Particle Agglutinatie Methode voor Poliovirus Identification

Het algemene doel van de volgende procedure is om poliovirusisolaten snel te identificeren met behulp van een eenvoudig protocol. Voor deze test gebruiken we gevoelige gelatine deeltjes gecoat met chimerische moleculen die de extracellulaire domein van de humane poliovirusreceptor bevatten, verbonden met IgG twee fc. Omdat deze deeltjes een uniforme affiniteit hebben voor alle serotypen van poliovirusisolaten, treedt agglutinatie van de deeltjes op bij incubatie met monsters die elk humaan poliovirus bevatten.

Echter, als antilichamen aanwezig zijn die in staat zijn om de specifieke virale isolatie van het monster te herkennen, treedt neutralisatie op en voorkomt agglutinatie met dit experimentele systeem, kan snelle identificatie van poliovirusisolaten worden uitgevoerd in een eenstapsreactie. Het belangrijkste voordeel van deze bestaande techniek van vaten, zoals conventionele neutralisatietest, is de SIM eenvoud van de procedure en interpretatie, met als doel de arbeid te verminderen en de benodigde tijd voor resultaten te verkorten. Om de anti PV één, PV twee en PV drie antilichamen te reconstitueren, voegt u 0,5 milliliter water toe aan elke flacon.

Breng vervolgens elke antilichaamoplossing over in afzonderlijke buisjes die 4,5 milliliter onderhoudsmedium bevatten. Sommige partijnummers van anti PV antilichamen worden geleverd in gereconstitueerde vorm voor dergelijke partijnummers van anti PV antilichamen. Toevoeging van water voor reconstitutie is niet nodig.

Bereid vervolgens een-op-een-mengsels van gecombineerde antilichaamoplossing met een eindvolume van 3,6 milliliter in verse gelabelde buisjes. Meng bijvoorbeeld 1,8 milliliter anti PV één met 1,8 milliliter anti PV twee. Om een combinatie van anti PV één plus PV twee te bereiden, herhaalt u dit voor elke mogelijke paarsgewijze combinatie en bereidt u ook een oplossing met alle drie de soorten antilichamen voor door 1,2 milliliter van elk antiserum te mengen.

Zodra de vier mengsels zijn gemaakt bij 720 microliter FCS per antilichaamoplossing. Dit zal helpen niet-specifieke agglutinatie van gelatine deeltjes door antilichamen tijdens de test te verminderen. De antilichaampools kunnen worden bewaard bij min 20 graden Celsius totdat ze worden gebruikt in de agglutinatietest.

In deze test gebruiken we gelyofiliseerd gelatine deeltjes die zijn gecoat met de extracellulaire domeinen van de humane poliovirusreceptor en IgG twee muis FC-domeinen. Zorg ervoor dat u een enkele partij deeltjes gebruikt en niet verschillende partijnummers in één experiment om consistentie van het agglutinatiebeeld te garanderen om de deeltjes te reconstitueren bij 1,5 milliliter reconstitutiebuffer per flacon. Tik zachtjes om goed te mengen.

De gereconstitueerde deeltjes kunnen worden bewaard bij vier graden Celsius gedurende maximaal twee weken. Ontwerp eerst uw experiment in een 96-wells microtiterplaat. Voor elk monster zal put nummer één alleen virus bevatten.

Put nummer twee tot en met vijf bevatten het virus plus een van de vier gemengde antilichaamoplossingen. Zorg ervoor dat u één put bewaart voor een negatieve controle die alleen media bevat zonder virus of antilichaam. Zodra de plaat is ingesteld, voegt u 12 microliter van de juiste antilichaamoplossing toe aan elke put van rij twee tot en met vijf en 12 microliter groei.

Medium aan het alleen virus, putten in rij één, en aan de negatieve controlepotte in rij zes. Voeg vervolgens 12 microliter virusmonster toe aan de eerste vijf rijen en 12 microliter groeimedium aan de negatieve controlepotte in rij zes. Zodra de antilichamen en het virus zijn aangebracht, resus, suspendeer de gereconstitueerde gelatine deeltjes door ze voorzichtig te tikken en voeg onmiddellijk 25 microliter deeltjes per put toe aan alle putten.

Het is belangrijk om de deeltjes niet te laten bezinken voordat ze naar de plaat worden overgebracht om gelijke hoeveelheden deeltjes in elk te verkrijgen. Plaats de testplaat op een plaatmixer en meng gedurende 30 seconden. Plaats de plaat vervolgens op een vel wit papier en incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende twee uur om agglutinatie mogelijk te maken.

Het is belangrijk om de plaat op geen enkel moment tijdens of na de incubatie te verplaatsen, omdat de gevormde agglutinatie onstabiel is. Zodra de reactie heeft plaatsgevonden, neemt u verschillende foto's van de plaat waarin de kwaliteit van de agglutinatie in elke put kan worden gewaardeerd. In putten waar geen agglutinatie is opgetreden, zoals hier links getoond, zullen gekleurde gelatine deeltjes bezinken op de bodem van de put. In putten waar agglutinatie heeft plaatsgevonden, zal dit niet het geval zijn.

Agglutinatie is opgetreden als gevolg van de interactie tussen het virus en de pvr, IgG twee A gecoate gelatine deeltjes in de experimentele putten, een diffuus gekleurd patroon is zichtbaar zoals getoond in het midden. In dit experiment hebben we het vermogen van virusoplossingen, PV één, twee en drie getest om glu te induceren in aanwezigheid van het antilichaam. Combinaties aangegeven zoals hier getoond in afwezigheid van virus of antilichamen, treedt geen agglutinatie op en de gelatine deeltjes bezinken in contrast in een put met virus, maar geen antilichamen.

Agglutinatie is opgetreden als gevolg van de interactie van het virus. Met de PVR IgG twee A gecoate gelatine deeltjes in de experimentele putten, wordt agglutinatie van de virussen voorkomen in elke put die antilichamen bevat die dat specifieke virus neutraliseren. Bijvoorbeeld, agglutinatie van poliovirus type één wordt voorkomen in putten die anti PV één antilichamen bevatten, maar niet in putten die alleen anti PV twee en anti PV drie antilichamen bevatten.

Hetzelfde geldt voor poliovirus type twee en drie. Hoewel master, deze techniek kan in slechts drie uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.