Name: Aviaire Influenza Surveillance met FTA Kaarten: Field Methods, bioveiligheid, en transport problemen opgelost (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Leer aviaire influenza surveillance met FTA-kaarten voor virologisch onderzoek bij wilde vogels. Deze methode maakt veilige RNA-isolatie mogelijk zonder koelketen of hantering van infectieuze virussen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Bert Dibbits voor technische ondersteuning. Het Animal Breeding and Genomics Group, Wageningen Universiteit, Nederland, royaal gehost ons in hun laboratorium. Het personeel van de Ottenby Bird Observatory, Zweden, is bedankt voor het vangen en bemonstering van de wilde eend, in het bijzonder Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson en Stina Andersson. Wij danken Sanne Svensson, Jonatan Qvist en Per-Axel Gjöres voor het filmen op Ottenby, en Mano Camon voor het filmen in het lab. Daniel Bengtson mooie eend foto&#39;s voorzien voor de video gedeelte van deze publicatie. Verder vrij materiaal van de CDC Volksgezondheid Image Library (PHIL, <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) werd gebruikt: de electronen microscoop (nr. 280, door Dr Erskine Palmer) en illustratie (nr. 11823; door Douglas Jordanië) van het influenza virus. Financiële steun werd gegeven door de KNJV (Koninklijke Nederland Jagers Vereniging), het Nederlandse Ministerie van Landbouw, de Faunafonds en de Stichting de Eik Trusts (beide in Nederland), de Zweedse Research Council (subsidie ​​niet. 2,007 tot 20,774) en de EG onderbouwde Newflubird project. RNA-isolatie chemicaliën waren een gulle gift van Ambion, Inc, de RNA-bedrijf. Dit is bijdrage No 245 uit de Ottenby Bird Observatory.

1. Eend Trapping en cloaca zwabberen <ol><li> Trap dabbling eenden van het geslacht Anas (of andere vogels) in een kooi door ze te lokken met eenden te lokken of voedsel, en leg ze in afzonderlijke kartonnen dozen. Vervoer tijd in de box moet blijven tot een minimum beperkt, bijvoorbeeld door het installeren van een veldstation binnen een korte afstand van de val. Logistieke omstandigheden kunnen verschillen in elke studie. Het advies en de goedkeuring van de relevante dier ethische commissie moet worden gezocht voor elke nieuwe set-up. Als alternatief, ook de jager geschoten vogels kan worden bemonsterd. </li><li> Haal de eend uit de doos door de holding zijn vleugels vast aan zijn lichaam. Geniet van een frisse dropping, die aanwezig zal zijn in de meeste gevallen, direct vanaf de onderkant van de doos. Pak ze op met een steriel wattenstaafje en breng de vloeistof op een Whatman FTA-kaart. Zo niet, uit te voeren cloaca zwabberen. </li><li> Zet de eend op zijn rug. Dit maakt de toegang tot de cloaca en faciliteert bemonstering. De cloaca is een uitstekende structuur gelegen onder de buik, dicht bij de basis van de staart. Een ervaren persoon kan houden en de vogel monster op hetzelfde moment, of anders een tweede persoon kan helpen. </li><li> Steek de steriele plastic rayon wattenstaafje (Copan, Italië) ongeveer 1 cm en maak een zachte werveling van de cloaca. Rol het staafje met de vloeistoffen uit de cloaca over het oppervlak van een Whatman FTA-kaart. Na de monsterneming is uitgevoerd onmiddellijke vrijlating van het dier is wenselijk. </li><li> Droog de FTA kaarten bij kamertemperatuur gedurende tenminste een uur, daarna individueel op te slaan elk monster in papieren zakken (zoals enveloppen). Opslag is mogelijk op kamertemperatuur, eventueel met silica kralen in vochtige klimaten. Het verzenden en ontvangen instellingen bioveiligheid ambtenaren kunnen toestaan ​​om FTA kaarten versturen per post, want de ziekteverwekkers inactief bij contact met de FTA kaart oppervlak. </li></ol> 2. Viraal RNA isolatie <ol><li> Pak de FTA kaart materiaal met inbegrip van de feces / cloaca vloeistof. Punch drie schijven met een Harris 2 mm puncher en plaats al die in een put van een RNase vrij 96well plaat. Tussen elke nieuw monster zorgvuldig schoon de puncher met alcohol en een Kim precisie wipe (Kimtech). Gebruik altijd positieve en negatieve controles. Een positieve controle kan bestaan ​​uit een laboratorium stam vers aangebracht op een FTA-kaart, of een natuurlijke steekproef die is bekend tot een positief resultaat opleveren. Als negatieve controle, punch-out discs uit een lege FTA-kaart. Bovendien, laat een ander ook vrij voor een PCR-controle later in je experiment (met water als sjabloon). </li><li> Voeg 70μl RNA snelle extractie-oplossing (Ambion) en warmte-seal de plaat (AbGene Thermo-Sealer). Incubeer 5 minuten op een shaker plaat bij kamertemperatuur met de vastgestelde snelheid die niet leidt tot spill-over (dit is afhankelijk van het gebruikte plaat shaker model te testen op voorhand). </li><li> Carry viraal RNA isolatie volgens de fabrikant de protocollen met de MagMAX-96 viraal RNA isolatie kit (Ambion). In het kort: Voeg 130μl bereid lysis / binding (uit de kit) in elk putje. Overdracht 50μl gewonnen FTA kaartmateriaal aan elke well. Schud plaat voor 1 minuut. </li><li> Voeg 20μl voorbereid kraal mix (uit de kit) aan elk monster en meng door en neer te pipetteren. Schud op bepaalde snelheid gedurende 5 minuten. RNA-moleculen binden aan de magnetische korrels. </li><li> Verplaats de plaat aan een magnetisch 96-well staan ​​om de kralen te vangen. Afhankelijk van het model van de gebruikte magnetische stand, kan dit meer dan 5 minuten. Wanneer de oplossing is veranderd helemaal duidelijk, te verwijderen en gooi de supernatant. Verwijder vervolgens de plaat uit de magnetische stand. </li><li> Twee keer was de korrels met wasoplossing 1 en tweemaal met wasoplossing 2 (uit de kit). Voor elk van de vier wasstappen 150μl bereid wassen oplossing toe te voegen aan elk monster, schud gedurende 1 minuut op bepaalde snelheid, de plaat naar de magnetische staan, vast te leggen kralen voor ongeveer 5 minuten (of totdat de oplossing is volledig helder), te verwijderen en Verwijder de bovenstaande vloeistof. Verwijder vervolgens de plaat uit de magnetische stand, voeg de volgende wasbeurt oplossing, en het uitvoeren van de wasstappen als voorheen. Na de laatste wasstap, verwijder zoveel wasoplossing als mogelijk en drogen de parels bij kamertemperatuur in de plaat shaker voor 2 minuten. </li><li> Voeg 50μl van elutie buffer (uit de kit) om RNA uit de kralen release en voor 4 minuten op de plaat shaker schudden. Capture parels zoals eerder beschreven. Het supernatant bevat nu de geïsoleerde RNA dat klaar is voor downstream-toepassingen. </li></ol> 3. RT-PCR van de AIV Matrix Gene Het uitvoeren van reverse transcriptie PCR (RT-PCR) met de One-Step Access RT-PCR systeem (Promega) in 25 ul reacties (aangepast van Kraus et al. 18 en Fouchier et al. 22..): <table border="1"><tbody><tr><td> Nuclease gratis water </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 buffer </td> 5μl </tr><tr><td> dNTPs </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> primer M52C 22 (10 uM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> primer M253R 22 (10 uM) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 mm) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV reverse transcriptase (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> TfL polymerase (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNA-monster </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> PCR-condities in een Biometra T1 thermocycler zijn: de eerste reverse transcriptie van 45 minuten bij 45 ° C, gevolgd door twee minuten initiële denaturatie bij 94 ° C en 40 cycli van: 94 ° C gedurende 1 minuut, 56 ° C gedurende 1 minuut, en 68 ° C gedurende 2 minuten. Een extra 7 minuten rek bij 68 ° C concludeert de versterking. 4. Screening voor het AI-positieve monsters en zuivering van gerichte Fragmenten uit Gel <ol><li> Belasting 2μl van het PCR-product gemengd met 2μl 5x het laden van kleurstof (BioRad) en 6μl water op een 1% agarose gel (Roche) gekleurd met 1% ethidiumbromide (2.5μl per 100 ml gel) voor een pre-screening. </li><li> Laat de gel gedurende 1 uur bij 120V, samen met een DNA grootte standaard (BioRad EZ load 100 bp ladder), visualiseren met een gel documentatiesysteem. Zie een voorbeeld in figuur 1. </li><li> Selecteer de monsters met geamplificeerde fragmenten in de verwachte omvang bereik (tussen de 200 bp en 300 bp (target fragment is 244 bp). Laad het volledige PCR-reactie volume (waarvan 23μl ~ zijn links) van deze kandidaten met 6μl 5x het laden van kleurstof op een 2 % ethidiumbromide gekleurde agarose gel en laat gedurende 2 uur. </li><li> Plaats de gel op een UV-transilluminator (Bioblock Scientific) en visueel geïnspecteerd. Zie een voorbeeld in figuur 2. Accijnzen bands van de juiste grootte van gel met een scalpel en geplaatst in de individuele 1,5 ml reageerbuizen. Zuiver fragmenten uit gel, bijvoorbeeld met de Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo Onderzoek). </li></ol> 5. Sequencing en identificatie van PCR producten <ol><li> Het uitvoeren van Sanger sequentiebepaling van het doel fragmenten, bijvoorbeeld op een ABI 3730 capillaire sequencer met ABI Big Dye 3,1 chemie (Applied Biosystems). Bereid sequencing reacties in 10μl volumes met 10-20 ng gel-gezuiverd template cDNA, 1.75μl 5x verdunningsbuffer, 0.5μl Big Dye V3.1 premix, 1 ui voorwaartse primer (M52C 20, 10 mM), en ddH2O. Fietsen voorwaarden zijn: 1 min initiële denaturatie, gevolgd door 25 cycli van: 10 s bij 96 ° C, 5 s bij 45 ° C en 4 min bij 60 ° C. Zuiveren en de voorbereiding van de sequencing reactie op basis van uw interne protocollen. </li><li> Identificeer resulterende cDNA sequenties tegen nucleotide databases zoals GenBank23, bijvoorbeeld door het web-gebaseerde tools zoals BLAST in het National Centre for Biotechnology Information (NCBI, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Wilde eenden (Anas platyrhynchos) werden bemonsterd op Ottenby Bird Observatory in december 2007. Van elke mallard een monster FTA kaart werd genomen als beschreven in dit protocol. Na de levering, werden de FTA kaarten bewaard in een diepvries bij -20 ° C voor twee jaar. Dezelfde FTA-kaart monster van het laboratorium isoleren getest in Kraus et al.. 18 werd opgenomen als positieve controle, evenals negen tienvoudige seriële verdunningen van het. Twee negatieve controles werden i) extractie uit een lege FTA-kaart, om te testen of er was carry-over van de puncher, en ii) RT-PCR-reactie, waarin nuclease gratis water werd gebruikt als mal, om te testen of besmetting tijdens plaatsgevonden, of ter voorbereiding van de PCR-reactie. 84 monsters werden geanalyseerd. Een gel beeld van de PCR-producten van deze 84 monsters zijn te vinden in figuur 1. Van natuurlijke monsters een veelheid van niet-specifieke banden kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van diverse microbiële verontreinigingen in de feces worden waargenomen. Echter, het doel fragment van de primerpaar is 244 bp lang. De hele PCR-reactie volume van een subset van de monsters die fragmenten geproduceerd in ongeveer de juiste grootte (tussen 200 bp en 300 bp) werd geladen op gel (figuur 1). Een illustratie van welke van de bands werden gesneden uit de gel kan worden gevonden in aanvullende figuur 1. In aanvulling op de positieve controle, twee van deze monsters (69.899 en 69.912) waren positief door het nieuwe protocol. Een BLAST zoeken tegen de NCBI databank nucleotide onthulde hun identiteit als AI-matrix-gen (Figuur 3), terwijl alle andere bands leek op bacteriële sequenties het best, of niet geven een leesbare volgorde helemaal. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Gel beeld van een eerste screening van de PCR-producten. 2 pi PCR-product van positieve controle, serial verdunningen van de positieve controle, twee negatieve controles en 84 cloaca monsters werden geladen. 48 monsters zijn weergegeven in het bovenste paneel gel, en 48 monsters in het onderste paneel. Rode pijlen geven gel rijstroken gebruikt worden voor 100 bp DNA een standaardmaat. Ter illustratie, rode cirkels geven bands in de verwachte grootte bereik. Blauwe cirkels geven een niet-specifieke amplicon (links) of een primer dimeer artefact onder de 100 bp in grootte (rechtsonder). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Selectie van monsters met fragmenten in de juiste afmetingen. Monsters met banden van 200 bp en 300 bp (target fragment 244 bp) werden gekozen. De groene pijl geeft de positieve controle, de twee rode pijlen geven monsters die werden bevestigd te AIV positief zijn door het vergelijken van de cDNA sequenties van de NCBI nucleotide database. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Screen capture van een vertegenwoordiger van BLAST-zoekopdracht op NCBI. Een van de cDNA-sequenties die zijn verkregen uit de uitgesneden fragmenten werd opgevraagd tegen de nucleotide-database op de NCBI website. Het monster wordt correct geïdentificeerd als AI-Matrix genfragment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">Om een grote versie van deze afbeelding wilt zien, klik hier.</a> <img alt="Aanvullende Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Aanvullende Figuur 1"> Aanvullende Figuur S1. Bands van geselecteerde monsters uitgesneden uit gel. Deze foto is genomen uit de gel weergegeven in figuur 1 na de kandidaat-banden tussen de 200 bp en 300 bp werden uitgesneden.

<ol><li>Pulido, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+evolution+of+avian+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BioScience%22%5BJournal%5D)">The genetics and evolution of avian migration.</a> BioScience. 57, 165-174 (2007).</li>
<li>Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza%3A+An+ecological+and+evolutionary+perspective+for+waterbird+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Waterbirds%22%5BJournal%5D)">Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists.</a> Waterbirds. 29, 243-257 (2006).</li>
<li>Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+virulence+of+the+1918+%22Spanish%22+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Philos.+Soc%22%5BJournal%5D)">The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus.</a> Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).</li>
<li>Butler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swine+flu+goes+global%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Swine flu goes global.</a> Nature. 458, 1082-1083 (2009).</li>
<li>Normile, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza.+Wild+birds+only+partly+to+blame+in+spreading+H5N1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1.</a> Science. 312, 1451-14 (2006).</li>
<li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+dynamics+of+global+H5N1+outbreaks+match+bird+migration+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Geospat.+Health%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns.</a> Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).</li>
<li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+the+spread+of+the+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+virus+in+wild+birds+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe.</a> Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+dissemination+of+H5N1+viruses+isolated+during+an+influenza+outbreak+in+migratory+waterfowl+in+Western+China%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China.</a> J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).</li>
<li>Gaidet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza+viruses+in+water+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Africa.+Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Avian influenza viruses in water birds.</a> Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).</li>
<li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+in+migratory+birds+and+evidence+of+limited+intercontinental+virus+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange.</a> PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).</li>
<li>Parmley, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+bird+influenza+survey%2C+Canada%2C+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Wild bird influenza survey, Canada, 2005.</a> Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).</li>
<li>Wallensten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+influenza+A+virus+in+migratory+waterfowl+in+northern+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).</li>
<li>Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+high-throughput+influenza+A+virus+surveillance+studies+of+wild+birds+by+use+of+molecular+diagnostic+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).</li>
<li>Latorre-Margalef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+influenza+A+virus+infection+on+migrating+mallard+ducks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).</li>
<li>Runstadler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RRT-PCR+analysis+and+virus+isolation+to+determine+the+prevalence+of+avian+influenza+virus+infections+in+ducks+at+Minto+Flats+State+Game+Refuge%2C+Alaska%2C+during+August+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005.</a> Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).</li>
<li>Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+preservative+on+recoverable+RT-PCR+amplicon+length+from+influenza+A+virus+in+bird+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces.</a> Avian Dis. 51, 965-968 (2007).</li>
<li>Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sample+type%2C+temperature+and+RNAlater+%28TM%29+on+the+stability+of+avian+influenza+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA.</a> J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).</li>
<li>Kraus, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza+surveillance%3A+On+the+usability+of+FTA+cards+to+solve+biosafety+and+transport+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Wildfowl%22%5BJournal%5D)">Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues.</a> Wildfowl. , 215-223 (2009).</li>
<li>Smith, L. M., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting%2C+archiving+and+processing+DNA+from+wildlife+samples+using+FTA+databasing+paper%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecol%22%5BJournal%5D)">Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper.</a> BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).</li>
<li>Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription+of+an+RNA+genome+from+databasing+paper+%28FTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA).</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).</li>
<li>Rogers, C., Burgoyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+typing%3A+Storing+and+processing+of+stabilized+reference+bacteria+for+polymerase+chain+reaction+without+preparing+DNA+-+An+example+of+an+automatable+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure.</a> Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).</li>
<li>Fouchier, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+influenza+a+viruses+from+different+species+by+PCR+amplification+of+conserved+sequences+in+the+matrix+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene.</a> J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).</li>
<li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Res. 38, 46-51 (2009).</li>
<li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li>
<li>Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li>
<li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Pathol%22%5BJournal%5D)">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li>
</ol>

Vangen, behandeling en bemonstering van vogels werden gedaan na de nationale wetgeving en werden goedgekeurd door de Zweedse kamer van Landbouw en het onderzoek van dieren ethische commissie.

Het protocol hier beschreven biedt een aanvullende methode om fecaliën of soortgelijke monsters screenen op de aanwezigheid van de AIV. Het werd speciaal ontworpen om monstername snel en eenvoudig. Dit maakt het mogelijk voor minder getrainde personen, zoals jagers of wilde dieren managers, bij te dragen aan AI toezicht. Geen koele kettingen moeten worden toegepast, hoewel het bevriezen van de monsters wordt aanbevolen waar mogelijk. Een paar dagen van de ruimtetemperatuur, bijvoorbeeld tijdens het transport naar het laboratorium, waren geen probleem voor RNA-moleculen op FTA-kaarten, zolang de kaarten droog gebleven. Andere niet-gekoelde opslag systemen die momenteel worden geëvalueerd door de onderzoeksgemeenschap, zoals alcohol 15 of guanidine 16, vereisen speciale scheepvaart regelingen vanwege hun gevaarlijke aard. In tegenstelling, heeft de FTA-kaart methode geen verschepen van gevaarlijke stoffen. Echter, een andere interessante opslagmedium in dit opzicht is RNAlater ™ dat niet gevaarlijk is, hetzij 17. Monster analyse kan worden uitgevoerd in een standaard moleculair laboratorium. Geen speciale apparatuur anders dan voor normaal PCR-reacties en capillaire sequencing nodig was. Alle stappen kunnen worden uitgevoerd zonder een bioveiligheidsniveau, want al in monstername de mogelijke ziekteverwekkers werden geïnactiveerd door de antibacteriële en antivirale activiteit van de FTA kaart. Kruisbesmetting en de daarop volgende fout-positieve monsters werden niet waargenomen in onze studies met wilde vogels monsters. Echter, bij het werken met RNA en PCR is het altijd raadzaam om speciale aandacht te besteden aan werkplekken en aparte kamers voor pre-en post-PCR stappen schoon te maken. Werken in een zuurkast verlaagt het risico van besmetting door aërosolen worden in het laboratorium. Pipetteren moet worden uitgevoerd met filter tips. Uit een eerdere studie over monsters tegelijk uit dezelfde eenden weten we dat zes van de 84 monsters positief waren door de traditionele RealTime RT-PCR-methode 24 en de Ct-waarden van RealTime RT-PCR zijn bekend. De twee positieve monsters gedetecteerd door onze methode vloeien voort uit eenden, die Ct-waarden &lt;30 (met vermelding van een hoge concentratie van viraal RNA) had. De overige vier monsters die positief waren met de traditionele protocol had Ct-waarden&gt; 30 (minder geconcentreerd) en kon niet worden gedetecteerd door ons protocol. Alleen monsters met relatief hoge virus titers waren positief in onze test en het is waarschijnlijk dat de gevoeligheid van de methode was de bron van het niet alle positieve monsters op te sporen. Verder is de steekproefgrootte in de huidige studie was zeer laag en de methode kan volledig worden ontwikkeld en beoordeeld als er meer controle en strenge experimenten worden uitgevoerd. Echter, als deze monsters zouden zijn verzameld uit een afgelegen gebied, zou de traditionele analyse niet mogelijk zijn geweest helemaal. Bovendien, deze eerste resultaten komen voort uit pilot-experimenten die verdere optimalisatie nodig hebben. Een periode van twee jaar opslag in een reguliere -20 ° C vriezer na de monsterneming waarschijnlijk ook gevolgen voor de kwaliteit van het virale RNA. Dit is mogelijk RNA degradatie is een belangrijke kwestie bij de behandeling van kamertemperatuur opslag van geïnactiveerde virussen. Monsters worden opgeslagen in alternatieve vloeistoffen zoals hierboven vermeld last van significante afbraak die analyse van de langere stukken van het virale genoom 16 effecten. Hoewel niet getest in onze studie, hebben FTA kaarten bewezen goed geschikt zijn voor intact RNA-moleculen te behouden in andere RNA systemen die erg lijken op Aviaire Influenza virussen 25, 26.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens of het instrument </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Plastic rayon droog wattenstaafje </td><td> Copan, Italië </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> FTA-kaart </td><td> Whatman papier </td><td></td><td> verschillende opties </td></tr><tr><td> Harris micro-punch 2mm met mat </td><td> Whatman papier </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNase vrij 96well plaat </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 652290 </td><td> of vergelijkbare </td></tr><tr><td> Kim precisie doekjes </td><td> Kimtech </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA snelle extractie-oplossing </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX-96 virale isolatie kit </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One-Step Access RT-PCR-systeem </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> of vergelijkbare </td></tr><tr><td> Agarose MP </td><td> Roche </td><td> 1388991001 </td><td> multi purpose agarose </td></tr><tr><td> 5x laadbuffer </td><td> BioRad </td><td></td><td> geleverd met DNA-ladder </td></tr><tr><td> EZ load 100 bp ladder </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> of vergelijkbare </td></tr><tr><td> Ethidiumbromide 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> of vergelijkbare </td></tr><tr><td> 1,5 ml reactiebuizen </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> of vergelijkbare </td></tr><tr><td> Zymoclean Gel DNA-herstel-kit </td><td> Zymo Onderzoek </td><td> D4001 </td><td> of vergelijkbare </td></tr><tr><td> ABI grote kleurstof 3,1 chemie </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> of vergelijkbare </td></tr></tbody></table>

aviaire influenza surveillance met fta kaarten: field methods, bioveiligheid, en transport problemen opgelost

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Aviaire Influenza virussen (AIVs) infecteren veel zoogdieren, inclusief de mens 1. Deze AIVs zijn divers in hun natuurlijke gastheren, onderdak bieden aan bijna alle mogelijke virale subtypen 2. Human pandemieën van griep oorspronkelijk voort uit AIVs 3. Veel dodelijke gevallen bij de mens tijdens de H5N1-uitbraken in de afgelopen jaren gemeld. De laatste tijd, een nieuwe AIV gerelateerde stam geveegd door de menselijke bevolking, waardoor de &#39;varkensgriep-epidemie&#39; 4. Hoewel de menselijke handel en transport activiteit lijkt te zijn verantwoordelijk voor de verspreiding van hoogpathogene stammen 5, kan verspreiding ook deels worden toegeschreven aan wilde vogels 6, 7. Echter, de werkelijke bron van alle stammen AIV is wilde vogels. In reactie op deze en in het gezicht van ernstige commerciële verliezen in de pluimvee-industrie zijn er grote bewakingsprogramma&#39;s is wereldwijd geïmplementeerd om informatie over de ecologie van AIVs te verzamelen, en om systemen voor vroegtijdige waarschuwing te installeren om bepaalde hoogpathogene stammen 8-12 op te sporen. Traditionele virologische methoden vereisen virussen intact en gecultiveerd voor de analyse. Dit vereist strenge koude ketens met diepvriezers en zware bioveiligheid procedures in de plaats worden tijdens het transport. Lange-termijn surveillance is dan ook meestal beperkt tot een paar veld stations dicht bij de goed uitgeruste laboratoria. Afgelegen gebieden kunnen niet worden bemonsterd, tenzij logistiek omslachtige procedures worden uitgevoerd. Deze problemen zijn erkend 13, 14 en het gebruik van alternatieve opslag en het transport van strategieën onderzocht (alcoholen of guanidine) 15-17. Onlangs Kraus et al.. 18 introduceerde een methode voor het verzamelen, opslaan en vervoeren AIV monsters, gebaseerd op een speciaal filter papier. FTA-kaarten 19 te behouden RNA op een droge opslag basis 20 en maken ziekteverwekkers inactief bij contact 21. Deze studie toonde aan dat FTA kaarten kunnen worden gebruikt om de AIV RNA te detecteren in reverse-transcriptie PCR en dat de resulterende cDNA kan worden gesequenced en virus genen en bepaald. In het onderzoek van Kraus et al.. 18 een laboratorium isoleren van de AIV werd gebruikt, en de monsters werden afzonderlijk behandeld. In het verlengde hier gepresenteerde werden fecale monsters van wilde vogels uit de eend val op de Ottenby Bird Observatory (SE Zweden) direct getest om de bruikbaarheid van de methoden te illustreren onder veldomstandigheden. Vangen van eenden en sample collectie van cloacaswabs is aangetoond. Het huidige protocol omvat het opschalen van het werk vloeien voort uit enkele buis hanteren om een ​​96-wells design. Hoewel minder gevoelig dan de traditionele methoden, de methode van de FTA-kaarten biedt een uitstekende aanvulling op grote surveillance regelingen. Het maakt het verzamelen en analyseren van monsters van overal in de wereld, zonder de noodzaak om het handhaven van een koelketen of veiligheidsvoorschriften met betrekking tot transport van gevaarlijke reagentia, zoals alcohol of guanidine.

Een methode om te bewaren, op te sporen en de volgorde RNA virussen van aviaire influenza werd gevalideerd en uitgebreid met behulp van natuurlijke fecesmonsters van vogels. Deze techniek verwijdert de noodzaak van het handhaven van een koelketen en behandeling van besmettelijke virussen en kan worden toegepast in een 96-wells high-throughput setup.

Aviaire Influenza Surveillance met FTA Kaarten: Field Methods, bioveiligheid, en transport problemen opgelost

Aviaire influenzavirussen (AIV's) infecteren veel zoogdieren, waaronder mensen1. Deze AIV's zijn divers in hun natuurlijke gastheren en bevatten bijna alle mogelijke virale ...

Menselijke grieps pandemieën, waaronder de recente varkensgriepepidemie, zijn oorspronkelijk voortgekomen uit het aviaire influenzavirus, A IV, een soort van het influenzavirus A. Er zijn uitgebreide surveillanceprogramma's opgezet om informatie te verzamelen over de ecologie van A IV en om hoogpathogene stammen te detecteren. In deze video wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren en identificeren van A IV-monsters van wilde vogels.Eerst worden eenden gevangen. Hun feces wordt verzameld en aangebracht op een FTA-kaart, waarmee het viraal RNA voor droge opslag wordt geconserveerd. Er worden monsters van de FTA-kaarten genomen en het fecale materiaal wordt geëxtraheerd. Het RNA wordt geëxtraheerd en magnetische korrels worden gebruikt om het te zuiveren.Reverse transcriptase PCR wordt uitgevoerd om cDNA te genereren, dat vervolgens wordt gesequent. De resulterende sequenties worden daarna vergeleken met bekende a IV-sequenties om het type a IV in de monsters vast te stellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het kweken van infectieuze virussen, is dat er geen strikte cultuur hoeft te worden onderhouden en dat monsters uit afgelegen gebieden eenvoudig kunnen worden genomen.Bovendien zijn biosafety-voorschriften met FDA-kaarten eenvoudiger te implementeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ziekte-ecologie, zoals welke influenzastammen er voorkomen. Hoewel deze methode inzichten kan bieden voor de studie naar aviaire influenza.Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals verschillende ziekten bij wilde dieren veroorzaakt door virussen en andere micro-organismen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het vangen en bemonsteren van levende eenden of andere vogels oefening vereist en laboratoriumwerk met RNA moeilijk is. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we succesvol regulier DNA bemonsterden en isoleerden uit uitwerpselen van dieren die bewaard waren op Watman-filterpapieren; lok eenden of andere vogels in een kooi door ze aan te trekken met lok-eenden of voedsel.Hier worden eenden van het geslacht onus gevangen. Plaats de gevangen eenden in individuele kartonnen dozen. Haal de eend uit de doos door de vleugels stevig tegen het lichaam aan te houden.In de meeste gevallen zullen er verse vloeibare uitwerpselen onderin de kooi aanwezig zijn. Neem de uitwerpselen op met telkens een nieuw steriel wattenstaafje en breng deze aan op een Watman FTA-kaart totdat het doeloppervlak van de kaart verzadigd is. Indien er geen uitwerpselen onderin de kooi aanwezig zijn, dient een cloacale swab te worden uitgevoerd.Draai de eend eerst om op haar rug om toegang te krijgen tot de cloaca. De cloaca is een uitstekende structuur die zich onder het abdomen bevindt, dicht bij de basis van de staart. Een ervaren persoon kan, indien nodig, de vogel tegelijkertijd vasthouden en bemonsteren.Een tweede persoon kan helpen bij het afnemen van de monstername terwijl de eerste persoon de vogel vasthoudt. Voer een steriele plastic rayon wattenstaaf voorzichtig ongeveer één centimeter in en maak een zachte veegbeweging over de cloaca. Verwijder de wattenstaaf en rol deze vervolgens over het oppervlak van een Watman FTA-kaart.Droog de FTA-kaarten gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Plaats elke probe in een papieren envelop. Bewaar de enveloppen vervolgens bij kamertemperatuur voor kortstondige opslag of vries ze in voor langere perioden.FTA-kaarten kunnen per gewone post worden verzonden aangezien de pathogenen inactief worden. Werk onder een zuurkast bij contact met het oppervlak van de FTA-kaart. Begin de virale RNA-isolatieprocedure door het FTA-kaartmateriaal, inclusief de feces, te extraheren met een Harris twee millimeter pons; pons drie schijfjes en plaats deze allemaal in een putje van een RNAse-vrije 96-wells plaat tussen elk nieuw monster.Reinig de pons zorgvuldig met alcohol en een Kim precision wipe. Om een positieve controle te genereren, brengt u een laboratoriumstam aan op een FTA-kaart als negatieve controle.Stans schijfjes uit een lege FTA-kaart. Plaats deze in de plaat zoals eerder beschreven; zorg ervoor dat er een andere well vrij blijft voor een PCR-controle. Voeg later in het experiment 70 µL RNA-snelle extractie-oplossing toe aan de well.Verzegel vervolgens de plaat met een thermische sealer, plaats de plaat op een schudapparaat en stel de snelheid in, waarbij u er zeker van bent dat er geen vloeistof overstroomt. Incubeer de plaat terwijl deze wordt geschud bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gebruik na de incubatie de ambience Mag Max 96-kit om het virale RNA te isoleren door in elke put van de lege plaat in de kit 130 µL van de meegeleverde lysis-bindoplossing te voegen.Breng vervolgens 50 µL van het geëxtraheerde FDA-kaartmateriaal over naar elk putje. Plaats de plaat één minuut op de schudmachine. Voeg daarna 20 µL van de bereide bead-mix uit de kit toe aan elk monster en meng door herhaaldelijk te pipetteren; schud vervolgens gedurende vijf minuten.Tijdens deze incubatie zullen de RNA-moleculen zich binden aan de magnetische beads. Verplaats de plaat vervolgens naar een magnetisch 96-well statief om de beads op te vangen zodra de oplossing volledig helder is geworden.Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en weg te gooien. Neem vervolgens de plaat uit de magnetische houder. Was de beads door 150 µL van de bereide wasoplossing aan elk monster toe te voegen, schud gedurende één minuut en vang de beads vervolgens op in de magnetische houder.Wanneer de oplossing volledig helder is, dient het supernatant te worden verwijderd en weggegooid. Herhaal deze wasstap nogmaals. Voer vervolgens twee wasbeurten uit met behulp van oplossing twee.Verwijder na de laatste wasbeurt met een pipet zoveel mogelijk van de oplossing en plaats de droge plaat gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op de schudmachine om de beads aan de lucht te laten drogen. Zodra de beads droog zijn, voegt u 50 µL elutiebuffer uit de kit toe en schudt u vier minuten om het RNA van de beads te laten loskomen. Vang de beads op zoals eerder beschreven.De supernatant bevat nu het geïsoleerde RNA, dat gereed is voor downstream toepassingen om cDNA van de virale genen te genereren en te amplificeren. Voer reverse transcriptie-PCR uit met behulp van het one step access R-T-P-C-R-systeem in reacties van 25 µL, zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol.Zodra de PCR is voltooid, kunnen de monsters worden gescreend op IV-positiviteit en worden gezuiverd. Om vast te stellen of monsters IV-positief zijn, worden twee microliters van het PCR-product geladen op een 1% agarosegel die een uur lang is gekleurd met 1% ethidiumbromide bij 120 volt. Visualiseer dit met een gel-documentatiesysteem en identificeer vervolgens de monsters met geamplificeerde fragmenten in het verwachte groottebereik.Hier is het doelfragment 244 basenparen. Zoek daarom naar monsters met banden tussen de 200 basenparen en 300 basenparen, zoals bijvoorbeeld de rood omcirkelde banden. Laad vervolgens het restant van de PCR-reactie.Breng ongeveer 23 µL van de kandidaten aan op een met 2% ethidiumbromide gekleurde agarosegel en laat deze twee uur lopen. Plaats de gel op een UV-transilluminator. Snijd vervolgens met een scalpel banden van de juiste grootte uit en plaats deze met een DNA-recoverykit in individuele reactiebuisjes van 1,5 mL.Zuiver het DNA uit de gelfragmenten voor sequencing en identificatie. Voer hier de Sanger-sequencing van de doelfragmenten uit. De forward primer M 52 C wordt gebruikt voor het sequensen van het A IV-matrixgen.Zodra de sequenceringsresultaten zijn verkregen, worden de cDNA-sequenties vergeleken met nucleotide-databanken zoals GenBank met behulp van lokale of webgebaseerde tools zoals blast van het National Center for Biotechnology Information, waardoor sequentiefragmenten kunnen worden gekoppeld aan bestaande vermeldingen. Op deze manier kan de specifieke A IV-stam worden gekarakteriseerd en kan waardevolle informatie over sequentiekenmerken worden verkregen.84 wilde eenden werden in december 2007 bemonsterd bij het Autumn B Bird Observatory; van elke wilde eend werd een monster op een FTA-kaart afgenomen zoals beschreven in dit protocol. Na verzending werden de FTA-kaarten twee jaar lang bewaard in een vriezer bij minus 20 °C. Hier wordt een gelafbeelding getoond van de PCR-producten van deze 84 natuurmonsters.Er kunnen talrijke aspecifieke banden worden waargenomen door de aanwezigheid van diverse microbiële contaminaties in de feces. Het doelfragment van het hier gebruikte primerpaar is 244 basenparen. Lange banden van de verwachte grootte zijn rood omcirkeld.Blauwe cirkels geven een aspecifiek amplicon of een primer-dimeer-artefact aan met een grootte van minder dan 100 baseparen. De monsters die met rode pijlen zijn aangegeven, werden geïsoleerd en gesequenced. De groene pijl geeft de positieve controle aan.De gekozen monsters zijn bevestigd als IV-positief door hun cDNA-sequenties te vergelijken met de NCBI-nucleotide database. Zodra men deze techniek onder de knie heeft, kan het proces — vanaf het laden van de FDA-kaart tot een schoon RNA-template — in twee uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om aandacht te besteden aan schone werkruimtes, het gebruik van handschoenen, de scheiding tussen pre- en post-PCR-werkomgevingen, het gebruik van filtertips en het werken onder de veiligheidskap bij het volgen van deze procedure.Andere downstream-applicaties, zoals het kloneren van fragmenten in vectoren, kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of er meerdere influenzastammen zijn die één gastheer infecteren na de ontwikkeling ervan. Deze procedure zou de weg kunnen vrijmaken voor onderzoekers in het veld van de ziekte-ecologie om AI-infecties te onderzoeken in afgelegen gebieden waar AI-bemonstering voorheen niet haalbaar was. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u monsters voor aviaire influenza uit de cloaca neemt, RNA-moleculen uit FDA-kaarten isoleert en zuivert, en bepaalt of en door welke stammen ze zijn geïnfecteerd.Vergeet niet dat het werken met wilde vogels het risico met zich meebrengt om individuen te hanteren die besmet zijn met aviaire influenza of andere zoönosen. Om die reden is het zeer belangrijk om tijdens deze procedure altijd beschermende kleding te dragen.

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze studie beschrijft diagnose van aviaire influenza bij wilde vogels met behulp van een draagbare RRT-PCR-systeem. De methode maakt gebruik van gevriesdroogde reagentia om het scherm wilde vogels in een niet-laboratorium setting, typisch voor een uitbraak scenario. Het gebruik van moleculaire technieken biedt nauwkeurige en gevoelige alternatieven voor een snelle diagnose.

Een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: Het gebruik van een Portable RRT-PCR en gevriesdroogd reagentia in het veld

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

The video demonstrates an assay for quantifying influenza viruses A and B. This assay employs nicking endonuclease amplification with influenza-specific primers and target detection using molecular beacon probes.

A Molecular-Based Assay for Quantifying Influenza A and B Viruses

De auteurs presenteren een protocol om varkens neusdoekjes te verzamelen voor het detecteren en isoleren van influenza A-virussen.

Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens

Aangezien pathogenen met hoge gevolgen potentieel proefpersonen kunnen infecteren via luchtdruppeltjes, is aerobiologie steeds meer toegepast in pathogeneseonderzoek en de ontwikkeling van medische tegenmaatregelen. We presenteren een gedetailleerde visuele demonstratie van aerobiologieprocedures tijdens een aerosoluitdaging bij niet-menselijke primaten in een maximumbeveiligingsomgeving op bioveiligheidsniveau 4.

Veiligheidsmaatregelen en operationele procedures in een (A) BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

We beschrijven een snelle, moleculair-gebaseerde Influenza A en B assay. De Influenza test detecteert elk doel binnen 15 minuten door het gebruik van isotherme amplificatie met influenza-specifieke primers, gevolgd door detectie van targets met moleculaire beacon sondes. De Influenza A en B test is gebruiksvriendelijk en vereist een minimale hands-on tijd om te presteren.

Snelle Moleculaire detectie en differentiatie influenzavirussen A en B

Een anion wisselen hars gebaseerde methode, aangepast aan vloeistof impingement gebaseerde bioaerosol bemonstering van virussen is aangetoond. Wanneer gekoppeld aan downstream moleculaire detectie, zorgt de methode voor facile en gevoelige detectie van virussen van bioaerosols.

Detectie van virussen van Bioaerosols met behulp van Anion Exchange hars

Een snel-inzetbare, off-grid laboratorium is ontworpen en gebouwd voor externe, beperkt resource-globale instellingen. De functies en de kritieke aspecten van de modules van de logistiek-enhanced, uitbreidbaar, multifunctionele laboratorium worden onderzocht. Een checklist voor een basic Labor werkstroom en een protocol voor een respiratoire virale diagnostische test zijn ontwikkeld en gepresenteerd.

Externe Laboratoriumbeheer: Respiratoir Virus diagnostiek

Dit protocol geeft instructies voor intranasale toediening van IAV en downstream-analyse van longbeschadiging bij muizen en bijbehorende transcriptionele veranderingen in longceltypen.

Modellering van dysplastisch en functioneel longalveolair herstel na griepinfectie

Leer aviaire influenza surveillance met FTA-kaarten voor virologisch onderzoek bij wilde vogels. Deze methode maakt veilige RNA-isolatie mogelijk zonder koelketen of hantering van infectieuze virussen.

Aviaire Influenza Surveillance met FTA Kaarten: Field Methods, bioveiligheid, en transport problemen opgelost

Meer video's verkennen