Laser Ablatie van de zebravis Pronephros renale epitheliale regeneratie Study

Het algemene doel van deze procedure is het gericht labelen van niercellen in de embryonale nier van de zebravis, het pronefros, om de regeneratie van het renale epitheel na acuut nierletsel te bestuderen. Dit wordt bereikt door zebravisembryo's eerst te micro-injecteren met een dextran-fluoresceineconjugaat. Tijdens een incubatie van één nacht worden de conjugaten selectief opgenomen door de proximale tubuluscellen van het nefron.

De volgende dag worden de cellen onder epi-fluorescentie onderzocht en worden geselecteerde cellen geablateerd met behulp van een gepulst lasersysteem. Later worden morfologische en moleculaire veranderingen beoordeeld via histologie, whole-mount C2-hybridisatie en immunohistochemie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het opwekken van acuut nierfalen met het nefrotoxische antibioticum gentamicin, is dat dergelijke behandelingen catastrofale schade veroorzaken en letaal zijn, waardoor de analyse van renale regeneratieprocessen over een tijdsverloop wordt belemmerd.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de nieren, zoals de identificatie van moleculaire signaleringsgebeurtenissen die plaatsvinden tijdens epitheliale regeneratie. We kregen het eerste idee voor deze techniek toen we een gedetailleerde analyse wilden ontwikkelen van renale epitheliale regeneratie in Petrischalen. Verzamel bevruchte zebravissenembryo's in gemodificeerde E3-oplossing zonder methyleenblauw.

Kweek de bevruchte embryo's bij 28,5 °C tot ze tussen de 48 en 55 uur na bevruchting oud zijn, wanneer het renale systeem van het embryo is gaan functioneren. Bereid vóór het starten van de injecties een injectieboom voor met behulp van een mal met driehoekige inkepingen om de embryo's vast te houden. Bereid vervolgens standaard micro-injectienaalden en een injectie-oplossing voor om de proximale tubulus te labelen. Begin het experiment met het voorbereiden van de embryo's.

Verwijder eerst het Corian van alle niet-uitgekomen eieren met een fijne pincet. Spoel vervolgens de Corian-resten en het residu uit de Petrischaal af en vul de schaal opnieuw met 30 milliliters gemodificeerde E three-oplossing. Narcoseer daarna de larven met vijf milliliters trica.

Controleer of de larven volledig zijn geanestheseerd door te testen op een aanrakingsrespons. Indien ze niet volledig zijn geanestheseerd, zullen ze tijdens de injectie trekken. Plaats vervolgens de larven met een plastic transferpipet in de mal.

Positioneer de dieren met hun koppen in het diepste deel van de inkeping en hun romp langs de zijkant van de put. Voer nu intramusculaire micro-injecties uit door een voorbereide naald te vullen met twee tot drie µL dextran fluoresceïne, positioneer de naald en injecteer ongeveer 1 nL oplossing in een romp-somiet van elk dier. De dextran-conjugaten worden gemakkelijk geendocyteerd door de proximale tubulus van het nefron, wat een preferentiële labeling van deze epitheliale celpopulatie mogelijk maakt.

Richt u op het bovenste gedeelte van het somiet en vermijd de uitbreiding van de dooierzak, anders raken de nefronbuisjes beschadigd, zoals bij dit onjuist geïnjecteerde dier. Zodra de larven zijn geïnjecteerd, brengt u ze over naar een schone Petrischaal en spoelt u ze drie keer met vers E3-medium om alle sporen van trypsine te verwijderen. Dek nu het deksel af met folie en incubeer de dieren gedurende de nacht bij 28 °C.

Bereid vóór aanvang van deze procedure het immobilisatiemedium voor; bewaar enkele aliquoten bij kamertemperatuur voor direct gebruik en bewaar de resterende aliquoten bij vier graden Celsius voor langdurige opslag. Begin met het anesthetiseren van de zebravislarven met vijf milliliters trica in 30 milliliters E3. Controleer, zoals voorheen, of de vissen niet reageren op tactiele stimulatie.

Onderzoek nu de geïnjecteerde dieren onder fluorescentie om larven te selecteren met gemakkelijk te visualiseren proximale tubuli. Breng maximaal 12 larven over naar een nieuw schaaltje met dezelfde concentratie trica onder een samengestelde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een fitzy-filter, veldlichtverlichting en een laserperform. De ablatie begint met het overbrengen en anesthetiseren van de larven naar een schaaltje met immobilisatiemedium.

Wacht vervolgens twee minuten en breng de larve over naar een glazen concave objectglas met een druppel immobilisatiemedium. Positioneer het dier voorzichtig met een fijne sonde met de dorsale zijde naar boven en focus op de dorsale zijde. Gebruik nu een gekalibreerd gepulst micro-punt lasersysteem om één van de nefronen te ablateren, terwijl het andere nefron intact blijft als controle.

U zult zien dat de fluorescentie verspreid raakt wanneer de renale epitheelcellen worden geablateerd. Verplaats het dier vervolgens voorzichtig naar een putje van een 12-wells schaal en spoel het drie keer met E3-medium om de methylcellulose weg te wassen. Ga door met het ablateren van nefronen totdat de eerste 12-wells schaal is gevuld.

Anestheseer vervolgens nog eens 12 dieren en herhaal het proces. Dextra Fitzy werd geïnjecteerd om bij voorkeur de proximale tubulus te labelen. Drie dagen na bevruchting werd het nefron van elk dier met een laser geablateerd.

Eén dag na ablatie. Regeneratie is vier dagen na ablatie niet zichtbaar, echter heeft regeneratie plaatsgevonden na celablatie in situ twee. Hybridisatie werd gebruikt om veranderingen in gefixeerde monsters op enkelvoudige tijdstippen te analyseren.

Dit embryo werd niet onderworpen aan ablatie. In tegenstelling hiermee was bij dit embryo een groot deel van het tubulaire epitheel geablateerd, en bij dit embryo was een kort segment tubulair epitheel geablateerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals whole-mount in situ hybridisatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de identiteit van veranderingen in genexpressie tijdens het verloop van nefronregeneratie.

Vergeet niet dat het werken met chemicaliën uiterst gevaarlijk kan zijn. Voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen zoals een laboratoriumjas en handschoenen, worden tijdens deze procedure aanbevolen.