionele modulatie van T-cellen.

De methode van Lowly bood inzichten in de behandeling van virale ziekten. Deze kan ook worden toegepast in andere vakgebieden, zoals bij kanker.