Name: HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Leer een efficiënte methode voor ex vivo expansie van menselijke antigeen-specifieke CTL met HLA A2-Ig gebaseerde kunstmatige antigeen presenterende cellen. Deze techniek verbetert adoptieve immunotherapie door schaalbare T-celproductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Aaron Selya bedanken voor nuttige discussie. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​AI29575, CA108835, AI077097 aan JS, een pilot subsidie ​​van de Johns Hopkins Malaria Research Institute en het ministerie van Defensie verlenen PC 040.972 aan MO

1. Maken, HLA-A2-Ig op basis van aAPC <ol><li> Bereid steriel boraatbuffer <ol><li> Los boorzuur in water om 0,1 te maken. Stel de pH op 7,0. </li><li> Filtreer door een 0.22μm steriele filter en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereid steriele Bead Wash buffer <ol><li> Neem 956ml PBS w / o magnesium of calcium. </li><li> Voeg 30ml menselijke AB serum. </li><li> Voeg EDTA 2 mM uiteindelijke concentratie. </li><li> Voeg 0.1gsodium azide. </li><li> Filtreer door een 0,22 um filter steriel en bewaar bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Neem 1 ml Invitrogen M-450 Epoxy kralen uit voorraad, ongeveer 400 miljoen kralen (kralen kunnen worden geteld door hemocytometer), en in een steriele, schroef top glazen flacon. </li><li> Zet de flacon tegen een Dynal magneet MPC-1, terwijl de kralen houden aan de zijkant van de flacon, de bovenstaande vloeistof door aspiratie. Een keer wassen kralen met 1 ml boraatbuffer. </li><li> Resuspendeer kralen in een mengsel van 1 ml boraatbuffer en 20 ug van HLA-A2-Ig dimeer en 20 ug van anti-humaan CD28 mAb (Clone 9.3). </li><li> Eiwit tot hiel conjugatie: zet de glazen flacon op rotator en draaien bij 4 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Plaats de buis in MPC-1 magneet en verwijder alle boraatbuffer. </li><li> Twee keer was de korrels met 1 ml Bead Wash buffer. </li><li> Incubeer de kralen in 1 ml Bead Wash buffer, draai bij 4 ° C gedurende 24 uur. Omdat Bead Wash buffer bevat humaan AB-serum, dan zullen alle resterende eiwit bindingsplaats blok op de kralen. </li><li> Verwijder het supernatant van glazen flesje, te vervangen door 1 ml verse Bead Wash buffer. </li></ol> 2. Kwaliteitscontrole van aAPC en peptide laden, opslag <ol><li> Voeg ~ 5 × 10 5 kralen om 100μl FACS wasbuffer in FACS buizen, en de vlek met 1μl van anti-muis IgG 1-PE (erkennen dat het Fc deel van HLA-A2-Ig) en 1μl van anti-muis IgG2a-FITC (te herkennen het Fc-gedeelte van de anti-CD28 mAb). Na kleuring voor 20 minuten in FACS wasbuffer, weer wassen en onmiddellijk lees de vlekken resultaat door flowcytometer (figuur 4). </li><li> Peptide het laden op de parels: twee keer was de parels in de glazen flacon met 1 ml steriel PBS. Resuspendeer met 1 ml steriele PBS en voeg dan 10μl van CMV-peptide (1mg/ml) </li><li> Tellen de parels van hemocytometer, en het etiket van het flesje met datum en concentratie. </li><li> aAPC zijn klaar voor gebruik na ten minste 3 dagen peptide incubatie bij 4 ° C, om voldoende tijd van de peptide binding maken op het HLA-A2-Ig dimeer. De kralen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C en blijven functioneel voor minstens zes maanden. </li></ol> 3. Human CTL isolatie <ol><li> Verzamel ~ 100 ml vers perifeer bloed van gezonde HLA-A2 positieve donor in 10 BD natriumheparine Vacutainer buizen. Gebruik een 21-gauge naald of groter om hemolyse te voorkomen. </li><li> Centrifugeer bij 300xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur </li><li> Verwijder voorzichtig de bovenste laag plasma door aspiratie. Het plasma kan worden gebruikt als aanvulling voor het kweekmedium. </li><li> Vervang de verzamelde plasma met steriele PBS en breng het bloed in een steriele T75 cultuur fles of 50 ml conische buizen. Meng de bloed met PBS goed door en neer te pipetteren. </li><li> Zodra al het bloed is verzameld, voor te bereiden vier extra 50 ml conische buizen en voeg 15 ml van Ficoll-Paque Plus. </li><li> Langzaam overlay 30-35ml van bloedcellen op de top van de Ficoll van elke buis. Houd de interface tussen de verschillende Ficoll en bloedcellen. </li><li> Centrifugeer bij 500xg gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Draai de rem "uit" en de versnelling zo laag mogelijk om een ​​duidelijke interface tussen de lagen te behouden. </li><li> Met behulp van een seriological pipet voorzichtig zuigen de PBMC laag en het verzamelen van de PBMC in een frisse 50ml conische buis. Als alle PBMC worden geoogst toe te voegen 30 ml PBS en spin op 400xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en wassen nog een keer met 30 ml PBS alle overblijvende Ficoll te verwijderen. </li><li> Ga verder met CD8 + T-cellen geïsoleerd door gebruik te maken Miltenyi menselijke CD8 + T-cel-isolatie kit volgens de fabrikant protocol. Deze kit verrijkt zeer voor de CD8 + cellen (gewoonlijk&gt; 95%) door afbrekende CD8 - cellen. </li><li> Tel de CD8 + T-cellen. De verwachte zuiverheid moet groter zijn dan 95%. Om dit te gebruiken 2x10 5 cellen te bevestigen en uitvoeren van een CD4/3/8 FACS-analyse. De resterende CTL kan worden meteen gebruikt voor antigeen-specifieke aAPC stimulatie of ze kunnen worden ingevroren voor toekomstig gebruik. </li></ol> 4. In vitro aAPC op basis van cultuur-systeem <ol><li> Bereid kweekmedium <ol><li> Voor TF (T-cel groeifactor, gemaakt in het lab 4) 2X kweekmedium: volledige RPMI-medium plus 5% autoloog plasma donor en 8% T-cel groeifactor. </li><li donor autoloog plasma kan worden vervangen door hitte-ge humaan ab serum.></ol></li><li> Resuspendeer miljoen CTL in 8 ml van de TF 2X kweekmedium plus 8 ml van de volledige RPMI-medium, voeg 1 × 10 6 aAPC, goed mengen. </li><li> Gebruik een multi-channel pipetter to plate cellen op 96 en U-bodem weefselkweek platen. (160 ul per putje) </li><li> Cultuur-cellen in 37 ° C, 5% CO 2 incubater gedurende 7 dagen. Voeden de cellen op dag 4 met 80 ul / putje TF 2X medium. </li><li> Cellen zijn klaar om te worden geoogst op dag 7. Na de oogst, plaats de cellen tegen de magneet en verwijder de oude aAPC. </li><li> Antigen specificiteit kan worden bepaald door tetrameer kleuring volgens protocol van de fabrikant. Fenotype vlekken en intracellulaire cytokine kleuring worden uitgevoerd volgens onze vorige studie 3. </li><li> Geoogste cellen kunnen worden opnieuw uitgeplaat met aAPC weer onder dezelfde voorwaarden. Aantal cellen en antigen specificiteit zal naar verwachting toenemen na herhaalde stimulatie. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van aAPC na HLA A2-Ig-en anti-CD28 conjugatie is weergegeven in Figuur 4. Succesvolle eiwit conjugatie is duidelijk door een duidelijke verschuiving van overeenkomstige antilichaam kleuring. Terwijl de frequentie van de CMV specifieke CTL in het perifere bloed is meestal 0,5-1%, na een enkele week van aAPC-gemedieerde stimulatie, kan de specificiteit te bereiken 55 tot 93% (figuur 2 en 3). De uitbreiding van antigeen specifieke CTL kan zeer variabel tussen de verschillende donoren, maar de resultaten reproduceerbaar zijn binnen dezelfde donor. Door extrapolatie, kan de uitbreiding van CMV specifieke cellen duizenden keer worden vergeleken met het niveau direct voorloper ex vivo (gegevens niet getoond). Intracellulaire cytokine kleuring (figuur 3) laat zien dat deze uitgebreid CTL zijn polyfunctioned, in plaats van uitgeput, na een langdurige celcultuur en significante proliferatie. <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Vertegenwoordiger stroomschema van aAPC op basis van ex vivo expansie van menselijke CTL voor adoptieve immunotherapie in allogene HSCT <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vertegenwoordiger tetrameer kleuren gevolg van CMV specifieke CTL gegenereerd door aAPC na een week van de cultuur <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Vertegenwoordiger van intracellulaire cytokine kleuring gevolg van CMV specifieke CTL gegenereerd door aAPC (CMV specificiteit was 61%) <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Vertegenwoordiger vlekken gevolg van de M-450 Epoxy kralen na het eiwit conjugatie gekleurd met anti-muis IgG 1-PE en anti-muis IgG2-FITC

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

Het aAPC systeem dat we hier beschrijven is een efficiënt systeem voor het ex vivo expansie van de menselijke CTL tegen een verscheidenheid van antigenen. Speciale aandacht moet worden genomen met betrekking tot de kwaliteit van het eiwit conjugatie en de gelijkmatige verdeling van aAPC en CTL in de 96-well plaat cultuur. Met behulp van deze aanpak hebben we in staat om uit te breiden CTL al meer dan 8 weken, waarin we antigeen-specifieke CTL uitgebreid tot een miljoen maal 4. Er zijn verschillende kunstmatige APC systemen met gebruik van cellijnen of andere acellulair platforms 5, maar op basis van de gepubliceerde gegevens elk systeem heeft zijn unieke profiel met betrekking tot uitbreiding en specificiteit ondersteunen van verschillende toepassingen. Belangrijk, omdat de kwaliteit van de CTL is even belangrijk als kwantiteit, zijn de polyfunctionality van de CMV-specifieke CTL gegenereerd door ons systeem zal naar verwachting een superieure anti-virale efficiëntie te verlenen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Vacutainer buis (bevat heparine) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367874 </td></tr><tr><td> Menselijke CD8 + T-cel-isolatie kit </td><td> Miltenyi </td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td> Dynabeads M-450 Epoxy </td><td> Invitrogen </td><td> 140,11 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-1 Magneet </td><td> Invitrogen </td><td> 120-01D </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RPMI-medium 1640 </td><td> Gibco </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> HLA-A2-Ig-dimeer X </td><td> Becton Dickinson </td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC tetrameer (HLA-A2-CMV)-PE </td><td> Beckman Coulter </td><td> T20099 </td></tr><tr><td> Falcon heldere 96-well plaat Microtest </td><td> Becton Dickinson </td><td> 353077 </td></tr><tr><td> Rat anti-muis IgG2a-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 553390 </td></tr><tr><td> Geit anti-muis IgG 1-PE </td><td> Invitrogen </td><td> P21129 </td></tr><tr><td> Humaan serum type AB </td><td> Atlanta biologicals </td><td> S40110 </td></tr><tr><td> Muizen anti-humaan CD8a-FITC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0772 </td></tr><tr><td> Muizen anti-humaan CD8a-APC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340684 </td></tr><tr><td> Muizen anti-humaan IFNy-FITC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340449 </td></tr><tr><td> Muizen anti-humaan TNFa-PE </td><td> Becton Dickinson </td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

hla-ig based artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte ex vivo uitbreiding van de mens ctl

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL met optimale effectorfunctie spelen cruciale rol in het mediëren van bescherming tegen diverse intracellulaire infecties en kanker. Echter, kunnen individuen vertonen onderdrukkende immuun micro-omgeving en, in tegenstelling tot het activeren van CTL, hun autologe antigeen presenterende cellen kan de neiging om tolerize of anergize antigen specifieke CTL. Als gevolg daarvan, hoewel nog steeds in de experimentele fase, heeft CTL-based adoptieve immunotherapie ontwikkeld tot een veelbelovende behandeling voor verschillende ziekten, zoals kanker en virusinfecties worden. In eerste experimenten ex vivo uitgebreid CMV (cytomegalovirus) specifieke CTL zijn gebruikt voor de behandeling van CMV-infectie bij immuungecompromitteerde allogene beenmerg transplantatie patiënten. Hoewel het gebruikelijk om levensbedreigende CMV viremie hebben bij deze patiënten, geen van de patiënten die uitgebreid CTL ontwikkelen CMV gerelateerde ziekte, wat de anti-CMV immuniteit is vastgesteld door de adoptief overgedragen CTL 1. Veelbelovende resultaten zijn ook waargenomen voor melanoom en kan worden uitgebreid tot andere vormen van kanker 2. Hoewel er zijn vele manieren om ex vivo te stimuleren en uit te breiden menselijke CTL, worden de huidige benaderingen beperkt door de kosten en de technische beperkingen. Bijvoorbeeld, is de huidige gouden standaard gebaseerd op het gebruik van autologe DC. Dit vereist elke patiënt om te doneren een aanzienlijk aantal leukocyten en is ook erg duur en bewerkelijk. Bovendien heeft gedetailleerde in vitro karakterisatie van DC uitgebreid CTL bleek dat deze slechts suboptimaal effector functie 3 hebben. Hier presenteren wij een zeer efficiënte aAPC gebaseerd systeem voor ex vivo expansie van de menselijke CMV specifieke CTL voor adoptieve immunotherapie (figuur 1). De aAPC werden gemaakt door de koppeling van cel-sized magnetische korrels met menselijke HLA-A2-Ig dimeer en anti-CD28mAb 4. Zodra aAPC zijn gemaakt, kunnen ze worden geladen met verschillende peptiden van belang, en blijven functioneel voor maanden. In dit rapport werden aAPC geladen met een dominante peptide van CMV, pp65 (NLVPMVATV). Na het kweken gezuiverd humaan CD8 + CTL van een gezonde donor met aAPC voor een week, kan CMV specifieke CTL drastisch worden verhoogd in specificiteit tot 98% (figuur 2) en versterkt meer dan 10.000 keer. Als er meer CMV-specifieke CTL nodig zijn, kan een verdere uitbreiding eenvoudig worden bereikt door repetitieve stimulatie met aAPC. Fenotypische en functionele karakterisatie toont deze geëxpandeerde cellen hebben een effector-geheugen fenotype en maken grote hoeveelheden van zowel TNFa en IFNy (figuur 3).

Een nieuwe DC-onafhankelijke methode voor de inductie en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen wordt beschreven. HLA A2-Ig op basis van kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) zijn geladen met HLA-A2 beperkt peptiden om efficiënt uit te breiden CTL van diverse antigen specificiteit. Deze technologie biedt veel mogelijkheden voor CTL-op basis van adoptieve immunotherapie.

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

CTL's met een optimale effectorfunctie spelen een cruciale rol bij het bemiddelen van bescherming tegen diverse intracellulaire infecties en kanker. Echter, individuen ...

Het algemene doel van deze procedure is het gebruik van kunstmatige antigeenpresenterende cellen of een aAPC voor de ex vivo expansie van menselijke antigeenspecifieke CTL voor potentieel gebruik in adoptieve immunotherapie. Dit wordt bereikt door eerst HLA-A2-Ig en een anti-humane CD28 monoklonaal antilichaam te conjugeren aan magnetische Dynabeads om aAPC's te maken. De tweede stap van de procedure is het uitvoeren van kwaliteitscontrole en peptidebelading van de aAPC's. De derde stap van de procedure is het isoleren van humane perifere bloed CD8-positieve T-cellen. De laatste stap van de procedure is het incuberen van CD8-positieve T-cellen met aAPC's gedurende een week.De CTL worden vervolgens geoogst en gekarakteriseerd voordat ze worden gebruikt of gedurende nog een week opnieuw worden gestimuleerd om het gewenste niveau van specificiteit en expansie te bereiken. Uiteindelijk kunnen resultaten van titratie of kleuring worden verkregen die aantonen dat CTL die zijn uitgebreid in de aanwezigheid van A A PC een verhoogde antigeenspecificiteit hebben. Vandaag ga ik u een HI IG-gebaseerd A A PC-systeem laten zien en hoe u dit systeem kunt gebruiken om CMV-specifieke menselijke CTL exvivo efficiënter uit te breiden in vergelijking met andere bestaande methoden.Onze A A PC-technologie biedt verschillende belangrijke voordelen. Het is direct leverbaar, in onbeperkte hoeveelheid beschikbaar en A A PC kan worden gebruikt voor alle HRAA twee positieve donoren. Oké, laten we beginnen. Breng 1 mL M four 50 epoxy-beads uit een voorraad van ongeveer 400 miljoen beads over naar een steriel glazen flacon met schroefdop.Was de beads één keer door één milliliter boid buffer toe te voegen en het glazen vial vervolgens tegen een dyin all magnet NBC one te plaatsen, terwijl de beads aan de wand van het vial kleven. Verwijder het supernatant door aspiratie. Resuspendeer de beads in een mengsel van boid buffer HLA A twee IG dimer en anti-human CD 28 monoklonaal antilichaam.Om vervolgens de conjugatie van eiwit aan de kraal te vergemakkelijken, wordt het glazen vial 24 uur lang bij vier graden Celsius op een rotator gedraaid. Plaats de buis daarna in een MPC one magnet en verwijder alle boraatbuffer. Nadat de buffer is verwijderd, worden de kralen twee keer gewassen met één milliliter bead wash buffer.Incubeer de kraaltjes nu in één milliliter bead wash buffer en roteer het vial bij vier graden Celsius gedurende nog eens 24 uur om de resterende eiwitbindingsplaatsen op de kraaltjes te blokkeren. Verwijder vervolgens de buffer uit het glazen vial en vervang deze door één milliliter verse bead wash buffer. Breng 100 microliters fax washing buffer over naar fax-buisjes en voeg vervolgens vijf keer 10⁵ kraaltjes toe.Kleur de beads met één µL anti muse IgG, één PE en één µL anti muse IgG twee, waarna ze 20 minuten lang bij 4 °C worden gekleurd. Voeg drie mL fax-wasbuffer toe aan elk van de kleuringsmonsters. Pelleteer vervolgens de A A PC door te centrifugeren bij 300 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C.Resuspendeer de A A PC in verse fax-buffer en lees het kleuringsresultaat onmiddellijk af met een flowcytometer. Was de beads tweemaal met steriele PBS zoals eerder beschreven. Laad de beads vervolgens met 10 µL CMV-peptide.Tel de beads met een hemocytometer en label ze vervolgens met de datum en de concentratie van de beads, uitgedrukt in beads per milliliter. Incubeer de A A PC met het peptide gedurende ten minste drie dagen bij 4 °C. Centrifugeer ongeveer 100 milliliters vers perifeer bloed van een HLA A2-positieve donor in 10 sodiumheparine vacutainer-buizen bij 300 ×g gedurende 10 minuten.Verwijder bij kamertemperatuur voorzichtig de bovenste plasmalaag door aspiratie. Vervang het verzamelde plasma door steriele PBS en breng het bloed over naar een steriele T 75 kweekfles. Meng het bloed en de PBS goed door middel van pipetteren zodra al het bloed is verzameld in 15 milliliter fial pack plus vier 50 milliliter conische buizen.Breng langzaam 30 tot 35 milliliter van de bloedcellen aan bovenop het fial in elke buis. Centrifugeer het bloed en de fial-gradiënt bij 500 GS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, waarbij de interface tussen het fial en de bloedcellen duidelijk gescheiden blijft; stel de rem en de versnelling zo laag mogelijk in om een scherpe interface tussen de lagen te behouden. Aspireer na het centrifugeren de bovenste plasmalaag en gebruik vervolgens een serologische pipette om voorzichtig de PBMC-laag te aspireren. Draag de PBMC over naar een schone conische buis van 50 milliliter. Wanneer alle PBMC zijn geoogst, voeg dan 30 milliliter PBS toe aan de cellen en centrifugeer deze.Vervolgens wordt het supernatant weggegooid en het pellet gewassen. Was nogmaals met 30 milliliters PBS om het resterende fi te verwijderen, en verrijk vervolgens de CD8-positieve T-celpopulatie met behulp van een Milton Human CD8-positieve T-cel isolatiekit. Tel de CD8-positieve T-cellen volgens het protocol van de fabrikant en bevestig de zuiverheid via FACS-analyse.Suspendeer 1 miljoen CTL in acht milliliters T-celgroeifactor twee x culturemedium plus acht milliliters compleet RPMI-medium en voeg één keer 10^6 AP C-mix toe. Gebruik vervolgens een multichannelpipet om 160 µL cellen per putje uit te platen op een 96-wells U-bodem weefselkweekplaat. Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO₂ gedurende zeven dagen.Voed de cellen op dag vier met 80 µL per well T-celgroeifactor 2 x cultuurmedium. Oogst de cellen op dag zeven en plaats de cellen vervolgens tegen de magneet om de oude A A PC te verwijderen wanneer alle beads aan de wand van het vial hechten.Oogst de cellen en breng deze over naar een andere conische buis van 50 milliliter en tel het aantal cellen. Bepaal de antigeenspecificiteit van de A A PC via tetrameerkleuring volgens het protocol van de fabrikant. Herhaal de procedure met de geoogste cellen en nieuwe A A PC onder dezelfde omstandigheden om een hoger aantal cellen met antigeenspecificiteit te genereren.Hier is een representatief tetrameerkleuringsresultaat van CMV-specifieke CTL's gegenereerd door A A PC na één week kweek. Hier wordt een representatief resultaat van intracellulaire cytokinekleuring getoond van CMV-specifieke CTL's gegenereerd door A-A-P-C-C-M-V; de specificiteit was 61% volgens tetrameerkleuring. Deze methode kan worden gebruikt om cruciale vragen in het T-celveld te beantwoorden, zoals hoe we de optimale kweekcondities kunnen identificeren en wat de vereisten zijn voor functionele modulatie van T-cellen.De methode van Lowly bood inzichten in de behandeling van virale ziekten. Deze kan ook worden toegepast in andere vakgebieden, zoals bij kanker.

hla-ig-based-artificial-antigen-presenting-cells-for-efficient-ex

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.

Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus

Hier beschrijven we een werkwijze voor het activeren en uitbreiden menselijke NKT cellen van bulk T-celpopulaties met kunstmatige antigen presenterende cellen (AAPC). Het gebruik van CD1d gebaseerde AAPC een gestandaardiseerde werkwijze voor het genereren van grote aantallen functionele NKT cellen.

Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen

Richtlijnen gepresenteerd voor het genereren van killer kunstmatige antigeenpresenterende cellen, KaAPC, een efficiënt hulpmiddel voor in vitro depletie van humane antigeen-specifieke T-cellen en een alternatieve oplossing voor cellulaire immunotherapie voor de behandeling van T-cel gemedieerde auto-immuunziekten in een antigen specifieke manier, zonder afbreuk te doen aan de resterende immuunsysteem.

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient In Vitro Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Dit artikel beschrijft een methode voor de generatie en proliferatie van humane T-celklonen die specifiek reageren op een gedefinieerd allo-antigen. Dit protocol kan worden aangepast voor het klonen van humane T-cellen die specifiek zijn voor een verscheidenheid aan peptide-MHC-liganden.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

Hierin beschrijven we een nieuwe methode om antigeenspecifieke T-celreceptoren (TCR's) door het koppelen van de TCRα of TcR van een bestaande TCR, bezit de antigeen-specificiteit van interesse, met aanvullende hemichain van de perifere T-cel receptor repertoire genereren. De novo geproduceerde TCRs behouden antigeen-specificiteit met verschillende affiniteit.

Generating<em&gt; De Novo</em&gt; Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain

Hier presenteren we een protocol voor het snel en reproducibly genereren van biologisch geïnspireerde, biologisch afbreekbare articifical antigeen presentatie van cellen (aAPC) met afstembare grootte, vorm en oppervlakte-proteïne presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo .

Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

Antigeen-specifieke T-cellen zijn moeilijk te karakteriseren of frametechnieken gebruiken in therapieën vanwege hun extreem lage frequentie. Hierin bieden we een protocol voor de ontwikkeling van een magnetische deeltjes die aan antigeen-specifieke T-cellen binden kan te verrijken van deze cellen en vervolgens uit te breiden ze verschillende keer voor zowel de karakterisering en de therapie.

Verrijken en uit te breiden van zeldzame Antigen-specifieke T-cellen met magnetische nanodeeltjes

Dit protocol beschrijft het gebruik van één keten MHC klasse I complexen te onderzoeken van de moleculaire interacties in menselijke CD8 + T cel activatie: generatie van gemanipuleerde antigeen presentatie van cellen uiten van één keten bouwt, cultuur van menselijke CD8 + T cel kloon en T-cel activatie experimenten.

Gebruik van één keten MHC technologie te onderzoeken van Co-agonisme in menselijke CD8 + T cel activatie

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Gepresenteerd is een protocol voor de uitbreiding van Gamma-Delta (γδ) T-cel geneesmiddel product. Lymfocyten worden geïsoleerd door elutriatie en γδ-verrijkt met zoledroninezuur en interleukine-2. Alfa-bèta T-cellen worden uitgeput met behulp van een magnetisch scheidingsapparaat van klinische kwaliteit. De γδ-cellen worden samen met K562-afgeleide, kunstmatige antigeen-presenterende cellen en uitgebreid.

Uitbreiding en verrijking van gamma-delta (γδ) T-cellen uit ontfereend menselijk product

Leer een efficiënte methode voor ex vivo expansie van menselijke antigeen-specifieke CTL met HLA A2-Ig gebaseerde kunstmatige antigeen presenterende cellen. Deze techniek verbetert adoptieve immunotherapie door schaalbare T-celproductie.

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

Meer video's verkennen