Particle Agglutinatie Methode voor Poliovirus Identification

Het algemene doel van de volgende procedure is om poliovirusisolaten snel te identificeren met behulp van een eenvoudig protocol. Voor deze analyse maken we gebruik van gesensibiliseerde gelatinepartikels gecoat met chimere moleculen die het extracellulaire domein van de menselijke poliovirusreceptor bevatten, verbonden met IgG twee fc. Omdat deze partikels een uniforme affiniteit hebben voor alle serotypes van poliovirusisolaten, treedt agglutinatie van de partikels op bij incubatie met monsters die elk menselijk poliovirus bevatten.

Indien er echter antilichamen aanwezig zijn die in staat zijn het specifieke virus in het monster te herkennen, treedt neutralisatie op en wordt agglutinatie voorkomen; met behulp van dit experimentele systeem kan een snelle identificatie van poliovirusisolaten in een enkelstapsreactie worden uitgevoerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de conventionele neutralisatietest, is de eenvoud van de procedure en interpretatie, met als doel de benodigde arbeid te verminderen en de tijd tot de resultaten te verkorten. Voeg om de anti PV one, PV two en PV three antilichamen te reconstitueren 0,5 milliliters water toe aan elk flesje.

Overbreng vervolgens elke antilichaamoplossing naar afzonderlijke buisjes die 4,5 milliliters onderhoudsmedium bevatten. Sommige kavels anti-PV-antilichamen worden in gereconstitueerde vorm geleverd; voor dergelijke kavels anti-PV-antilichamen is de toevoeging van water voor reconstitutie niet nodig.

Bereid vervolgens een-op-een mengsels van de gecombineerde antilichmetenoplossing met een eindvolume van 3,6 milliliters in schone, gelabelde buisjes. Meng bijvoorbeeld 1,8 milliliters anti PV one met 1,8 milliliters anti PV two. Om een anti PV one plus PV two combinatie te bereiden, herhaalt u dit voor elke mogelijke paarsgewijze combinatie en bereidt u daarnaast een oplossing voor die alle drie de typen antilichamen bevat door 1,2 milliliters van elk antiserum samen te mengen.

Zodra de vier mengsels zijn bereid, wordt er 720 µL FCS aan elke antilichaamoplossing toegevoegd. Dit helpt om aspecifieke agglutinatie van gelatinedeeltjes door antilichamen tijdens de assay te verminderen. De antilichaampools kunnen bij -20 °C worden bewaard tot ze worden gebruikt in de agglutinatie-assay.

In deze assay maken we gebruik van gelyofiliseerde gelatinepartikels die zijn gecoat met de extracellulaire domeinen van de menselijke poliovirusreceptor en IgG twee muis-FC-domeinen. Gebruik voor de consistentie van het agglutinatiebeeld één enkele partikelbatch en geen verschillende batches binnen één experiment. Reconstitueer de partikels door 1,5 milliliter reconstitutiebuffer aan elk vial toe te voegen. Tik voorzichtig tegen het vial om goed te mengen.

De gereconstitueerde deeltjes kunnen tot twee weken worden bewaard bij vier graden Celsius. Ontwerp eerst uw experiment in een microtiterplaat met 96 wells. Voor elk monster bevat well nummer één alleen het virus.

Putjes twee tot en met vijf bevatten het virus plus één van de vier mengsels van antilichaamoplossingen. Zorg ervoor dat er één putje wordt bewaard voor een negatieve controle die alleen medium bevat, zonder virus of antilichaam. Zodra de plaat is klaargezet, voegt u 12 µL van de juiste antilichaamoplossing toe aan elk putje van rij twee tot en met vijf en 12 µL groeimedium.

Medium aan het virus alleen, putjes in rij één, en aan het negatieve controleputje in rij zes. Voeg vervolgens 12 µL virusmonster toe in de eerste vijf rijen en 12 µL groeimedium aan het negatieve controleputje in rij zes. Zodra de antilichamen en het virus zijn uitgeplaat, worden de gereconstitueerde gelatinedeeltjes door voorzichtig tikken gesuspendeerd, waarna direct 25 µL deeltjes per putje aan alle putjes worden toegevoegd.

Het is belangrijk om te voorkomen dat de deeltjes bezinken voordat ze naar de plaat worden overgebracht, om zo gelijke hoeveelheden deeltjes in elk putje te verkrijgen. Plaats de assayplaat op een plaatmixer en meng gedurende 30 seconden. Plaats de plaat vervolgens op een vel wit papier en incubeer de plaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur om agglutinatie mogelijk te maken.

Het is belangrijk om de plaat op geen enkel moment tijdens of na de incubatie te bewegen, aangezien de gevormde agglutinatie onstabiel is. Zodra de reactie heeft plaatsgevonden, worden er verschillende foto's van de plaat gemaakt waarop de kwaliteit van de agglutinatie in elke well kan worden beoordeeld. In wells waar geen agglutinatie heeft plaatsgevonden, zoals hier links getoond, zullen gekleurde gelatinedeeltjes op de bodem van de well neerslaan, terwijl dit in wells waar wel agglutinatie heeft plaatsgevonden niet het geval is.

Vanwege de interactie tussen het virus en de pvr, IgG twee A-gecoate gelatinedeeltjes, is een diffuus gekleurd patroon zichtbaar zoals in het midden wordt getoond. In dit experiment hebben we de eigenschap van virusoplossingen, PV één, twee en drie, om glu te induceren in de aanwezigheid van het antilichaam getest. Bij combinaties zoals hier aangegeven in afwezigheid van virus of antilichamen treedt er geen agglutinatie op en slaan de gelatinedeeltjes neer, in tegenstelling tot in de putjes die virus bevatten, maar geen antilichamen.

Agglutinatie heeft plaatsgevonden door de interactie van het virus. Met de PVR IgG twee A-bedekte gelatinepartikels in de experimentele wells wordt agglutinatie van de virussen voorkomen in elke well die antilichamen bevat die dat virus specifiek neutraliseren. Bijvoorbeeld, agglutinatie van poliovirus type één wordt voorkomen in wells die anti PV één-antilichamen bevatten, maar niet in wells die alleen anti PV twee- en anti PV drie-antilichamen bevatten.

Hetzelfde geldt voor poliovirus type twee en drie. Zodra de techniek beheerst is, kan deze in slechts drie uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt toegepast.