Name: Dissectie van de Adult zebravis Kidney (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Leer de dissectie van de adulte zebraviskidney voor nier- en bloedcelonderzoek met Danio rerio. Deze methode ondersteunt celisolatie en transplantatiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RAW wil de leden van de Zon en Davidson onderzoekslaboratoria bedanken voor hun ontelbare bijdragen aan het helpen om strategieën die geleidelijk over deze dissectie techniek vorm bij volwassen zebravissen de afgelopen tien jaar te ontwikkelen. Daarnaast willen we onze dank uitspreken aan de medewerkers van de Notre Dame Center for Research zebravis voor het leveren van uitstekende lopende veehouderij zorg voor onze zebravis kolonie. RAW oogstte financiering van het onderzoek van de NIH-NIDDK de toekenning van subsidies DK083512, en gul laboratorium start-up financiering van de University of Notre Dame.

1. Dissectie van de volwassen zebravis nier van een dier niet vastgelegde monster <ol><li> Kies een volwassen zebravissen tussen 3-6 maanden in leeftijd voor dissectie. </li><li> Euthanaseren de vis door deze in een schaal met 0,2% tricaïne pH 7.0 voor ongeveer 4-5 minuten, kijken voorzichtig om te zien dat de kieuwen stoppen met bewegen en het hart stopt met kloppen. </li><li> Met behulp van een lepel, til de vis uit de tricaïne bad in een kleine hoeveelheid van de oplossing, giet de oplossing en voorzichtig het dier op een papieren handdoek. </li><li> Gebruik een scherp paar van dissectie schaar aan de kop van het dier te verwijderen, het maken van een snede net achter de kieuw operculum (Figuur 1, pad A). Gooi het hoofd in een biologisch gevaarlijk afval container. </li><li> Gebruik de dissectie schaar om het lichaam te openen van het dier, door het maken van een lange ventrale incisie, te beginnen met het hoofd en eindigt bij de staart aan de basis van de staartvin (figuur 1, pad B). </li><li> Verwijder de interne organen van het dier met behulp van een paar van de dissectie pincet / tang, en plaats ze in biologisch gevaarlijk afval. Wees voorzichtig dat u de dorsale lichaamswand borstel, want dit is de locatie van de nier (figuur 2). Als u hebt gekozen voor een vrouwelijke vis, moet u de ontwikkeling van eieren schep van de lichaamsholte, die kan heel eenvoudig worden gedaan met behulp van een schuine paar pincetten of pincet. </li><li> Gebruik dissectie naalden om pin van het lichaam muren open voor een dissectie lade en de pinnen, zodat de nieren kunnen worden gevisualiseerd hoek. De nier zal beschikken over een karakteristieke vorm (hoofd, romp / zadel, staart) en de kleur, wordt afgewisseld met zwarte hued pigmentatie (figuur 2). U kunt ook de aorta gevuld met perifeer bloed, die naar beneden loopt de middellijn van het orgel structuur. </li><li> Gebruik fijn pincet om de nieren los te maken van het dorsale lichaam muur, met behulp van een paar pincetten om de nier te heffen als je los het orgel van het bindweefsel, dat het ten grondslag liggen. </li><li> Plaats voorzichtig de nier in de gewenste voertuig voor de verdere live cell studies, zoals een microcentrifugebuis met 1x PBS voor FACS voorbereiding. </li></ol> 2. Voorbereiding en dissectie van de volwassen zebravis nier van een dier vast monster <ol><li> Bereid een oplossing van 4% paraformaldehyde/1X PBST. Kook de oplossing voor de PFA te ontbinden in oplossing, dan is het mengsel afkoelen tot 4 ° C en voeg 0,1% dimethylsulfoxide. We hebben het meeste succes met weefsel behoud van het gebruik van vers gemaakte PFA-oplossingen, in tegenstelling tot diepvries fracties. Maak voldoende oplossing om onder te duiken de volwassen zebravissen tijdens de dissectie. </li><li> Vul een dissectie bak met voldoende fixatie oplossing om onder te duiken de volwassen zebravissen gedurende de dissectie. Wij voeren de volgende stappen met deze lade gepositioneerd onder de microscoop, die kan worden geplaatst in een chemische kap om de blootstelling aan fixatie geuren te minimaliseren. </li><li> Kies een volwassen zebravissen tussen 3-6 maanden in leeftijd voor dissectie. </li><li> Euthanaseren de vis door deze in een schaal met 0,2% tricaïne pH 7.0 voor ongeveer 5 minuten kijken zorgvuldig om te zien dat de kieuwen en het hart stoppen met kloppen. </li><li> Met behulp van een lepel, til de vis uit de tricaïne bad in een kleine hoeveelheid van de oplossing, giet de oplossing en voorzichtig het dier op een papieren handdoek. </li><li> Gebruik een scherp paar van dissectie schaar aan de kop van het dier te verwijderen, het maken van een snede net achter de kieuw operculum (Figuur 1, pad A). Gooi het hoofd in een biologisch gevaarlijk afval container, en onmiddellijk het dier te plaatsen in de PFA-bevattende dissectie lade. </li><li> Gebruik de dissectie schaar om het lichaam van het dier te openen, door het maken van een lange ventrale incisie, te beginnen met het hoofd en eindigt bij de staart aan de basis van de staartvin (figuur 1, pad B), en houdt het lichaam gedeeltelijk onder het tijdens de de procedure. </li><li> Verwijder de interne organen van het dier met behulp van een paar van de dissectie pincet / tang, en plaats ze in biologisch gevaarlijk afval. Wees voorzichtig dat u de dorsale lichaamswand borstel, want dit is de locatie van de nier (figuur 2). </li><li> Gebruik dissectie naalden om pin openen van het lichaam muren, en de pinnen, zodat de nieren kunnen worden gevisualiseerd hoek. De nier zal beschikken over een karakteristieke vorm (hoofd, zadel, staart) en de kleur, wordt afgewisseld met zwarte hued pigmentatie (figuur 2). U kunt ook de aorta gevuld met perifeer bloed, die naar beneden loopt de middellijn van het orgel structuur. </li><li> 'S nachts vast het monster, het plaatsen van de lade bij 4 ° C wanneer u klaar bent met het regelen van de gewenste monsters. </li><li> De volgende dag, verwijder de PFA-oplossing uit de lade en vervang met 1x PBST. </li><li> Gebruik fijn pincet om de nier voorzichtig los te maken van het dorsale lichaam muur, met behulp van een paar pincetten om de nier te heffen als je los het orgel van het bindweefsel, dat het ten grondslag liggen. Het nierweefsel wordt zacht en soepel worden van de DMSO in het fixeermiddel oplossing, waardoor het mogelijk is om de gehele nier orgel ontleden in een stuk. </li><li> Gebruik een bredeboring overdracht pipet om de nier te plaatsen in een microcentrifugebuis. </li><li> De nier kan nu verder worden verwerkt tot histologische of hele berg gedrag in situ genexpressie studies op basis van de gewenste studie. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: De stappen die zijn schematisch in figuur 1 geven de dissectie procedure. De nier kan worden geïdentificeerd op basis van zijn karakteristieke vorm en kleur, en anatomische locatie op de dorsale wand van het lichaam van het dier holte, zoals weergegeven in figuur 2. Na ontleding van een vaste nier monster, ganse berg in situ hybridisatie kan worden gebruikt om lokaliseren van de expressie van een gen van belang, zoals weergegeven in figuur 3. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Procedure die directe toegang voor het ontleden van de zebravis volwassen nier mogelijk maakt. (A) gedood zebravis is ontleed in een stapsgewijze manier (aangegeven met nummers en pijlen) aan de onderzoeker geeft de gemakkelijkste toegang tot de volledige nier orgel. Beelden van de buikholte vóór (B) en na (C) het verwijderen van de buikorganen. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2:. Visualisatie van de zebravis nier in een niet vastgelegde steekproef Na verwijdering van organen in het lichaam holte, de nieren verschijnt als een enkele, afgeplatte orgaan dat is aanhanger van de dorsale lichaamswand via het bindweefsel (A), en is geschematiseerd (B) aan de anatomische vorm te tonen. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: Hele monteren in situ hybridisaties uitgevoerd op de gehele volwassen nier orgel. (A) cadherin17 transcripten zijn gedetecteerd in de tubulus van volwassen nieren nefronen, uitgebreid in (A '). (B) mafba transcripties zijn proximale nefron celtypen in de volwassen nier (te vergelijken met hele tubulus in paneel A) gelokaliseerd. (B' ) Een vergroot aanzicht van mafba expressie blijkt dat transcripties zijn specifiek gelokaliseerd in het podocyte (P) cellen van het bloed filter (glomerulus) en de proximale tubulus (PCT).

<ol><li>Stocum, D. L., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+the+limits%3A+stem+cells+in+regeneration+science%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stretching the limits: stem cells in regeneration science.</a> Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Mione, M. C., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for cancer.</a> Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).</li>
<li>Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Developmental biology of hematopoiesis.</a> Blood. 86, 2876-2891 (1995).</li>
<li>Davidson, A. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27definitive%27+%28and+%27primitive%27%29+guide+to+zebrafish+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The 'definitive' (and 'primitive') guide to zebrafish hematopoiesis.</a> Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Reimschuessel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fish+model+of+renal+regeneration+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">A fish model of renal regeneration and development.</a> ILAR J. 42, 285-291 (2001).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).</li>
<li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li>
<li>Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
<li>Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant-specific+gene+programs+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mutant-specific gene programs in the zebrafish.</a> Blood. 106, 521-530 (2005).</li>
<li>Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+vascular+endothelial-specific+genes+by+the+microarray+analysis+of+the+zebrafish+cloche+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants.</a> Blood. 106, 534-541 (2005).</li>
<li>Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+fate+is+established+by+the+Notch-Runx+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway.</a> Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).</li>
<li>Little, M. H., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+such+a+thing+as+a+renal+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Is there such a thing as a renal stem cell.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).</li>
<li>Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li>
<li>North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li>
<li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li>
<li>de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+expands+the+renal+progenitor+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Volwassen stamcellen zijn dynamisch en essentiële componenten die de volwassen lichaam vormen een te behouden. Volwassen stamcellen kunnen ook dienen om schade tegen te gaan dat het lichaam loopt tijdens de ziekte staten, en het disfunctioneren of het verlies van volwassen stamcellen kunnen leiden tot het verval van orgaanfunctie en is betrokken bij kanker maligniteiten rijden en aan veroudering dragen. Volwassen stamcellen vertonen cellulaire eigenschappen die hen onderscheiden van gedifferentieerde celtypen. Bij de celdeling, volwassen stamcellen in staat zijn om zelf-vernieuwing en de productie van progenitor cellen die op hun beurt kunnen leiden tot verschillende gedifferentieerde nakomelingen. Er is grote belangstelling voor het begrijpen van de paden die de cel beslissingen over het lot en de potentie van volwassen stamcellen regelen vanwege hun belangrijke rol in het weefsel homeostase 1. Bijvoorbeeld, veel wetenschappers op dit moment proberen de signalen die verschillende volwassen stamcellen populaties in hun niche, of gespecialiseerde micro-omgeving, en hoe deze niche wordt beïnvloed door humorale factoren behouden te identificeren. Volwassen hematopoietische stamcellen (HSC&#39;s) zijn pluripotente cellen die de brandstof voor de voortdurende verjonging van bloedcellen in dieren 8. Hematopoiese is een levendig proces dat voortdurend gaande is gedurende de levensduur van een gewerveld organisme, omdat de volwassen gedifferentieerde bloedcellen types zijn van korte duur en dus moet regelmatig worden aangevuld. Terwijl ze verdelen, HSCs aanbod deze cruciale vraag door zelf-vernieuwing en het produceren van een reeks van voorouders die aanleiding geven tot de erytroïde, megakaryocyten, lymfoïde en myeloïde geslachten. Elk van deze bloed-celtypen vervult unieke functies in de circulatie, waaronder het verstrekken van gas te wisselen om weefsel, een manier voor het afdichten van verwondingen aan bloedvaten door middel van stolselvorming, of afweermechanismen tegen binnendringende ziekteverwekkers. Terwijl HSCs zijn erkend voor vele jaren, een overvloed aan boeiende vragen blijven onbeantwoord over deze verbazingwekkende cellen. Recente studies hebben vastgesteld dat subklassen van HSC met verschillende lange-termijn zelfvernieuwing eigenschappen en de opheldering van niche-componenten en geeft aan dat het gedrag van HSC 8 moduleren. De zebravis is nu een van de hoekstenen van hematopoiese onderzoek paradigma&#39;s, op basis van de genetische en moleculaire eigenschappen van dit dier model 8. Onderzoek met behulp van de zebravis heeft geleid tot nieuwe inzichten over HSC biologie die zijn geconserveerd met een hogere gewervelde dieren, zoals zoogdieren, met nadruk op de biomedische relevantie van vis bloed onderzoeken 8. Historisch gezien is de kennis over HSC heeft de weg vrijgemaakt voor de expedities op zoek om te ontdekken of andere organen worden onderhouden door volwassen stamcellen. Talrijke volwassen stamcellen celpopulaties worden nu gewaardeerd op te bestaan, variërend in diverse structuren van de hersenen naar de darm, de huid en de skeletspieren. Voortdurende inspanningen op het gebied van stamcellen proberen te bepalen hoe volwassen stamcellen en zelfs andere gedifferentieerde celtypes gebruik kunnen verhoogde potentie zien in verschillende settings. Met betrekking tot de nieren, is er grote debat onder nefrologen over de vraag of renale stamcellen 16 bestaan. Onafhankelijke bevindingen hebben gedocumenteerde populaties van niercellen bij zoogdieren die beschikken over verschillende gradaties van regeneratief potentieel, maar een samenhangend begrip van deze meldingen is nog niet bereikt. Interessant is dat er sterk bewijs voor het idee dat veel vissoorten cellen die robuust kan brandstof regeneratie van beschadigd nefronen, evenals groei geheel nieuwe nefronen tijdens de volwassenheid 9 bezitten ondersteunen. Recent werk heeft gewezen op de moleculaire kenmerken van volwassen nieren stamcellen in de zebravis 10,11, en ​​toonde de zelfvernieuwing potentie van deze zogenaamde nier-stam / voorlopercellen (RPC&#39;s) 11. Toekomstige studies zijn nodig om na te gaan of analoog niercellen aanwezig zijn bij zoogdieren. Toch kan verder onderzoek over de cellulaire en moleculaire mechanismen die vis RPCs reguleren geven inzicht in hoe regeneratieve prestaties kunnen worden gestimuleerd in het zoogdier nier. Het is duidelijk dat er nog veel te begrijpen over de RPC, en dat de vele nu beschikbare instrumenten voor de zebravis onderzoeker kan uitgevoerd worden om deze intrigerende vragen aan te pakken. In dit protocol beschrijven we onze methode voor de identificatie en anatomische dissectie van de volwassen zebravissen nier. Alternatieve stappen kunnen worden gebruikt om de nier, zoals het openen van de buikholte met een ventrale incisie met behulp van een schaar dissectie ontleden, maar we zijn tegengekomen het meeste succes bij de toegang tot de hele nier wanneer de buikwand is gespeld te openen en het hoofd wordt verwijderd. Het bloed en de nieren onderzoekers zowel die wensen te isoleren en te werken met deze celtypen kunnen gebruiken ofwel dissectie methode. Opgemerkt moet worden dat de methode die we beschrijven voor het isoleren en working met de zebravis volwassen nier is zeker niet beperkt tot wetenschappers die willen vragen van volwassen stamcellen biologie na te streven, als de ontleding van dit orgaan kan onderzoeken te vergemakkelijken voor de onderzoekers het nastreven van onderzoeken over onderwerpen variërend van fysiologie aan de vergrijzing. Verder kan deze methode worden gecombineerd met andere technologieën, zoals genetische manipulatie, om zo vervolgens moleculair label en te zuiveren en studie discrete subpopulaties van bloed of nieren cellen van wild-type of genetisch gemuteerde zebravissen 11. Vooruitblikkend, zulke gedetailleerde procedures zuivering van de stam en de voorlopercellen celtypen is van vitaal belang voor het verkrijgen van kennis over hoe hun gedrag wordt gereguleerd, zoals operationele tests, zoals transplantatie of voorlopercellen kweken vormen de basis waarmee de potentie en de identiteit van deze cellen wordt bepaald. Recente ontwikkelingen in de hematopoietische voorlopercellen kweekmethoden openen vele nieuwe mogelijkheden voor studie, en kan worden aangepast aan het kweken van de nierfunctie de bevolking 17. Zebravis chemische genetica succesvol zijn geweest bij de identificatie van de pathways die HSC en renale voorlopers in verschillende contexten 18-20 moduleren, en blijft een nuttig laan in combinatie te testen met bovenstaande celbiologie technieken. Bij elkaar genomen, zijn er een aantal baanbrekende bijdragen aan het gebied van hematologie en nefrologie het gebruik van de zebravis model, en verder onderzoek in deze arena&#39;s beloften om verder te hanteren transformatieve inzichten in de komende jaren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Dissection schaar </td><td> Roboz </td><td> RS-5882 </td></tr><tr><td> Dissection pincet </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Dissection schuine pincet </td><td> Roboz </td><td> RS-5058 </td></tr><tr><td> Tricaïne </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Electron Microscopy Services </td><td> 19210 </td></tr></tbody></table>

dissectie van de adult zebravis kidney

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Onderzoekers die werkzaam zijn in de snel groeiende gebied van volwassen stamcellen biologie proberen de signalen die het gedrag en de functie van stamcellen tijdens de normale homeostase en ziekte staten regelen begrijpen. Het begrip van volwassen stamcellen heeft een brede verstrekkende gevolgen voor de toekomst van de regeneratieve geneeskunde 1. Zo kan bijvoorbeeld een betere kennis over volwassen stamcellen biologie vergemakkelijken het ontwerpen van therapeutische strategieën in welke organen worden geactiveerd om zichzelf of zelfs de creatie van methoden voor het kweken van organen in vitro die kunnen worden getransplanteerd naar de mens een te genezen. De zebravis is uitgegroeid tot een krachtig diermodel voor de studie van de gewervelde celbiologie 2. Er is uitgebreide documentatie en analyse van de embryonale ontwikkeling in de zebravis 3. Pas sinds kort hebben wetenschappers gezocht naar volwassen anatomie en chirurgische dissectie technieken 4 document, want er is een progressieve beweging binnen de zebravis gemeenschap om de toepassingen van dit onderzoek te verbreden tot volwassen organisme studies. Zo zijn er belangen in het uitbreiden met behulp van zebravis om de biologie van volwassen stamcellen populaties te onderzoeken en geavanceerde volwassen modellen van ziekten zoals kanker 5 te maken. Historisch gezien is isolatie van de zebravis volwassen nier geweest voor het bestuderen van hematopoiese, zoals de nieren is de anatomische locatie van de aanmaak van bloedcellen in vis 6,7. De nier is opgebouwd uit nefron functionele eenheden te vinden in arborized regelingen, omringd door hematopoietische weefsel dat is verspreid over de tussenliggende ruimtes. De hematopoietische component bestaat uit hematopoietische stamcellen (HSC&#39;s) en hun nageslacht dat de nier bewonen totdat ze terminaal differentiëren 8. Bovendien is het nu duidelijk zijn, dat een groep van nier-stam / voorlopercellen (RPC) ook de zebravis nieren orgel bewonen en in staat stellen zowel nier regeneratie en groei, zoals bij andere vissoorten 9-11. In het licht van deze nieuwe ontdekking, de zebravis nier is een orgaan dat de locatie van twee interessante mogelijkheden voor volwassen stamcellen biologisch onderzoek huizen. Het is duidelijk dat veel openstaande vragen konden goed worden geserveerd met deze experimentele systeem. Het stimuleren van uitbreiding van dit terrein, is het gunstig om gedetailleerde methoden voor het visualiseren van document en vervolgens isoleren van de volwassen zebravissen nier orgel. Dit protocol details onze procedure voor dissectie van de volwassen nier van zowel de nog niet opgeloste en vaste dieren. Dissectie van de nier orgaan kan worden gebruikt voor het isoleren en karakteriseren hematopoietische en renale stamcellen en hun nakomelingen met behulp van bestaande technieken, zoals histologie, fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) 11,12, expressie profilering 13,14, 11,15 en transplantatie. We hopen dat de verspreiding van dit protocol zullen de onderzoekers te voorzien van de kennis om ruimer gebruik van de zebravis studies die uiteindelijk vertaald kunnen worden voor menselijke toepassing te implementeren.

De zebravis nier is de thuisbasis van zowel de nier-en hematopoietische volwassen stamcellen / progenitorcellen, en vormt een uitstekende gelegenheid om deze celtypen en hun nakomelingen studie in een gewerveld modelorganisme. Hier tonen we een gedetailleerde dissectie procedure die de onderzoeker in staat stelt te identificeren en chirurgisch te verwijderen van de volwassen zebravissen nieren, die kunnen worden gebruikt voor toepassingen zoals celisolatie, transplantatie, en expressie studies van de nier-en / of bloed celpopulaties.

Dissectie van de Adult zebravis Kidney

Onderzoekers die werkzaam zijn in het snelgroeiende vakgebied van de biologie van adulte stamcellen streven ernaar de signalen te begrijpen die het gedrag en de functie van stamcellen reguleren ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren en chirurgisch verwijderen van de nier van een volwassen zebravis, die kan worden gebruikt voor toepassingen zoals celisolatie, transplantatie en expressie, en studies naar nier- en/of bloedcelpopulaties. Dit wordt bereikt door eerst een volwassen zebravis van drie tot zes maanden oud te selecteren voor dissectie. Het dier wordt vervolgens opgeofferd in 0,2% trica, waarbij de euthanasie wordt bevestigd zodra de kieuwen stoppen met bewegen en het hart stopt met kloppen.De derde stap van de procedure is het openen van de buikholte met dissectieschaaren en het verwijderen van de daarin gelegen organen. De laatste stap van de procedure is vervolgens het verwijderen van de nier uit het onderliggende bindweefsel met een fijne dissectie-pincet. Uiteindelijk worden genexpressieprofielen van hematopoëtische cellen of subpopulaties van niercellen bepaald, en specifieke celpopulaties geïsoleerd via whole mount.In situ hybridisatie, immunohistochemische analyses en/of fluorescentie-geactiveerde cel-sortering kunnen worden uitgevoerd op het geïsoleerde orgaanweefsel en/of de cellen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de dissectiestappen moeilijk aan te leren zijn. Een zebravisnier is namelijk een fragiel orgaan dat via dicht bindweefsel aan de lichaamswand is verankerd.De implicaties van deze techniek kunnen worden toegepast bij de therapie of diagnose van nier- en bloedziekten bij mensen, aangezien biologische processen sterk geconserveerd zijn tussen zebravis en hogere zoogdieren. In recente jaren zijn talloze moleculair-genetische tools ontwikkeld voor de zebravis, waardoor het een nuttig diermodel is geworden. In sufficiente hoeveelheid, 0,2%trica om een volwassen zebravis van drie tot zes maanden oud in een schaal te plaatsen.Select vervolgens een zebravis voor dissectie en plaats deze gedurende ongeveer vijf minuten in de schaal, waarbij zorgvuldig wordt gecontroleerd of de kieuwen stoppen met bewegen en het hart stopt met kloppen. Gebruik daarna een lepel om de vis met een kleine hoeveelheid oplossing uit het trica-bad te tillen. Giet de oplossing af en plaats het dier voorzichtig met een scherpe dissectieschaar op een papieren handdoek.Maak een snede vlak achter de kieuw, een insnijding om de kop van het dier te verwijderen, en werp de kop weg in een container voor biologisch gevaarlijk afval. Maak vervolgens, beginnend bij de kop, met de dissectieschaar een lange ventrale incisie die eindigt bij de staart om het lichaam van het dier te openen. Verwijder nu de interne organen van het dier met een dissectiepincet en plaats deze in het biologisch gevaarlijk afval.Zorg ervoor dat u de dorsale lichaamswand niet aanraakt, aangezien zich hier de nier bevindt. Indien u een vrouwelijke vis heeft geselecteerd, schep dan de ontwikkelende X uit de lichaamsholte met een schuine pincet. Gebruik dissectienaalden om de lichaamswanden vast te pinnen op een dissectieschaal.Plaats de pinnen onder een hoek zodat de nier zichtbaar wordt. De nier heeft een kenmerkende vorm met een kop, een romp of zadel, een staart, en een kenmerkende kleur die is doorschakeld met zwartgekleurde pigmentatie. Gebruik twee paren fijne pincetten om de nier los te maken van de dorsale lichaamswand.Gebruik één pincet om de nier op te tillen en één pincet om het onderliggende bindweefsel vast te houden. Terwijl u het orgaan uit de lichaamsholte van de zebravis verwijdert, plaatst u de nier voorzichtig in het gewenste medium. Voor verdere studies met levende cellen, zoals microcentrifugatie, gebruikt u een buisje met 1× PBS. Voor de fixatie vult u een dissectieschaal met voldoende vers bereide fixatieoplossing om een zebravis van drie tot zes maanden oud tijdens een dissectie volledig onder te dompelen.Giet vervolgens voldoende 0,02% trica bij pH 7 in een schaal. Selecteer een zebravis voor dissectie en plaats deze in de schaal met trica voor euthanasie, zodat de vis volledig bedekt is. Verwijder en gooi de kop van het dier weg zoals eerder getoond, maar plaats het dier ditmaal onmiddellijk in de dissectieschaal die PFA bevat.Na de verwijdering, waarbij het lichaam tijdens de procedure gedeeltelijk in het fixatiemiddel wordt gehouden, gebruikt u dissectiescharen om het lichaam van het dier via een ventrale incisie te openen, zoals eerder gedaan. Verwijder vervolgens de interne organen van het dier met een dissectiepen, waarbij u er zorgvuldig op toeziet de dorsale lichaamswand niet te raken. Plaats de organen in een container voor biologisch gevaarlijk afval.Gebruik, zoals voorheen, dissectienaalden om de lichaamswanden open te spelden, waarbij de spelden zo worden geplaatst dat de nier zichtbaar is. Fixeer het monster vervolgens gedurende de nacht. Plaats de schaal de volgende dag bij vier graden Celsius, verwijder de fixatieoplossing uit de schaal en vervang deze door één keer PBST.Koppel vervolgens, zoals eerder gedaan, de nier voorzichtig los van de dorsale lichaamswand door met één pincet het gehele nierorgaan in één stuk op te tillen terwijl u het scheidt van de onderliggende bindweefsels. Gebruik daarna een transferpipet met een wijde opening om de nier in een microcentrifugebuis te plaatsen voor verdere verwerking. Zoals hier getoond, na het verwijderen van de organen in de lichaamsholte, verschijnt de nier als een enkel afgeplat orgaan dat via bindweefsels aan de dorsale lichaamswand hecht.In deze figuur is de nier schematisch weergegeven om de karakteristieke anatomische vorm te tonen. Hier kunnen kadin 17-transcripten, gedetecteerd door whole-mount C2-hybridisatie van de nier, worden gezien in de tubulus van nefronen in een volwassen nier, met een vergroot beeld van de tubuluskleuring in het rechterpaneel. In deze figuur is in het linkerpaneel te zien dat M-A-F-B-A-transcripten gelokaliseerd zijn in proximale nefronceltypen in de volwassen nier.Het vergrote beeld van de M-A-F-B-A-expressie, zoals rechts gevisualiseerd, laat zien dat de transcripten specifiek gelokaliseerd zijn in de podocyten van de glomuli, zoals aangegeven door de p en de pijl, en in de proximale kronkelbuis, aangegeven door PCT en de haak. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de interne organen van de volwassen zebravis voorzichtig te verwijderen, zodat de nier voorafgaand aan de chirurgische isolatie na deze procedure niet wordt beschadigd. Andere methoden, zoals histologie of fluorescence-activated cell sorting, kunnen worden gebruikt om de ultrastructurele kenmerken van bloed- en niercelpopulaties te beoordelen of om specifieke populaties te isoleren voor celtransplantatie of primaire celkweek.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Dit protocol beschrijft een procedure voor het identificeren en ontleden van organen van de volwassen zebravissen.

Dissectie van organen van de Adult zebravis

Celtransplantatie is een essentiële techniek voor het bestuderen van weefselregeneratie en voor het ontwikkelen van cel-gebaseerde therapieën van de ziekte. We zien hier een microchirurgische techniek die de transplantatie van genetisch gemerkte cellen vergunningen direct in de nier van volwassen zebravissen vis.

Transplantatie van cellen direct in de nieren van Volwassen zebravis

This video demonstrates the dissection and preparation of a flat mount of the adult zebrafish kidney. The prepared flat mount can be visualized under the microscope for specimen analysis.

Kidney Flat Mount Preparation: A Procedure to Dissect and Prepare a Flat Mount for Microscopic Analysis of Adult Zebrafish Kidney

In this video, we demonstrate the depigmentation of adult zebrafish kidney and its subsequent preparation for staining procedures. Post-staining, the adult zebrafish kidney can be used for studying kidney regeneration, phenotypic characterization of renal disease models, and nephron functionality.

Depigmentation and Prestaining of Zebrafish Kidney: A Technique to Prepare Adult Zebrafish Kidney for Staining

De zebravis volwassen nier is een uitstekend systeem voor renale regeneratie en ziekte studies. Een essentieel aspect van dit onderzoek is de beoordeling van de nefron structuur en functie. Dit protocol beschrijft een aantal methoden die kunnen worden toegepast om nefron tubule samenstelling te beoordelen en om de renale reabsorptie evalueren.

Analyse van Nephron samenstelling en functie in de Adult zebravis Kidney

Hier presenteren we een betrouwbare methode om regeneratie van volwassen nieren te bestuderen door acute nierbeschadiging te induceren door gentamicine-injectie. We tonen aan dat de schade afhankelijk is van de gentamicine-dosering en de omgevingstemperatuur door middel van in situ hybridisatie om lhx1a+ zich ontwikkelende nieuwe nephronen te labelen.

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

Dit protocol beschrijft de procedures om acute nierschade (AKI) te veroorzaken bij volwassen zebravissen met cisplatine als nefrotoxisch middel. We beschreven de stappen om de reproduceerbaarheid van de techniek te evalueren en twee technieken om respectievelijk ontsteking en celdood in het nierweefsel, flowcytometrie en TUNEL te analyseren.

Acuut nierletselmodel geïnduceerd door Cisplatine bij volwassen zebravissen

Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.

Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen

De zebravis is een belangrijk model voor het begrijpen van de nierontwikkeling. Hier wordt een in situ hybridisatieprotocol geoptimaliseerd om genexpressie in zebravislarven en juvenielen te detecteren tijdens de ontwikkeling van mesonephros.

In situ Hybridisatie in zebravislarven en juvenielen tijdens mesonephrosontwikkeling

Leer de dissectie van de adulte zebraviskidney voor nier- en bloedcelonderzoek met Danio rerio. Deze methode ondersteunt celisolatie en transplantatiestudies.

Dissectie van de Adult zebravis Kidney

Meer video's verkennen