HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL
11 april 2011
Een nieuwe DC-onafhankelijke methode voor de inductie en de uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen wordt beschreven. HLA A2-Ig op basis van kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) zijn geladen met HLA-A2 beperkt peptiden om efficiënt uit te breiden CTL van diverse antigen specificiteit. Deze technologie biedt veel mogelijkheden voor CTL-op basis van adoptieve immunotherapie.
Het algemene doel van deze procedure is om kunstmatige antigeen presenterende cellen of een APC te gebruiken voor ex vivo expansie van humane antigeen specifieke CTL voor mogelijk gebruik in adoptieve immunotherapie. Dit wordt bereikt door eerst HLA A twee IG en anti-menselijke CD 28 monoklonaal antilichaam te binden aan magnetische dyna-parels om een APC te maken. De tweede stap van de procedure is om kwaliteitscontrole en peptide lading van de APC uit te voeren. De derde stap van de procedure is om humane perifere bloed CD acht positieve T-cellen te isoleren. De laatste stap van de procedure is om CD acht positieve T-cellen een week lang met een APC te incuberen.
De CTL worden vervolgens geoogst en gekarakteriseerd voordat ze worden gebruikt of opnieuw worden gestimuleerd gedurende een week om het gewenste niveau van hun specificiteit en expansie te bereiken. Uiteindelijk kunnen tumor- of kleuringsresultaten worden verkregen die laten zien dat CTL die worden uitgebreid in de aanwezigheid van een APC een verhoogde antigeenspecificiteit hebben. Vandaag ga ik je een HI IG gebaseerd APC-systeem laten zien en hoe je dit systeem kunt gebruiken om efficiënt CMV specifieke humane CTL exvivo te expanderen in vergelijking met andere bestaande methoden.
Onze APC technologie biedt verschillende belangrijke voordelen. Het is kant-en-klaar verkrijgbaar, het is in onbeperkte hoeveelheid beschikbaar en laten we zeggen dat APC kan worden gebruikt voor alle HRAA twee positieve donoren. Oké, laten we beginnen met het overbrengen van één milliliter van M vier 50 epoxy-parels uit een voorraad van ongeveer 400 miljoen parels naar een steriele schroefbuis.
Was de parels eenmaal door één milliliter boid-buffer toe te voegen en vervolgens de glazen flacon tegen een dyin all-magneet NBC één te plaatsen terwijl de parels aan de zijkant van de flacon zijn gehecht. Verwijder de snat door aspiratie Resus. Suspendeer de parels in een mengsel van boid-buffer HLA A twee IG dimer en anti-menselijke CD 28 monoklonaal antilichaam.
Draai vervolgens de glazen flacon op een rotator bij vier graden Celsius gedurende 24 uur om de eiwit-parel-conjugatie te vergemakkelijken. Plaats vervolgens de buis in een MPC één-magneet en verwijder al het boraat-buffer. Nadat de buffer is verwijderd, was de parels twee keer met één milliliter parelwasbuffer.
Incubeer nu de parels in één milliliter parelwasbuffer en draai de flacon gedurende nog eens 24 uur bij vier graden Celsius om de resterende eiwitbindingsplaatsen op de parels te blokkeren. Verwijder vervolgens de buffer uit de glazen flacon en vervang het door één milliliter verse parelwasbuffer. Breng 100 microliter fax-wasbuffer over naar fax-buisjes en voeg vervolgens vijf keer 10 tot de vijfde parels toe.
Kleur de parels met één microliter anti-muis IgG, één PE en één microliter van anti-muis IgG twee a fite na kleur voor 20 minuten bij vier graden Celsius. Bij drie milliliter fax-wasbuffer voor elk van de kleurvoorbeelden. Pellet vervolgens de APC door bij 300 Gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius te centrifugeren.
Suspendeer de APC opnieuw in verse fax-buffer en lees het kleurresultaat onmiddellijk door middel van flowcytometrie. Was de parels twee keer met steriele PBS zoals eerder. Laad vervolgens de parels met 10 microliters CMV-peptide.
Tel de parels met behulp van een hemo-cytometer en label ze vervolgens met de datum en concentratie van de parels. Als parels per milliliter. Incubeer de APC met het peptide gedurende minimaal drie dagen bij vier graden Celsius. Centrifugeer ongeveer 100 milliliter verse perifeer bloed van een HLA A twee positieve donor in 10 natriumheparine vacutainerbuisjes bij 300 Gs gedurende 10 minuten.
Bij kamertemperatuur verwijdert u voorzichtig de bovenste plasmalaag door aspiratie. Vervang het verzamelde plasma door steriele PBS en breng het bloed over naar een steriele T 75 kweekflacon. Meng het bloed en PBS goed door één keer te pipetteren nadat al het bloed is verzameld bij 15 milliliter fial-pack plus naar vier 50 milliliter conische buisjes.
Leg langzaam 30 tot 35 milliliter van de bloedcellen op de top van de fial in elke buis. Houd het grensvlak tussen de fial en de bloedcellen duidelijk en centrifugeer het bloed en de fial-gradiënt bij 500 GS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met de breekpunt en de versnelling zo laag mogelijk om een duidelijk grensvlak tussen de lagen na het spinnen te behouden. Aspireer de bovenste plasmalaag af en gebruik vervolgens een serologische pipet om voorzichtig de PBMC-laag te aspireren. Breng de PBMC over naar een nieuwe 50 milliliter conische buis wanneer alle PBMC zijn geoogst bij 30 milliliter PBS naar de cellen en centrifugeer ze.
Gooi vervolgens het supernat weg en was de pellet. Nog een keer met 30 milliliter PBS om de resterende fi-cel te verwijderen. Verrijk vervolgens voor de CD acht positieve T-celpopulatie met behulp van een Milton Human CD acht positieve T-cel isolatiekit. Volg het protocol van de fabrikant, tel de CD acht positieve T-cellen en bevestig de zuiverheid door fax-analyse.
Suspendeer 1 miljoen CTL in acht milliliter T-celgroeifactor twee x kweekmedium plus acht milliliter compleet RPMI-medium en voeg eenmaal 10 van de zes APC-mix toe. Gebruik vervolgens een multikanaals pipet om 160 microliter cellen per putje op een 96-wel U-bodem weefselkweekplaat te plaatsen. Incubeer de cellen gedurende zeven dagen bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide.
Voed de cellen op dag vier met 80 microliter per putje T-celgroeifactor twee x kweekmedium. Oogst de cellen op dag zeven en plaats vervolgens de cellen tegen de magneet om de oude APC te verwijderen wanneer alle parels zich aan de wand van de flacon hechten.
Oogst en breng de cellen over in een andere 50 milliliter conische buis en tel het aantal cellen. Bepaal de antigeenspecificiteit van de APC door tetrameerkleuring volgens het protocol van de fabrikant. Speel de geoogste cellen opnieuw af met nieuwe APC onder dezelfde omstandigheden om een verhoogd aantal cellen in antigeenspecificiteit te genereren.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor de inductie en expansie van antigeen-specifieke T-cellen met behulp van HLA A2-Ig gebaseerde kunstmatige Antigeen Presenterende Cellen (aAPC). Deze techniek heeft tot doel de efficiëntie van cytotoxische T-lymfocyten (CTL) expansie te verbeteren voor mogelijke toepassingen in adoptieve immunotherapie.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Therapeutiek
Achtergrond
- Adoptieve immunotherapie maakt gebruik van T-cellen om specifieke antigenen aan te vallen.
- Traditionele methoden voor T-cel expansie kunnen beperkt zijn in efficiëntie.
- Kunstmatige antigeen presenterende cellen (aAPC) kunnen T-cel activatie en expansie verbeteren.
- HLA A2-Ig gebaseerde aAPC kunnen worden geladen met specifieke peptiden voor gerichte CTL expansie.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor de efficiënte ex vivo expansie van humane antigeen-specifieke CTL's.
- Om de voordelen van het gebruik van HLA A2-Ig gebaseerde aAPC boven bestaande methoden aan te tonen.
- Om de antigeenspecificiteit van uitgebreide CTL's te evalueren.
Gebruikte methoden
- Conjugatie van HLA A2-Ig en anti-menselijke CD28 monoklonale antilichaam aan magnetische kralen.
- Kwaliteitscontrole en peptide belading van aAPC.
- Isolatie van humane perifere bloed CD8+ T-cellen.
- Incubatie van T-cellen met aAPC voor expansie en karakterisering.
Belangrijkste resultaten
- Uitgebreide CTL's vertoonden verhoogde antigeenspecificiteit zoals aangetoond door tetrameerkleuring.
- De methode maakt off-the-shelf beschikbaarheid en onbeperkte hoeveelheid aAPC mogelijk.
- CMV-specifieke CTL's werden efficiënt uitgebreid met behulp van het beschreven aAPC systeem.
- Karakterisering van CTL's bevestigde hun functionaliteit en specificiteit.
Conclusies
- Het HLA A2-Ig gebaseerde aAPC systeem is een veelbelovend hulpmiddel voor CTL-gebaseerde immunotherapie.
- Deze methode biedt een schaalbare aanpak voor het genereren van antigeen-specifieke T-cellen.
- Verdere studies kunnen de toepassing van deze technologie in klinische omgevingen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient ex vivo expansion of antigen-specific CTLs is a critical bottleneck in adoptive immunotherapy development for infectious diseases and cancer. The HLA-Ig based artificial antigen presenting cell (aAPC) platform enables scalable, reproducible generation of highly specific CTLs, addressing limitations of autologous dendritic cell-based methods. This technology supports portfolio advancement by providing a standardized, off-the-shelf solution for robust T cell manufacturing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of CTL activation pathways and antigen specificity in controlled ex vivo systems.
- Supports functional validation of immune targets by expanding CTLs with defined peptide specificity.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct assessment of CTL effector function and phenotype.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for generating validated CTL populations for downstream assays.
- Standardizes expansion conditions, improving assay comparability and quantitative output reliability.
- Enables scalable production of CTLs for compound screening or immunomodulatory studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by generating effector-memory CTLs for functional studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling repeated, high-fidelity CTL expansion.
- Reduces biological risk in preclinical models by providing consistent, antigen-specific T cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This aAPC-based method integrates into the immunotherapy pipeline from early discovery through preclinical validation, enabling iterative hypothesis testing and functional assessment of CTLs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antigen-specific CTL responses and pathway modulation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible CTL populations for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts such as tetramer staining and cytokine profiling for condition comparison.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant immune biomarkers and preclinical model requirements.
- Enterprise Reuse: Offers an off-the-shelf, scalable platform adaptable to multiple antigens and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CTL function and specificity for target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of CTL expansion workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and reduces late-stage biological risk in immunotherapy portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CTL-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, cell culture, and flow cytometry for quality control and characterization.
- Needs access to magnetic bead conjugation, peptide synthesis, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization of expansion protocols and analytical endpoints.
- Adaptable to various antigens but limited to HLA-matched donor systems as described.
- Dependent on validated peptide loading and functional CTL assessment for each application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Making HLA-A2-Ig-based aAPC
2:47
Quality Control of aAPC and Peptide Loading and Storage
3:43
Human CTL Isolation
5:22
In Vitro aAPC-based Culture System
6:25
Expanded CTL Are Polyfunctional - Not Exhausted - after Prolonged Cell Culture and Proliferation
6:49
Conclusion
