Methode voor het nieuwe anti-kanker medicijn ontwikkeling met behulp van Tumor Explantaten van Chirurgische Specimens

Het algemene doel van deze procedure is het vaststellen van een nieuwe methode voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen met chirurgische specimens van hersentumoren, genaamd de tumor X explan-methode. Dit wordt bereikt door eerst vers verwijderde chirurgische specimens van maligne gliomen tijdens de operatie te verkrijgen voor preklinische experimenten. Vervolgens worden de monsters naar de centrale faciliteit voor weefselverwerving getransporteerd om ze te scheiden voor klinische diagnoses en onderzoeksdoeleinden.

Vervolgens worden in het onderzoekslaboratorium tumor-explantaten gedissekeerd in meerdere kleinere weefselstukjes en overgebracht naar een geoptimaliseerd medium. Ten slotte worden intratumorale injecties met geneesmiddelkandidaten uitgevoerd en worden de explantaten gedurende 16 uur geïncubeerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de effectiviteit van de behandeling onthullen via hematoxyline- en eosine-kleuring, evenals immunohistochemie met celtype-specifieke markers.

We kunnen de werkzaamheid van geneesmiddelen in vitro ook evalueren met behulp van flowcytometrie en assays voor de vorming van neurosfere. De meeste huidige assays voor de werkzaamheid van geneesmiddelen laten een kloof open tussen de werkzaamheid in de huidige preklinische experimentele modellen en de werkzaamheid bij patiënten. In het bijzonder kunnen we, wanneer we geneesmiddelkandidaten testen op solide tumoren zoals maligne gliomen, de intercellulaire en intracellulaire signaaluitwisselingen niet onderschatten.

Om verstoring van de micro-omgeving van solide tumoren te voorkomen, hebben we een kweekmethode ontwikkeld voor onze tumor-explantaten. Nadat de tumoren bij de patiënten zijn verwijderd, worden de monsters overgebracht van of naar de afdeling Pathologie. We verdelen de tumorfragmenten in twee stukken. Het tumorstuk uit het ene deel wordt gebruikt voor vriescoupes en paraffine-inbedding ten behoeve van de klinische diagnose, en het resterende tumorweefsel wordt naar de onderzoekslaboratoria gestuurd voor gebruik door de onderzoekers.

Met deze methode kunnen we de micro-omgeving van de tumor behouden, inclusief de aangrenzende tumorale endotheel- en immuuncellen, alsook normale hersencellen die zich ofwel rondom de tumor bevinden of in tumorcaviteiten migreren. Bereid vóór de verwerking van glioblastoomweefsel de vloeistof, het medium en de agarlopossing voor. Meng deze in een verhouding van één-op-één.

Voeg vervolgens één milliliter toe aan elke put van zesputs-platen. Na ontvangst van vers glioblastoma multiforme-weefsel wordt dit met een pincet overgebracht naar een Petrischaal en voorzichtig drie keer gewassen met vijf milliliter ijskoud 1× PBS met behulp van een scalpel en een pincet. Snijd uit de gedissecteerde monsters seriële secties van ongeveer 10 millimeter in diameter om tumorblokjes te maken; breng elk blokje over naar een put van de zesputs-plaat met agarmedium, waarbij voldoende blootstelling aan de lucht behouden blijft om de levensvatbaarheid te waarborgen.

Inject vervolgens, met gebruik van een insulinespuit van één milliliter en een naald van 28 gauge en een halve inch, de tumorblokken drie keer met 5% DMSO, 2,5 nanomolaire temozolomide of een nieuwe kandidaat voor een antikanker-geneesmiddel en incubeer deze gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius in bevochtigde lucht met 5% koolstofdioxide. Was de blokken na de incubatie drie keer met vijf milliliter 1x PBS. Fixeer de blokken vervolgens in 50 milliliter buizen met 10 milliliter 10% volume per volume formaline gedurende 24 uur.

Bed het weefsel in paraffine en snijd coupes van vier micron om de coupes te deparaffiniseren en te rehydrateren. Plaats de objectglazen in een rek en incubeer ze in de volgende oplossingen. Spoel drie keer met xyleen gedurende vijf minuten per keer.

Drie keer vijf minuten in 100% ethanol. Eén keer vijf minuten in 95% ethanol en één keer vijf minuten in 70% ethanol. Spoel tot slot drie minuten af onder stromend kraanwater.

Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor details over antigeenherstel en inhibitie van intern peroxide. Om de coupes te blokkeren, worden de weefsels bedekt met 10% normaal geiten serum, waarna de slides worden overgebracht naar een vochtige box en gedurende één uur bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Was de slides drie keer in 1x PBS gedurende vijf minuten per keer.

Voeg vervolgens primaire antilichamen toe, zoals mens-specifieke caspase 3 of KI 67, verdund in 1× PBS, en incubeer deze gedurende de nacht bij 4 °C. Spoel de coupes de volgende dag 3 keer af met 1× PBS gedurende telkens 10 minuten. Breng daarna twee tot drie druppels HRP-gelabeld secundair antilichaam aan op de weefsels.

Plaats de coupes in een bevochtigingskamer en laat deze één uur incuberen bij kamertemperatuur. Was drie keer met 1x PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Ontwikkel de monsters met een chromogeen DAB-kit volgens de instructies van de fabrikant om tegen te kleuren.

Dompel de objectglazen 10 tot 15 seconden onder in hematine. Spoel ze vervolgens gedurende drie minuten af onder stromend kraanwater. Dehydrateer de monsters door de objectglazen onder te dompelen in de volgende oplossingen, gevolgd door een montage-reagens en een dekglas.

Gebruik vervolgens een fluorescentiemicroscoop om de coupes te beelden. De T1-gewogen MRI-opname met gadolinium-contrast in deze figuur toont een contrastversterkende glioblastoma multiforme of GBM-tumor in de rechter frontale kwab van een patiënt vóór de operatie. De postoperatieve opname bevestigde een subtotale resectie van de laesie na de operatie.

Hematoxyline- en eosinekleuring brengt de aanwezigheid van necrose, pseudo-palisaderende cellen en microvasculaire proliferatie in beeld. Deze tumoren werden daarom histopathologisch gediagnosticeerd als GBM om te onderzoeken of deze tumor-explantaten betrouwbaar konden worden benut. Ten behoeve van een test voor drugseffectiviteit hebben we het effect van het geneesmiddel temozolomide of TMZ getest; immunohistochemie van TMZ-behandelde GBM-weefsels toont een aanzienlijke vermindering van KI 67-positieve tumorcellen aan in vergelijking met de controlemonsters.

Op hun beurt leverde immunohistochemie met de apoptosemarker caspase drie geen significant verschil op tussen de met TMZ behandelde glioompreparaten en de controlemonsters. Het effect van de behandeling met temozolomide kan verder worden gekarakteriseerd door deze ex explan assay te combineren met ofwel in vitro kweek of flowcytometrie. We kunnen deze ex explan methode vergelijken met xenograft transplantatie en in vitro sfeer-vormende assays voor het screenen van nieuwe antikankermiddelen.

Zodra u de tumorweefsels in het laboratorium heeft verkregen, kan de procedure voor dit experiment binnen één uur worden voltooid. Deze nieuwe assay is relatief eenvoudig uit te voeren en reproduceerbaar na dissociatie van behandelde tumorimplantaten. We kunnen dit combineren met in vitro experimenten.

Een belangrijk voordeel van deze assay is dat de tumoromgeving behouden blijft. We verkrijgen positieve gegevens met Temodar-behandelde tumorexplantaten, die consistent waren met de uitkomst van dezelfde patiënten die na chirurgische ingrepen een Temodar-behandeling ondergingen. Ten slotte is dit toepasbaar op andere solide tumoren en kan het daarom het potentieel hebben om de identificatie van nieuwe chemotherapeutische middelen voor de behandeling van solide tumoren te versnellen.