Mozaïek Analyse van Gene Functie in Postnatale Mouse ontwikkeling van de hersenen met behulp van Virus-based Cre recombinatie
August 1st, 2011
Een In vivo Methode om gen-functie te testen in postnatale hersenen wordt beschreven. Recombinant AAVs uiten Cre-en / of een fluorescerend eiwit wordt geïnjecteerd in neonatale hersenen van muizen. Mozaïek gen inactivatie en schaars neuronale etikettering worden bereikt, waardoor een snelle analyse van de genfunctie in processen van cruciaal belang voor neurale circuit ontwikkeling.
Het algemene doel van deze procedure is om de genfunctie te manipuleren tijdens de postnatale periode van de hersenontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst de juiste virussen te selecteren en voor te bereiden, ze in de spuit te laden en de injectieapparatuur voor te bereiden. Vervolgens wordt virus geïnjecteerd in de hersenen van pasgeboren muisjes en de laatste stap is het opofferen van de dieren en het beeldvormen van de geïnjecteerde regio's.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die differentiële markering van controle- en knockout-cellen tonen door middel van immunofluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurowetenschappen, zoals hoe de periode van postnatale ontwikkeling genetisch wordt gereguleerd. Voor injectie kan een commercieel verkrijgbare adeno-geassocieerde virusoplossing worden gebruikt bij volledige titer, meestal 10 tot de 12e, genoomkopieën per milliliter om een groot aantal cellen te manipuleren.
Als schaarse of markering gewenst is, begin met een een tot 10 verdunning. Na het ontdooien van het virus op ijs, breng direct het voorverdunningsvolume over naar een steriele 250 microliter PCR-buis. Houd de verdunning op ijs. Nu.
Bereid de injectiepomp voor door een geschikte spuit te selecteren en deze aan te sluiten op een laadnaald. Trek vervolgens voorzichtig de virusoplossing op totdat er een heel kleine luchtbel in de spuit is gezien en kan inert laadkleurmiddel worden gebruikt om deze stap gemakkelijker te maken. Bevestig nu de spuit aan de pomp met een houder.
Bevestig vervolgens voorzichtig de verbindingsbuis tussen de spuit en de naaldhouder. Zorg ervoor dat de injectienaald in direct contact staat met de verbindingsbuis in de naaldhouder. Beweeg nu langzaam de oplossing door de verbindingsbuis totdat er een kleine druppel oplossing zichtbaar is aan de punt van de naald.
Bevestig de zuiger voorzichtig naast de duwblok met een beugel op de pomp. Stel de injectiesnelheid in op acht microliters per minuut en stel het injectievolume in op tussen één en twee microliters. Pas vervolgens de diameterinstelling van de pompspuit aan om overeen te komen met de diameter van de spuit die u gebruikt.
Ten slotte, om de pups tijdens de herstelfase te beschermen, stel de hotplate in op 38 graden Celsius en bedek deze met een papieren handdoek. Gebruik een IACUC-goedgekeurd protocol, bereid P nul of P één muisjes voor injectie door ze aan koude anesthesie te onderwerpen. Bevochtig een paar papieren handdoeken met water en leg ze op ijs.
Plaats vervolgens vier of vijf pups op de papieren handdoek goed gescheiden. Vouw de papieren handdoeken over de pups, plaats voorzichtig een kleine hoeveelheid gemalen ijs op de papieren handdoeken en incubeer de pups ongeveer vijf minuten. De pups kunnen veilig tot 15 minuten op ijs worden bewaard en nog steeds een goede herstel hebben.
Plaats nu een verdoofde pup op een montageblok voor de beste toegang tot de injectieplaats. De cortex, bijvoorbeeld, is het gemakkelijkst toegankelijk door het dier plat op zijn buik te leggen. De pup kan op zijn plaats worden bevestigd met een pleister, handmatig de kop van de pup stabiliseren en de huid strak trekken om te voorkomen dat deze beweegt.
Navigeer vervolgens naar anatomische kenmerken van de schedel zoals de lambda-naad en selecteer met de andere hand een reproduceerbaar injectiepunt, steek voorzichtig de naald door de schedel. Duw niet hard als de naald de schedel niet gemakkelijk penetreert. Positioneer de naald opnieuw en probeer het voorzichtig opnieuw.
Injectiediepte varieert lichtjes tussen individuele dieren en stammen voor de cortex, een halve tot één millimeter diepte werkt meestal. Injecteer nu de virusoplossing door een collega de pomp te laten activeren om handbewegingen te minimaliseren. Idealiter zou een voetpedaal kunnen worden gebruikt om de pomp na de injectie te starten.
Houd de naald een paar seconden op zijn plaats, houd vervolgens de kop van de pup stil en schuif de naald eruit. Laat de pup nu vijf tot 10 minuten herstellen op de beklede hotplate.
Gedurende deze tijd, blijf andere pups injecteren. Wanneer de pups allemaal hun roze kleur hebben teruggekregen en allemaal bewegen, wrijf ze voorzichtig met een portie van hun huisbedekking. Pas dan kunnen ze worden teruggegeven aan hun moeder.
Anders zouden ze kunnen worden behandeld als onbekende pups, die de moeder waarschijnlijk zou doden nadat de pups zijn teruggegeven aan hun moeder. Reinig de injectieopstelling door de spuit volledig te laden met aceton of 70% ethanol. Als aceton gevoelige componenten zoals sano, acurate, lijmen in gebruik zijn, spoel de oplossing door de injectieopstelling meerdere keren met elke keer verse oplossing.
Dit zal alle resterende virusoplossing verwijderen en de oplosmiddelen zullen gaan verdampen. Na het spoelen van de opstelling, desinfecteer het werkgebied van de bleekvloeistof om het klaar te maken voor de volgende experimentator. Succesvolle techniek produceert een robuuste neuronale infectie op de injectieplaats.
Injecties in specifieke regio's zoals de cortex en de superieure colliculus genereren typisch lokale infecties met minimale verspreiding naar aangrenzende regio's. Het gebruik van een virusoplossing met hoge titer maakt infectie van aangrenzende gebieden zoals de hippocampus, waarschijnlijker injectie met een lage titer virusoplossing. Resulteert in schaarse infectie typisch dicht bij de injectieplaats zoals de cerebellaire injectie in het midden, het aantal geïnfecteerde cellen zou moeten correleren met een titer van de geïnjecteerde virale oplossing.
Injecteer bijvoorbeeld een mix van oplossingen met hoge titer van twee R AAV acht virussen die verschillende fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in de cerebellum, infecteert veel kinji-cellen die differentieel gelabeld zijn. Omgekeerd kan injectie van een laag titer virusoplossing resulteren in schaarse infectie om het visualiseren van enkele cellen te helpen. Fluorescerend gelabelde neuronen kunnen direct worden waargenomen in vers gesneden levend weefsel, of ze kunnen worden onderworpen aan immunokleuring.
Dit verbetert de endogene fluorescerende signalen voor latere beeldacquisitie door middel van brede veld of confocale fluorescentiemicroscopie. Ten slotte is RA
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een in vivo-methode voor het testen van genfunctie tijdens postnataal hersenontwikkeling met behulp van recombinante AAV's. Door deze virussen te injecteren in neonatale muizenhersenen, kunnen onderzoekers mozaïek gen-inactivatie en spaarzame neuronale markering bereiken, wat de analyse van genfunctie in neurale circuitontwikkeling vergemakkelijkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genfunctie
- Neural Circuit Ontwikkeling
Achtergrond
- Het begrijpen van genfunctie tijdens postnataal hersenontwikkeling is cruciaal.
- Recombinante AAV's kunnen worden gebruikt om genexpressie te manipuleren.
- Deze methode maakt het mogelijk om genetische regulatie tijdens kritische ontwikkelingsperioden te bestuderen.
- Immunofluorescence microscopie kan onderscheid maken tussen controle- en knockout-cellen.
Doel van het onderzoek
- Om genfunctie te manipuleren in de postnataal periode van hersenontwikkeling.
- Om te onderzoeken hoe genetische factoren postnataal neurale ontwikkeling reguleren.
- Om inzichten te bieden in de mechanismen die ten grondslag liggen aan neurale circuitvorming.
Gebruikte methoden
- Selectie en voorbereiding van geschikte recombinante AAV's.
- Injectie van virussen in de hersenen van neonatale muizen.
- Immunofluorescence microscopie voor beeldvorming van geïnjecteerde regio's.
- Analyse van differentiële markering van controle- en knockout-cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle gen-inactivatie en neuronale markering bereikt.
- Resultaten demonstreren de genetische regulatie van postnataal ontwikkeling.
- Methode biedt een raamwerk voor toekomstig neurowetenschappelijk onderzoek.
- Inzichten die zijn verkregen, kunnen de begrip van neurale circuitdynamiek informeren.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het bestuderen van genfunctie in de zich ontwikkelende hersenen.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van neurale circuitontwikkeling.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze aanpak om genetische invloeden op gedrag te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, scalable interrogation of gene function in postnatal brain development, addressing a critical gap in target validation for neurodevelopmental disorders. By bypassing embryonic lethality constraints, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in pathways relevant to autism and schizophrenia. The approach provides predictive confidence in target selection by linking genetic perturbation to circuit-level phenotypes in a physiologically relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in postnatal neural circuits where many neurodevelopmental disorder genes exert their effects.
- Operational Value: Achieves mosaic gene inactivation and sparse labeling within days, avoiding months-long conditional mouse model generation.
- Scientific Value: Supports cell-autonomous functional analysis of genes implicated in axonal growth, dendritic tiling, and synapse refinement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively comparable control and knockout cell populations via differential fluorescent labeling for side-by-side phenotypic assessment.
- Operational Value: Permits titration of viral titer to modulate infection density, enabling scalable sparse or dense labeling as needed for downstream assays.
- Scientific Value: Compatible with immunofluorescence and electrophysiology readouts, facilitating multimodal validation of target engagement and circuit impact.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models postnatal genetic perturbation in mice and rats, aligning with the developmental timing of human neuropsychiatric disorder onset.
- Operational Value: Extends to lentiviral delivery and shRNA/dominant-negative constructs, broadening target modulation toolkit for preclinical validation.
- Scientific Value: Enables study of gene function in critical processes like synapse formation, directly relevant to pathophysiological mechanisms in psychiatric disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by providing causal genetic evidence in postnatal neural circuits prior to compound screening.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by deleting candidate genes in defined brain regions to assess phenotypic consequences on neural circuit maturation.
- Screening: Produces standardized, reproducible neuronal preparations with internal controls (labeled vs. unlabeled cells) for reliable compound effect measurement.
- Analytics: Generates quantitative imaging and electrophysiology readouts that enable statistical comparison of genotypes and treatment conditions.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to circuit-level outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable viral delivery platform applicable across multiple gene targets and brain regions, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking postnatal gene loss to specific circuit phenotypes.
- Operational Value: Standardizes gene perturbation via viral delivery, improving reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly establishing genetic causality in disease-relevant postnatal windows.
- Portfolio Impact: De-risks target advancement by providing functional evidence in systems that model human neurodevelopmental timing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic injection, and viral biosafety protocols.
- Dependent on access to purified recombinant AAV or lentiviral vectors and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of viral titer, injection volume, and anesthesia procedures for cross-study consistency.
- Adaptation to different brain regions or species may require optimization of injection coordinates and viral serotype tropism.
- Practical limitation: Efficacy depends on Cre recombinase efficiency and floxed allele availability, which may vary across targets.
