Name: Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer chromatine immunoprecipitatie van dorsale wortelganglia na axonale schade. Deze methode identificeert transcriptiefactorbindingsplaatsen en epigenetische modificaties relevant voor zenuwregeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Andrea Tedeschi bedanken voor de hulp bij het bepalen van de aanvankelijke ChIP experimenten in het laboratorium en Ricco Lindner voor zijn bijdrage te fine-tunen van de voorwaarden voor Chip. Dit werk werd ondersteund door de Hertie Stichting; de Fortune Grant, de Universiteit van Tübingen, en de DFG DI 1497/1-1 subsidies (alle toegekend aan Simone Di Giovanni).

1. Sciatic &amp; dorsale kolom zenuwletsel <ol><li> Het dier wordt geplaatst op een chirurgische handdoek en eronder een thermopad aanwezig is tijdens de gehele procedure houden van de lichaamstemperatuur van de muis bij 37 ° C. Alle dieren zijn verdoofd voor de operatie met een continue isofluraan / O 2 administratie. Chirurgische instrumenten worden geautoclaveerd voordat de procedure. </li><li> Voor sciatic letsel, worden beide achterhand zorgvuldig geschoren, en ontharen wordt aangevuld met generieke haar remover voorafgaand aan de reiniging van de huid met alcohol, gevolgd door Betadyne 3 keer. </li><li> De heupzenuw wordt blootgesteld door het maken van een 4 mm incisie posterior en parallel aan het dijbeen halverwege de dij door de huid en door het verspreiden van de spieren uit elkaar van de biceps femoris met fijne pincet. </li><li> De blootgestelde ischiadicus zenuw is dan gewond, en de huid wordt gesloten met twee hechtdraad clips. </li></ol> NB: Dezelfde incisie wordt verwezen naar de heupzenuw bloot te leggen, maar de wond is gehecht gesloten waarbij de zenuw intact voor de sham letsel. <ol start="5"><li> Voor de dorsale kolom letsel, is de achterkant van de muis zorgvuldig geschoren, en het ontharen wordt aangevuld met generieke haar remover voorafgaand aan de reiniging van de huid met alcohol spray / vegen. </li><li> Het ruggenmerg wordt blootgesteld door het maken van een 2,5 cm incisie van ongeveer T7 naar T13. De huid is uit elkaar, en het bindweefsel wordt verwijderd langs de wervel van T9 naar T11. </li><li> Een laminectomie wordt uitgevoerd bij T10 niveau </li></ol> LET OP: Voor de meeste experimenten, de laminectomie wordt beschouwd als de Sham letsel. <ol start="8"><li> Een paar druppels Xylocain worden toegevoegd aan het weefsel aan het snoer verdoven, en de dura mater is verwijderd, met aandacht niet naar het ruggenmerg aan te raken. </li><li> De dorsale kolommen zijn gewond en de spier is dicht gehecht, opnieuw aandacht niet naar het ruggenmerg aan te raken. Ten slotte wordt de huid gehecht gesloten met hechtdraad clips. Buprenorfine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht) dienen tweemaal daags te worden toegediend gedurende 48 uur of totdat niet meer nodig. </li></ol> 2. Cross-linking <ol><li> Ontleden L4 en L5 DRG van de gewonde muizen na euthanization. Verzamel een totaal van 16 DRG in ijskoude HBSS + proteaseremmers cocktail (twee gewonden en twee sham DRG van elk dier voor een totaal van 4 dieren). </li><li> Kort centrifuge van de DRG, verwijder dan zorgvuldig de HBSS en voeg 500 ul van 1% formaldehyde in PBS + proteaseremmers cocktail en het monster gedurende 30 minuten incuberen bij 37 ° C. </li></ol> Belangrijke stap. Gebruik verse, moleculaire biologie kwaliteit formaldehyde. <ol start="3"><li> Voeg 125 mM glycine van de fixatie en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te stoppen. </li><li> In het kort centrifuge, aspiratie af buffer, en tweemaal was het weefsel met 500 ul ijskoude PBS + proteaseremmers cocktail. </li></ol> 3. Kernen voorbereiding en chromatine afschuiving <ol><li> Aspireren uit PBS, voeg 400 ul van de SDS-lysis buffer, over te dragen aan een pre-gekoelde microcentrifugebuis, en verstoren het weefsel met ongeveer 30 slagen met de micropestle. </li></ol> Belangrijke stap. Lysis en verstoring van het weefsel zijn van levensbelang voor een goede opbrengst van verknoopt chromatine. <ol start="2"><li> Ultrasone trillingen het monster met 8 pulsen, 10 seconden elk op 70% vermogen (Bandelin, Sonoplus GM70). </li></ol> LET OP. Het afschuiven van het chromatine moet worden geoptimaliseerd voor uw specifieke ultrasoonapparaat ingesteld en een goede versnippering van de chromatine moet worden gecontroleerd voordat u het eigenlijke IP-experiment (zie hoofdstuk 3). NOTE. Fragmentatie van de chromatine kan ook worden uitgevoerd door micrococcal nuclease (MNase) spijsvertering. Als een vuistregel, is fragmentatie door sonicatie voorkeur voor vaste weefsel, terwijl MNase spijsvertering is de voorkeur voor inheemse weefsel chromatine immunoprecipitatie. Verknoopt, kan geschoren chromatine worden bewaard bij -80 ° C tot 2 maanden, maar voorkomen dat herhaalde vries / dooi cycli. 4. Analyse van de chromatine spijsvertering (aanbevolen) <ol><li> Verwijder de 10 ul van je geschoren chromatine monster voor analyse. Voeg 200 mM NaCl aan het monster en omgekeerd de cross-link door incubatie bij 65 ° C voor 2 uur. </li><li> Zuiver DNA (zie paragraaf 8) en uitvoeren van een 1% agarose gel. DNA moet worden versnipperd tot een lengte van ongeveer 200-1000 bp (figuur 1). </li></ol> LET OP. Over-versnippering van chromatine kan leiden tot een verminderde signaal, terwijl de onvolledige fragmentatie zal leiden tot een verminderde resolutie en meer achtergrond. 5. Immunoprecipitatie <ol><li> Bepaal het aantal immunoprecipitatie reacties (zie opmerking hieronder), en verdelen samples even in nieuwe buizen. Breng het volume van elktot 500 pi met chip buffer + proteaseremmers cocktail. </li><li> Verwijder de 5 pi van uw verdund monster en doe in een nieuwe buis. Dit is je 1% inbreng monster en het zal worden opgeslagen bij -20 ° C totdat het nodig is (hoofdstuk 7). </li><li> Voor elke immunoprecipitatie, toe te voegen juiste antilichaam of normale IgG-controle en incuberen bij 4 ° C gedurende de nacht met rotatie. </li></ol> NOTE. Bij de vaststelling van het aantal immunoprecipitatie, een positieve controle (bijv. histon H3-antilichaam) en een negatieve controle (normaal IgG) moet worden overwogen. De hoeveelheid antistof gebruikt voor elk IP varieert van antilichamen en dient empirisch te worden bepaald. Het is echter meestal binnen een range van 2-10? G / immunoprecipitatie. <ol start="4"><li> Om immunoprecipitaat uw antilichaam / eiwit / DNA-complex, voeg 30 ul van ChIP Grade Proteïne G magnetische korrels en incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C met rotatie. </li></ol> 6. Het wassen <ol><li> Naar pull-down gebonden chromatine-bead complex, plaats de buis op de magnetische rek. Wacht tot de oplossing helder is en verwijder dan zorgvuldig uw supernatant. </li><li> Voeg 1 ml van een laag zout wassen (ChIP buffer) aan de kralen en incuberen bij 4 ° C gedurende 3-5 minuten met de rotatie, dan pull-down kralen en afwassen aspireren zoals in stap 6.1. Herhaal deze stap voor een totaal van drie wasbeurten. </li><li> Voeg 1 ml van hoog zoutgehalte wasbuffer (ChIP buffer + 350 mM NaCl) aan de kralen en incubeer gedurende 3-5 minuten met de rotatie, dan pull-down kralen en afwassen aspireren zoals in stap 6.1. </li></ol> 7. Elutie en omkering van cross-linking <ol><li> Neem uw input samples uit de -20 ° C, voeg 150 ul van ChIP elutiebuffer en laat op kamertemperatuur tot Stap 7.5. </li><li> Voeg 150 ul van 1 x ChIP elutiebuffer voor elk IP-monster uit stap 6.3. </li><li> Plaats de buizen in een Thermomixer en elueer het chromatine van de kralen door incuberen monsters bij 65 ° C gedurende 30 minuten met zachte vortexen. </li><li> Pull-down kralen op de magnetische rek, en zorgvuldig overdracht van de geëlueerde chromatine (supernatant) in nieuwe buizen. </li><li> Om alle tubes, met inbegrip van uw inbreng monsters, voeg 200mm van NaCl en 40 ug / reactie van proteïnase K en incubeer bij 65 ° C gedurende 2 uur. </li></ol> OPMERKING. De elutie stap kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, ook, maar het kan niet zo efficiënt. 8. DNA-herstel <ol><li> Voeg een volume van Fenol / Chloroform om uw monsters van stap 7.5 en vortex gedurende 30 seconden. </li><li> Centrifugeer op maximale snelheid in een microcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Voorzichtig te herstellen van de waterige (bovenste) fase in nieuwe buizen, voeg een volume van chloroform aan de waterfase, en vortex gedurende 30 seconden. </li><li> Centrifugeer op maximale snelheid in een microcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Voorzichtig te herstellen van de waterige (bovenste) fase in nieuwe buizen, voeg dan 300mm van NaOAc, 20 ug / reactie van glycogeen, en 2,5 volumes van ijskoude 100% ethanol. </li></ol> LET OP. De toevoeging van een drager, zoals het glycogeen, is nodig om de neerslag van relatief kleine afmetingen DNA-fragmenten te verbeteren. <ol start="6"><li> Incubeer bij -80 ° C gedurende 2 uur om neerslag DNA. </li></ol> OPMERKING. De neerslag stap kan ook 's nachts worden uitgevoerd bij -20 ° C. <ol start="7"><li> Centrifugeer de monsters op maximale snelheid in een microcentrifuge gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant af en was het neergeslagen DNA-pellets met 300 ul ijskoude 70% ethanol. </li><li> Centrifugeer de monsters op maximale snelheid in een microcentrifuge gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant en laat de pellets lucht drogen. </li><li> Resuspendeer in 20 ul van steriele H 2 O. Monsters zijn nu klaar voor PCR, of het DNA kan worden opgeslagen bij -20 ° C. </li></ol> 9. Representatieve resultaten Een vertegenwoordiger resultaat van een experiment in ChIP DRG volgende ischiadicus letsel is weergegeven (figuren 1 en 2). Eerst tonen we gefragmenteerd DNA tot een lengte van ongeveer 200-1000 bp (figuur 1). Ten tweede, demonstreren we een PCR-signaal na chip van de proximale promotor van de groei geassocieerde proteïne-43 (GAP-43) alleen op heupzenuw letsel (laan 4, figuur 2, 5 '). Er geen PCR signaal aanwezig is wanneer het dier een schijnvertoning schade alleen ontvangt (laan 3), en bij gebruik van normale IgG serum voor de IP (baan 5 en 6). Om te testen voor de specificiteit van het antilichaam, analyseerden we hetzelfde DNA-monsters, maar gebruikte een controle primer set, die een gebied ontdekt in de 3'-UTR van onze gen van belang waar geen bewoning wordt verwacht. PCR-signalen ontbreken van alle rijstroken (lanen 3-6, Figuur 2, 3 '), behalve voor het ingangssignaal, die non-IP-DNA-monsters als standaard PCR-controles (laan 1-2, FIGUAd 2). Deze chip procedure kan worden uitgevoerd na een heup-of spinale dorsale kolom letsel zoals samengevat in een schema (figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Agarose gel van omgekeerde cross-linked DNA dat door sonicatie geschoren om de goede reeks van fragment lengtes. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Semi-kwantitatieve PCR-resultaten van DRG weefsel volgende heupzenuw letsel waaruit blijkt dat geacetyleerde p53 bindt aan de GAP-43 proximale promotor regio 48 uur na letsel aan de heupzenuw. Controle PCR uit dezelfde DRG weefsel laten zien dat geacetyleerde p53 niet binden aan een controle gebied van DNA bevindt zich in het 3'-onvertaalde gebied (UTR) van het GAP-43 gen (S = Sham, I = Gewond). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Een algemeen schema waaruit de ligging van de laesie sites op het heupzenuw, en de dorsale kolom.

<ol><li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li>
<li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarey%2C+MF+%22Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%22">Chromatin immunoprecipitation (ChIP)</a>. , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).</li>
<li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28%26mu%3BChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li>
<li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Makwana, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li>
<li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+p53-CBP%2Fp300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression%2C+axon+outgrowth%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li>
<li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li>
</ol>

Dit protocol biedt een methode om direct over de chromatine-omgeving te vragen tijdens de axonale regeneratie in het volwassen zenuwstelsel na axonale schade. Het bevat de DRG letsel model met chromatine immunoprecipitatie te probe de transcriptie en epigenetische omgeving na letsel aan de PNS of CNS niet. Het is met name nuttig voor onderzoekers die graag vermoedelijke bindingsplaatsen voor hun favoriete transcriptiefactor karakteriseren, en te bepalen of de bezetting van deze sites gebeurt in reactie op de blessure. E...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> 10x ChIP Buffer </td><td> Cell Signaling </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2x ChIP elutiebuffer </td><td> Cell Signaling </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> ChIP Grade Proteïne G Magnetic Beads </td><td> Cell Signaling </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Magna Grip Rack (8 goed) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> MERCK </td><td> UN 1888 </td></tr><tr><td> 37% Formaldehyde </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10x Glycine Solution </td><td> Cell Signaling </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Glycogeen </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> 10x HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Histon H3 antilichaam (konijn) </td><td> Cell Signaling </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> Normaal Rabbit IgG </td><td> Cell Signaling </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Fenol / chloroform / isoamylalcohol </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Proteaseremmers Cocktail Tabletten </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinase K (20 mg / ml) </td><td> Cell Signaling </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS Lysis Buffer </td><td> Upstate </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Apparatuur nodig </th></tr><tr><td> Ultrasoonapparaat </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia tissue volgende axonale schade

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axonen in het centrale zenuwstelsel (CZS) niet regenereren, terwijl die in het perifere zenuwstelsel (PNS) doen regenereren in beperkte mate na een blessure (Teng et al., 2006).. Het is bekend dat transcriptionele programma&#39;s essentieel zijn voor neurieten en axonale uitgroei zijn opnieuw op schade in de PNS (Makwana et al., 2005).. Echter, de beschikbare instrumenten neuronale genregulatie in vivo te analyseren zijn beperkt en vaak uitdagend. De achterwortelganglia (DRG) bieden een uitstekende blessure modelsysteem omdat zowel de centrale en perifere worden gestimuleerd door een gespleten axon afkomstig uit dezelfde soma. De ganglia vormen een discrete verzameling van cellichamen waar alle transcriptionele gebeurtenissen optreden, en dus zorgen voor een duidelijk omschreven gebied van transcriptionele activiteit die gemakkelijk en reproduceerbaar worden verwijderd van het dier. Letsel van zenuwvezels in de PNS (bijv. heupzenuw), waar de axonale regeneratie optreedt, moet onthullen een set van transcriptionele programma&#39;s die zich onderscheiden van degenen die reageren op een soortgelijke blessure in het CZS, waar de regeneratie vindt niet plaats (bijv. ruggenmerg ). Sites voor transcriptie factor binding, histon-en DNA-wijzigingen als gevolg van letsel aan een PNS of CZS kan worden gekarakteriseerd met behulp van chromatine immunoprecipitatie (chip). We beschrijven hier een ChIP protocol met vaste muis DRG weefsel na axonale schade. Deze krachtige combinatie zorgt voor een middel voor het karakteriseren van de pro-regeneratie chromatine-omgeving nodig zijn voor het bevorderen van axonale regeneratie.

We presenteren een methode voor het chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia weefsel na axonale schade. De aanpak kan worden gebruikt om specifieke transcriptiefactor bindingsplaatsen en epigenetische modificatie van histon en DNA belangrijk voor de regeneratie van axonen gewonden in zowel het perifere en het centrale zenuwstelsel te identificeren.

Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade

Axonen in het centrale zenuwstelsel (CZS) regenereren niet, terwijl axonen in het perifere zenuwstelsel (PZS) wel in beperkte mate regenereren na ...

Het algemene doel van deze procedure is om cross-linked eiwit-DNA-complexen uit weefsel van dorsale wortelganglia te immunoprecipiteren na zenuwletsel. Dit wordt bereikt door eerst letsel aan de nervus ischiadicus of de dorsale kolommen op te wekken. De tweede stap is het cross-linken van het monster en het solubiliseren van het eiwit-DNA-complex.De derde stap van de procedure is het immunoprecipiteren van een specifiek proteïne-DNA-complex. Ten slotte wordt het DNA gezuiverd en teruggewonnen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de verrijking van DNA-fragmenten aantonen die geassocieerd zijn met een proteïne of een DNA-histonmodificatie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van axonale regeneratie, zoals welke DNA-bindingsplaatsen, transcriptiefactoren en histonmodificaties vereist zijn voor de regulatie van genen die belangrijk zijn bij het bevorderen van axonale regeneratie. Plaats als eerste een geanesthetiseerd dier op de operatietafel. Handhaaf de anesthesie gedurende de gehele operatie door continue toediening van isofluraan en zuurstof via een neusmasker voordat u verdergaat.Bevestig de juiste diepte van de anesthesie met de teenknijpreflex voor een letsel aan de nervus ischiadicus. Scheer het achterkwartier zorgvuldig en verwijder eventueel resterend haar met een depilatoire crème. Zodra het haar is verwijderd, wordt de huid gereinigd door herhaaldelijk alcohol en vervolgens Betadine aan te brengen.Maak een incisie van vier millimeter door de huid, posterieur en parallel aan het femur. Gebruik halverwege het dijbeen een fijne pincet om de spieren uiteen te spreiden en de witte nervus ischiadicus eronder bloot te leggen. Zodra de zenuw geïsoleerd is, kan deze ongesneden blijven om als sham-chirurgische controle te dienen, of kan deze worden doorgesneden om een letsel op te wekken.Om af te sluiten, trekt u de huid samen en sluit u deze met twee hechtingclips voor letsel aan de dorsale kolom. Verwijder het haar van de rug en reinig de incisielocatie zoals eerder getoond. Maak een incisie van 2,5 centimeter boven het ruggenmerg van ongeveer T7 tot T13.Gebruik een fijne pincet om de huid vast te houden terwijl het vet wordt gescheiden. Zet vervolgens het oppervlakkige vet vast met twee haakjes. Zodra het vet is teruggetrokken, lokaliseer dan het bloedvat in de ruimte tussen de zesde en zevende wervel om als referentiepunt te gebruiken.Snijd de spier bilateraal over de achtste en tiende wervel en plaats twee haken om deze open te houden. Gebruik een kleine schaar om de spieren over de lamina van T8 tot en met T10 te verwijderen terwijl u het doornfortuit vasthoudt. Voer een laminectomie uit bij T10 door het verbindende bot aan beide zijden door te snijden.Til de bovenste helft van de wervels voorzichtig omhoog om het ruggenmerg daaronder bloot te leggen. Breng enkele druppels 2% Xylocaine aan om het ruggenmerg te anesthetiseren en verwijder vervolgens de dura mater. Zorg dat u het ruggenmerg niet aanraakt.Als men hier zou stoppen, zou dit dienen als een sham-chirurgische controle voor het beschadigen van de dorsale kolom. Maak een snee van 0,3 tot 0,4 millimeter diep dwars door het ruggenmerg. Hecht tot slot de spier dicht en laat het oppervlakkige vet los.Trek de huid samen en sluit deze met hechtingclips. Plaats het dier terug in de thuiskooi en monitor het tot het volledig hersteld is. Euthanaseer het dier 48 uur na de verwonding en verzamel de L4 en L5 dorsale wortelganglia of DRG.De eerste stap is het blootleggen van de ventrale wervelkolom. Verwijder vervolgens de ventrale helft van de wervels van T 12 tot L zes. Om het ruggenmerg bloot te leggen, identificeert u de DRG's die zich in de ruimte tussen de wervels aan de zijkant van het ruggenmerg bevinden.Gebruik een fijne pincet om de L4- en L5-DRG's voorzichtig op te tillen. Snijd zo dicht mogelijk bij het lichaam van de DRG. Verzamel in totaal 16 DRG's van vier dieren en plaats deze in ijskoud HBSS.Centrifugeer de DRG kort, voeg 500 µL 1% formaldehyde toe en incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 °C. Voeg 125 mM glycine toe om de fixatie te stoppen en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Na een korte centrifugatie wordt de buffer afgezogen en het weefsel twee keer gewassen met 500 µL ijskoud PBS met protease-inhibitorcocktail.Zuig vervolgens de PBS af, voeg 400 µL SDS-lysebuffer toe en homogeniseer het weefsel met ongeveer 30 slagen van een micropestel. Soniceren vervolgens het chromatine met acht pulsen van tien seconden op 70% vermogen. Het wordt aanbevolen om een monster te analyseren om te bevestigen dat het DNA is gefragmenteerd tot lengtes van ongeveer 200 tot 1000 baseparen.Verdeel het geshearde chromatinemonster gelijkmatig over nieuwe buisjes. Vul voor elke uit te voeren immunoprecipitatie-reactie het volume van elk buisje aan tot 500 microliters met chipbuffer plus een protease-remmercocktail. Neem vervolgens vijf microliters van uw verdunde monster af en breng dit over naar een nieuw buisje.Dit is uw 1%input-monster en dit zal worden bewaard bij -20 °C tot het nodig is. Voeg later antilichaam of een normale IgG-controle toe aan elke buis en incubeer bij 4 °C onder rotatie gedurende de nacht. De volgende dag.Immunoprecipiteer het complex door 30 µL proteïne G magnetische beads toe te voegen en twee uur te incuberen bij 4 °C onder rotatie. Plaats de buis vervolgens in een magnetische statief om het gebonden chromatine-beadcomplex neer te slaan. Wanneer de oplossing helder is, wordt het supernatant voorzichtig verwijderd en worden de beads drie keer gewassen met 1 mL buffer met een laag zoutgehalte, waarbij elke wasbeurt wordt gevolgd door een incubatie van drie tot vijf minuten bij 4 °C onder rotatie.Was vervolgens één keer met één milliliter high salt buffer. Haal op dit punt de 1%input-monster uit -20 °C en voeg 150 µL chip-elutiebuffer toe. Zet de buis op kamertemperatuur om later te gebruiken.Keer terug naar de IP-monsters en voeg 150 µL van een éénvoudige chip-elutiebuffer toe aan elke buis. Incubeer de monsters 30 minuten lang bij 65 °C met voorzichtig vortexen om het chromatine van de beads te elueren. Trek de beads naar beneden op het magnetische rek en breng het geëlueerde chromatine voorzichtig over naar nieuwe buizen voor alle buizen, inclusief de input-monsters.Voeg 200 millimolair natriumchloride en 40 microgram protease K per reactie toe en incubeer twee uur bij 65 graden Celsius. Herstel na de incubatie het DNA met behulp van standaardprocedures voor verdere analyse. De semi-kwantitatieve PCR-resultaten van DRG-weefsel na een letsel aan de nervus ischiadicus worden hier getoond. Baancolumn één en twee tonen het PCR-signaal van de input-monsters.Het PCR-signaal in baan vier laat zien dat geacetyleerd P 53 alleen bindt aan de proximale promoterregio van gap 43 na letsel aan de nervus ischiadicus. Er is geen PCR-signaal aanwezig wanneer het dier een schijnoperatie (sham injury) ondergaat, zoals te zien is in baan drie, en bij gebruik van normaal IgG-serum, getoond in banen vijf en zes. Controle-PCR van hetzelfde DRG-weefsel laat zien dat geacetyleerd P 53 niet bindt aan een controleregio van DNA die zich bevindt in de 3'-ongecodeerde regio van het gap 43-gen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om drie kritieke stappen voor succes in gedachten te houden. Begin met een voldoende hoeveelheid weefsel, zorg voor een efficiënte fragmentatie en solubilisatie van het DNA-eiwitcomplex, en kies een geschikt immunoprecipitatie-antilichaam voor het eiwit van belang.

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Demonstreren we een protocol voor axoplasm isolatie van volwassen ratten heupzenuw op basis van dissectie van de zenuw bundels en incubatie in hypotone medium om myeline release en lyseren niet-axonale structuren, gevolgd door extractie van de resterende axon-verrijkt materiaal.

Axoplasm Isolatie van Rat heupzenuw

Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

Source: Li, Q., et al. Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the process of axonal regeneration in a mouse sciatic nerve following a crush injury. The isolated nerve is fixed and prepared for imaging, with fluorescent proteins expressed in neurons to visualize axon growth. Using an epifluorescence microscope, axon regeneration is traced from the injury site to assess the extent of...

Axonal Regeneration in the Sciatic Nerve of a Mouse Following a Crush Injury

Source: Li, Q. et al. Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates electroporation-mediated transfection of mouse DRG neurons to study axon regeneration. It outlines the steps for delivering nucleic acid constructs to DRG neurons, inducing sciatic nerve injury, and assessing axonal regeneration.

Electroporation-Mediated Transfection of Mouse Dorsal Root Ganglia to Promote Sensory Axon Regeneration

Een blessure paradigma met behulp van de Drosophila larven ventrale zenuw koord aan het centrale zenuwstelsel regeneratie en reparatie te onderzoeken wordt beschreven. Stekende gevolgd door laser scanning confocale microscopie in time-lapse en vaste monsters, gecombineerd met kwantitatieve analyse met doelgericht ontwikkelde software en genetica, worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van CNS regeneratie en reparatie onderzoeken.

Een blessure Paradigm aan het centrale zenuwstelsel Reparatie Onderzoek in<em&gt; Drosophila</em

Dit protocol presenteert het gebruik van een dorsale wortelganglion (DRG) injectie met een virale vector en een gelijktijdige dorsale wortelbeschadiging bij een volwassen rat als een model om sensorische axonregeneratie te bestuderen. Dit model is geschikt voor het onderzoeken van het gebruik van gentherapie om sensorische axonregeneratie te bevorderen.

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

Electroporation is een effectieve aanpak te leveren van genen van belangen in cellen. Door deze aanpak in vivo toe te passen op de neuronen van volwassen muis achterwortelganglia ganglion (DRG), beschrijven we een model voor het bestuderen van axon regeneratie in vivo.

Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion

Hier wordt de ontwikkeling gepresenteerd voor het consequent verwerven van hoogwaardige cryostaatsecties voor dorsale ganglions.

Een procedure voor cryosectie van het ganglion met dorsale wortel van muizen

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch systeem dat neuronale metabole dynamiek modelleert na axonale verwonding, waardoor beeldvorming, multi-omics-analyse en mechanistische studies van intrinsieke metabole remodellering mogelijk zijn.

Microfluïdische chip voor axonale letselmodellen, constructie en het mogelijk maken van multi-omics-analyse

Dorsale wortelganglia (DRG) bevatten primaire sensorische neuroncellen en geven perifere sensorische signalen door aan het ruggenmerg. Dit protocol beschrijft een methode voor de dissectie van de DRG bij muizen die gestandaardiseerde isolatie van structureel intacte ganglia, anatomische segmentale identificatie, intuïtieve begeleiding voor beginnende gebruikers en verminderde procedurele weefselbeschadiging ondersteunt.

Dissectie en isolatie van de dorsale wortelganglia van de muis

Leer chromatine immunoprecipitatie van dorsale wortelganglia na axonale schade. Deze methode identificeert transcriptiefactorbindingsplaatsen en epigenetische modificaties relevant voor zenuwregeneratie.

Chromatine immunoprecipitatie van achterwortelganglia Tissue volgende axonale schade

Meer video's verkennen