Name: In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Leer in vivo-elektroporatie van het netvlies bij neonatale muizen om genetisch materiaal stabiel te introduceren. Deze methode maakt gain- en loss-of-function studies mogelijk voor onderzoek naar retinale biologie en visuele functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door NIH R01EY020560-01 en door een WM Keck Young Scholar in Medical Research Award. De auteurs willen graag Joseph Bedont bedanken voor zijn hulp tijdens de beeldvorming van het netvlies voorbereidingen en injecties.

1. Plasmide voorbereiding voor elektroporatie De DNA-concentratie die nodig is voor elektroporatie is 5μg/μl. Dit vereist meestal het gewenste plasmiden te worden versterkt met behulp van een Maxi-prep (Qiagen) of gelijkwaardige methode, gevolgd door een zuivering en concentratie van het DNA naar de werkende bedrag. De volgende stappen beschrijven de voorbereiding van DNA naar de werkende bedrag. <ol><li> Aliquot 100 ug DNA (van Maxi-prep of gelijkwaardig) en verdun het volume op 100 ul voor het gemak van manipulatie. </li><li> Voeg fenol, de hoeveelheid fenol die moet worden berekend om een ​​ongeveer 60% DNA / volume verhouding (pg DNA: totaal volume) te verkrijgen namelijk: 100 ug DNA (in 100 ul) plus 67 pi fenol (100 ug: 167 pi). Meng grondig, niet pipet op en neer, omdat dit kan overmatige afschuiving van het DNA kunnen veroorzaken. </li><li> Spin van het DNA gedurende 5 minuten bij 14.000 RPM bij kamertemperatuur. </li><li> Verzamel supernatant en voeg chloroform met dezelfde DNA: totaal volume-verhouding in stap 1.2; mix zoals beschreven in stap 1.2 en draaien op 14.000 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verzamel de supernatant, 10% supernatans volume van 3 M natriumacetaat toe aan het DNA-oplossing toe te voegen, meng en voeg 2,5 X het supernatant volume van 100% ethanol. Meng door inversie. DNA moet neerslaan uit de oplossing tijdens het mengen. </li><li> Spin het DNA bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 14000 RPM. </li><li> Spoelen met 350 ul van 70% ethanol, draaien op 14.000 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> De lucht droog de pellet dan ontbinding van de DNA in een X PBS (Celbiologie graad) naar 5μg/μL. Niet Kreukherstellend monster als dit maakt het erg moeilijk op te lossen in PBS. </li><li> Voeg snel groen kleurstof (10% voorraad) om de DNA-oplossing, de uiteindelijke concentratie van de kleurstof is 0,1%, op te treden als een injectie tracer. </li></ol> 2. Subretinale injectie van DNA De volgende stappen worden uitgevoerd met de hulp van een stereomicroscoop. Zodra beoefend het proces van het oog openen, incisie, en injectie duurt minder dan 1,5 minuut, die niet genoeg tijd is voor een goed verdoofd pup om te herstellen. Met behulp van een scherpe 30-gauge naald, voorzichtig openen van de ogen door te snijden langs de gesmolten junctionele epitheel (figuur 1C). Doe niet te veel kracht, omdat dit kan resulteren in het snijden van de onderliggende oog. Vermijd het snijden buiten het bereik van het ooglid kruising, omdat dit zal resulteren in bloeden waar de injectie kan verduisteren. <ol><li> Verdoven van de pasgeboren muizen op ijs gedurende enkele minuten (Fig. 1A), niet begraven pups in het ijs, omdat dit kan leiden tot sterfte. De lengte van de tijd op het ijs is variabel van pup tot pup, meestal vijf minuten is voldoende, maar muizen moeten zorgvuldig worden gecontroleerd als individuen kunnen heel snel in te spelen of kan langere blootstelling nodig heeft om juiste verdoving zorgen. Voer een poot knijpen met hemostats om te controleren of voor de terugtrekking reflex. </li><li> Om de injectie van DNA te vergemakkelijken van de subretinale ruimte in het oog moet eerst worden geopend. Wattenstaafje het oog te worden geïnjecteerd met een 70% isopropyl alcohol prep (Tyco Healthcare) en identificeren van de gesmolten junctionele epitheel, waar de twee oogleden bij elkaar komen (Fig. 1B). </li><li> Met behulp van een scherpe 30-gauge naald, voorzichtig openen van de ogen door te snijden langs de gesmolten junctionele epitheel (figuur 1C). Doe niet te veel kracht, omdat dit kan resulteren in het snijden van de onderliggende oog. Vermijd het snijden buiten het bereik van het ooglid kruising, omdat dit zal resulteren in bloeden waar de injectie kan verduisteren. </li><li> De penetratie van de ogen vergemakkelijken door de stompe eindigde injectienaald gebruik maken van de tip van een 30-guage naald maakt een kleine incisie in de sclera de buurt van de kruising met het hoornvlies (fig. 1E). Niet te diep doordringen, omdat dit kan leiden tot een punctie van de lens. </li><li> Teken 0,3 ul van DNA-oplossing in een 33 meter stompe eindigde injectienaald met behulp van de spuit gradiënten om het volume te meten, voor elke injectie (naald buitendiameter 0,52 mm, inwendige diameter 0,13 mm, Exmire micro-, Ito corp). Steek de naald in de incisie tot aan de weerstand van de tegenstander sclerale muur wordt gevoeld. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het penetreren van de lens als de naald wordt door de vitreale kamer (Fig. 2B). </li><li> Injecteer langzaam 0,3 ul van DNA-oplossing in de subretinale ruimte met behulp van de wijsvinger of duim op de zuiger drukken. De onderzoeker moet voorzichtig zijn om de snelheid van de plunjer depressie, zodat de snelheid waarmee de DNA-oplossing wordt geïnjecteerd in de subretinale ruimte niet de snelheid waarmee de DNA-oplossing verspreidt zich binnen subretinale ruimte (fig. 2C) overtreffen controle. De DNA-oplossing is stroperig dus is het belangrijk dat de naald niet te strak gedrukt tegen de tegenstander sclerale muur als dit kan resulteren in het DNA niet wordt geïnjecteerd of niet verspreiden gelijkmatig. Een succesvol injectie zal resulteren in een nogverspreiding van de DNA-oplossing in een deel van de subretinale ruimte. Regio's van het netvlies met en zonder achterliggende groene tracer moet worden duidelijk bij het draaien van de geïnjecteerde dier. </li></ol> 3. Elektroporatie <ol><li> Elektroporatie is uitgevoerd met behulp van een 10 mm diameter pincet elektrode (Model # 522; BTX Instruments). Genieten van de pincet elektrode in PBS om de elektrische geleidbaarheid te maximaliseren van de elektrode naar het dier en plaats het hoofd van de geïnjecteerde pup tussen de elektroden met de geïnjecteerde oog grenzend aan de positieve pool elektrode en de niet-gespoten oog grenzend aan de negatieve pool elektrode (Fig. 3B). </li><li> Van toepassing zijn vijf vierkante pulsen met behulp van een pulsgenerator: elke puls is 80 volt en 50 milliseconden in duur met een 950 milliseconde interval tussen impulsen. </li><li> De geëlektroporeerde pups moet nu worden opgewarmd tot ze herstellen van het ijs anesthesie. Dit kan gedaan worden door het plaatsen van de pups onder een warming lamp of op de top van een dia warmer. Als u een dia warmer ervoor te zorgen dat een geschikt pad is geplaatst tussen het metalen oppervlak en de herstellende pup. Na reparatie terug de geëlektroporeerd pups aan hun moeder. </li></ol> 4. De voorbereiding van de ogen voor de analyse <ol><li> De tijd van oogsten en de analyse van de geëlektroporeerd netvlies wordt uitgevoerd met inachtneming van de doelstellingen van het experiment. GFP expressie kan worden schromelijk gevisualiseerd 3 dagen na elektroporatie. Voor cryoembedding en snijden als volgt te werk. </li><li> Offeren geëlektroporeerde dieren op de gewenste tijdpunt. Disect de geëlektroporeerd ogen corrigeren en in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 50 minuten. </li><li> Verwijder voorzichtig het netvlies van het oog door micro-ontleden weg de sclera, hoornvlies, de lens, choroidea en retinale pigment epitheel. De ontleed netvliezen kunnen worden geanalyseerd onder fluorescentie aan grove bepalen van de efficiëntie van elektroporatie. Breng de retina tot 30% sucrose-oplossing overnacht bij 4 ° C. </li><li> Freeze netvliezen in oktober cryo-embedding media (Sakura Finetek USA) en bewaar bij -80 ° C. Netvliezen kunnen nu coupes op een cryotome en veroverde op glas dia's. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Voorbeelden van P0 neonatale netvliezen geëlektroporeerd met een pCAG-EGFP expressie-plasmide worden gepresenteerd op 3 dagen na de elektroporatie (P3) en 14 dagen na elektroporatie (P14) in figuur 4. Het gebied van geëlektroporeerde retinaal weefsel is variabel van experiment om te experimenteren afhankelijk van de mate van weefselschade opgelopen tijdens de injectie en de gelijkmatigheid van de verspreiding van de DNA-oplossing in de subretinale ruimte. Typisch 90-100% van geëlektroporeerd netvlies zal beschikken over cellen die met succes hebben opgenomen en sprak de invoering plasmide. Echter, wanneer factoring in weefsel morfologie en elektroporatie efficiency slechts 40-60% van de geëlektroporeerd netvlies zal geschikt zijn voor een vergelijkende analyse. Rosette vorming en loslaten van het netvlies op de plaats van naald is bijna altijd waargenomen en deze regio mag niet gebruikt worden voor analyse. Succesvolle DNA verspreid tijdens de micro-injectie resulteert in een efficiënt geëlektroporeerd weefsel lateraal op de site van naald vrij van rozetten en onthechting. Gliosis is ook een belangrijke experimentele zorg en ontstaat vrijwel altijd op de plaats van de naald. Echter, zoals met rozet vorming en loslaten van het netvlies, gliosis is meestal niet significant in lateraal geëlektroporeerd weefsel. Immunohistochemische markers zoals gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) kan worden gebruikt om te bepalen of het niveau van reactieve gliosis bij de analyse van de regio's binnen aanvaardbare drempels. Doorsnede netvliezen waaruit blijkt dat de morfologie van de geëlektroporeerd netvlies intact blijft en dat EGFP expressie labels individuele geëlektroporeerde cellen worden gepresenteerd. Voorbeelden 3 dagen na een P0 elektroporatie (Fig. 4A-C) en 14 dagen na een P0 elektroporatie (fig. 4D-F) worden gepresenteerd. In P3 netvliezen de meerderheid van de geëlektroporeerde cellen bevinden zich in de neuroblastic laag (NBL) van het netvlies, en niet aan te tonen duidelijke morfologische kenmerken van een van de gedifferentieerde neurale of gliale cellen van het netvlies (Fig. 4B, C). Door P14 geëlektroporeerde cellen kan worden gevonden in de buitenste nucleaire laag (ONL) en de binnenste nucleaire laag (INL) van het netvlies. Verder zijn de verschillende gelabelde cellen nu weer karakteristieke morfologische kenmerken van gedifferentieerde neuronen waaronder interneuronen van het INL, fotoreceptoren, en Müller glia (Afb. 4E, F). <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Anesthesie van een pasgeboren (P0) muis pup en de opening van oog voor subretinale injectie van DNA-oplossing. A) Neonatale pup geplaatst opeen bed van gebroken ijs voor de verdoving. Oog te injecteren wordt geplaatst naar beneden tegen het ijs. B) De plaats van de gesmolten junctionele epitheel (B, pijl) van de oogleden te snijden voor de opening van de ogen. C) Het snijden van de oogleden langs de gesmolten junctionele epitheel (C, pijl) om de ogen bloot te leggen. D) De geopende ogen na het snijden in de gesmolten kruising. E) wordt een incisie gemaakt in het oog beneden in de sclera onder het hoornvlies om gemakkelijke insertie van de stomp eindigde micro-injectiespuit te vergemakkelijken. Schaal van bars, B, C, D, E: 4mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Inbrengen van de stomp eindigde micro-injectie spuit en injectie van DNA-plasmide-oplossing in de subretinale ruimte. A) Cartoon schematisch het aantonen van de juiste plaatsing van de micro-injectiespuit in het oog en de afwikkeling van de spuit in de subretinale ruimte. Injectie van de DNA-oplossing in het glasvocht kamer, zal de passage van de spuit door het oog in het stopcontact, of een injectie in de lens resulteren in mislukte experimenten met weinig of geen geëlectroporeerd cellen. B) De penetratie van de spuit in de incisie gemaakt in de sclerale muur en de vereffening van de spuit in de subretinale ruimte. C) injectie van de DNA-oplossing in de subretinale ruimte. Schaal van bars, B, C: 4mm. Afkortingen als volgt: R-netvlies, L-lens, V-glasvocht, SRS-subretinale ruimte, BES-stomp eindigde spuit. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Oriëntatie van de pincet elektrode op de muis voor elektroporatie. A) Cartoon schematisch het aantonen van de oriëntatie van de positieve en negatieve peddels van de pincet elektrode ten opzichte van de geëlektroporeerd oog. Groen staat voor de locatie van het geïnjecteerde DNA in de subretinale ruimte. Gestippelde pijlen geven de elektroforetische beweging van negatief geladen DNA geïnjecteerd naar de positieve elektrode. DNA-elektroforese komt uit de subretinale ruimte grenzend aan de negatieve elektrode in het netvlies, die gericht is op de positieve elektrode. B) De positieve peddel van de pincet is geplaatst naast het DNA gemicroinjecteerd oog en de negatieve paddle grenst geplaatst om de niet-gespoten oog. C) Hoge vergroting afbeelding van tweezer elektrode plaatsing op de neonatale muis. Stippellijnen geven de richting van de elektroforetische beweging van DNA naar de positieve elektrode. Schaalbalk, C: 5mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Neonatale muis netvlies (P0) geëlektroporeerd met pCAG-EGFP en geanalyseerd op postnatale dag 3 (P3) en postnatale dag 14 (P14). AC) confocale beelden van een doorsnede P3 netvlies geëlektroporeerd met pCAG-EGFP bij P0. De meerderheid van de geëlektroporeerde cellen zitten in de retinale neuroblastic laag (NBL). (DF) confocale beelden van een doorsnede P14 netvlies geëlektroporeerd met pCAG-EGFP bij P0. Geëlektroporeerde cellen kunnen worden geïdentificeerd in de buitenste nucleaire laag (ONL) en de binnenste nucleaire laag (INL) van het netvlies. Schaal Bars, AF: 50 um.

<ol><li>Neumann, E., Rosenheck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+changes+induced+by+electric+impulses+in+vesicular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).</li>
<li>Turnbull, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Letter%3A+Letter%3A+An+alternate+explanation+for+the+permeability+changes+induced+by+electrical+impulses+in+vesicular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).</li>
<li>Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+ion+flow+in+Escherichia+coli+B+and+electrical+sizing+of+bacterias%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias.</a> Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).</li>
<li>Kinosita, K., Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-induced+pore+formation+and+hemolysis+of+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparking+new+frontiers%3A+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pias3-dependent+SUMOylation+directs+rod+photoreceptor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development.</a> Neuron. 61, 234-246 (2009).</li>
<li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+hormone+receptor+ERRbeta+controls+rod+photoreceptor+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).</li>
<li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Core+Paired-Type+and+POU+Homeodomain-Containing+Transcription+Factor+Program+Drives+Retinal+Bipolar+Cell+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression.</a> J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li>
</ol>

In vivo elektroporatie staat voor een snelle en efficiënte methode voor de transformatie van retinale cellen met DNA expressie plasmiden. Deze methode laat de experimentator te winnen van de functie studies uitvoeren door ectopisch de introductie van een gen van interesse onder de controle van een alom uitgesproken organisator of verlies van functie studies uit te voeren door gebruik te maken shRNA constructies gericht op genen van belang. Bovendien kunnen meerdere DNA plasmiden gelijktijdig worden geëlektropor...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Buffer Verzadigde Fenol </td><td> Invitrogen </td><td> 15513-039 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> JT Baker </td><td> 9180-03 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Natriumacetaat </td><td> JT Baker </td><td> 3470-05 </td><td> 3 M voorraad </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Fisher Biotech </td><td> BP123-10 </td><td> 10% aandelen </td></tr><tr><td> Isopropylalcohol prep </td><td> Tyco Healthcare </td><td> 6918 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 30-guage naald </td><td> Terumo Medical Corp </td><td> SG2-3013 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Exmire micro- </td><td> Ito Corporation </td><td> MS * E05 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Tweezertrode (pincet elektrode) </td><td> BTX Instrument, Genetronics Inc </td><td> 522 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Electro Plein Porator (electroporator) </td><td> BTX Instrument, Genetronics Inc </td><td> ECM 830 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Oktober Compound </td><td> Sakura Finetek USA </td><td> 4583 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

in vivo elektroporatie van de ontwikkelingslanden mouse retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

De functionele karakterisering van genen die tot expressie tijdens de zoogdieren het netvlies ontwikkeling blijft een belangrijke uitdaging. Gene targeting op constitutieve of voorwaardelijke verlies van functie knockouts genereren blijft kosten en arbeidsintensief, maar ook tijdrovend. Toe te voegen aan deze uitdagingen, retina uitgedrukte genen kan een essentiële rol buiten het netvlies leidt tot onbedoelde verwart hebben bij het gebruik van een knock-out aanpak. Verder kan de mogelijkheid om ectopisch drukken een gen in een winst van functie experiment uiterst waardevol bij een poging om een ​​rol in het lot van de cel specificatie en / of terminale differentiatie te identificeren. We presenteren een methode voor een snelle en efficiënte integratie van DNA plasmiden in de neonatale muis netvlies door middel van elektroporatie. De toepassing van korte elektrische impulsen boven een bepaalde veldsterkte resulteert in een voorbijgaande stijging in het plasma membraan permeabiliteit, het vergemakkelijken van de overdracht van het materiaal over het membraan 1,2,3,4. Baanbrekende werk aangetoond dat elektroporatie kunnen worden gebruikt als een methode van de genetische overdracht in cellen van zoogdieren door het induceren van de vorming van hydrofiele plasmamembraan poriën waardoor de doorgang van sterk geladen DNA door middel van de lipide bilaag 5. Voortdurende technische ontwikkeling heeft geresulteerd in de levensvatbaarheid van elektroporatie als een methode voor in vivo genoverdracht in meerdere muis weefsels waaronder het netvlies, de methode die is hierin 6, 7, 8, 9, 10 beschreven. DNA-oplossing wordt geïnjecteerd in de subretinale ruimte, zodat DNA wordt geplaatst tussen de retinale pigment epitheel en het netvlies van de neonatale (P0) muis en elektrische pulsen worden toegepast met behulp van een pincet elektrode. De zijdelingse plaatsing van de ogen in de muis zorgt voor de gemakkelijke oriëntatie van de pincet elektrode om de nodige negatieve pool-DNA-netvlies-positieve pool uitlijning. Uitgebreide integratie en expressie van genen die overgedragen kunnen worden geïdentificeerd door postnatale dag 2 (P2). Vanwege het ontbreken van significante zijwaartse migratie van cellen in het netvlies, zijn geëlektroporeerd en niet-geëlektroporeerd regio&#39;s gegenereerd. Niet-geëlektroporeerd regio&#39;s kunnen dienen als interne histologische controles waar nodig. Retinale elektroporatie kan worden gebruikt om een ​​gen onder een alomtegenwoordige promotor, zoals CAG uit te drukken, of om gen-functie met behulp van shRNA construeert of Cre-recombinase verstoren. Meer gerichte expressie kan worden bereikt door het ontwerpen van constructies met cel specifiek gen promoters. Visualisatie van geëlektroporeerde cellen is bereikt met behulp van bicistronische bouwt uiten van GFP of door de co-electroporating een GFP-expressie-construct. Bovendien kunnen meerdere constructies worden geëlektroporeerde voor de studie van de combinatorische gen effecten of gelijktijdige winst en verlies van functie van verschillende genen. Netvlies elektroporatie kan ook worden gebruikt voor de analyse van genomische cis-regulatorische elementen door het genereren van juiste expressie constructen en deletiemutanten. Dergelijke experimenten kunnen worden gebruikt om de cis-regulerende gebieden voldoende of vereist zijn voor cel-specifieke genexpressie 11 te identificeren. Mogelijke experimenten zijn alleen beperkt door de bouw beschikbaarheid.

Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie studies<em&gt; In vivo</em&gt; Wordt gepresenteerd. Deze methode speelt in op de tijdelijke verhoging van de permeabiliteit van de cel-plasma membranen veroorzaakt door de toepassing van een extern elektrisch veld.

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

De functionele karakterisering van genen die tot expressie komen tijdens de ontwikkeling van het netvlies bij zoogdieren blijft een aanzienlijke uitdaging. Gene targeting om ... te genereren

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een in vivo electroporatie-experiment bij pasgeboren muizen om genetisch materiaal stabiel in de cellen van het netvlies te introduceren. Dit wordt bereikt door eerst een pasgeboren muis ongeveer vijf tot 10 minuten op ijs te anesthetiseren. De tweede stap van de procedure is het identificeren van de overgang van de vergroeide oogleden en het openen van het oog door langs deze overgang te snijden.Vervolgens wordt er een incisie in het oog gemaakt om de insertie van de micro-injectiespuit te vergemakkelijken. De micro-injectiespuit wordt vervolgens door de incisie ingebracht en de DNA-oplossing wordt in de subretinale ruimte geïnjecteerd. Tot slot wordt een pincetelektrode op de kop van de pop geplaatst en wordt er een reeks elektrische pulsen toegediend.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals retrovirale transductie, is dat in vivo electroporatie geen generatie en hantering van biologische agentia als instrumenten voor genoverdracht vereist. Bijgevolg vergt de techniek minder arbeid, minder reagentia en kan deze worden uitgevoerd op elk werkstation dat is goedgekeurd voor dierproefprocedures. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat het tijd en herhaling kost om een gevoel te ontwikkelen voor de plaatsing van de microinjectiespuit in de subretinale ruimte.De procedure wordt gedemonstreerd door Jimmy DeMilo, een postdoctoral fellow in mijn laboratorium. Omdat de DNA-concentratie die nodig is voor elektroporatie relatief hoog is, wordt het gewenste plasmide-DNA eerst geamplificeerd in incompetente cellen geëxtraheerd met behulp van een maxi-prep, vervolgens gezuiverd en geconcentreerd tot ongeveer 5 µg/µL. Fast green FCF-kleurstof wordt toegevoegd als injectiesporender.Zodra het plasmide-DNA is voorbereid, worden de pasgeboren muizenpups op ijs geanestheseerd gedurende ongeveer vijf minuten, waarbij ze worden gemonitord tot bewusteloosheid is bevestigd door compressie van het voetkussen. Reinig het gebied rond het oog dat geïnjecteerd gaat worden met 70% isopropylalcohol en gebruik een dissectiemicroscoop om het FUS junctioneel epitheel te identificeren waar de oogleden samenkomen. Open het oog voorzichtig met een scherpe naald van 30 gauge door te snijden langs het gefuseerde junctioneel epitheel, zonder overmatige neerwaartse druk uit te oefenen of buiten het bereik van het ooglid te snijden.Zodra het ooglid is geopend en het oog is blootgelegd, gebruikt u de punt van de naald om een kleine incisie in de sclera te maken nabij de overgang naar het hoornvlies, waarbij u er zorgvuldig op toeziet dat u niet te diep penetreert en de lens doorprikt. Voer de stompe injectienaald in de incisie in. Injecteer langzaam 0,3 µL van de viskeuze DNA-oplossing in de subretinale ruimte, precies tot het moment dat de weerstand van de tegenoverliggende sclera-wand wordt gevoeld.Draai het dier voorzichtig rond om te controleren of de DNA-oplossing gelijkmatig over de retina is verspreid, waarbij u erop let niet te hard tegen de sclera te drukken. Week eerst de pincetelektrode in PBS om de elektrische geleidbaarheid te maximaliseren. Plaats vervolgens de kop van de geïnjecteerde pup tussen de elektroden, waarbij het geïnjecteerde oog zich naast de positieve pool電elektrode bevindt en het niet-geïnjecteerde oog naast de negatieve pool電elektrode.Pas vijf vierkante pulsen toe met een pulsgenerator, waarbij elke puls een spanning van 80 volt en een duur van 50 milliseconden heeft, met een interval van 950 milliseconden tussen de pulsen. Warm de pups vervolgens op onder een warmtelamp tot ze zijn hersteld van de ijshypothermie. Keer na het herstel de ge-electroporeerde pups op postnatale dag drie terug naar hun moeder.De meeste met EGFP ge-electroporeerde cellen bevinden zich in de neuroplastische laag van het netvlies en vertonen geen duidelijke morfologische kenmerken van de gedifferentieerde neurale gliacellen van het netvlies. Tegen postnatale dag 14 kunnen de ge-electroporeerde cellen worden aangetroffen in de buitenste nucleaire laag en de binnenste nucleaire laag van het netvlies, en vertonen de verschillende gelabelde cellen nu karakteristieke morfologische kenmerken van gedifferentieerde neuronen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle stappen vloeiend en gelijkmatig uit te voeren. Het is zeer eenvoudig om de retina's te beschadigen tijdens de micro-injectie; er is oefening nodig om de handmatige behendigheid te ontwikkelen die vereist is om weefselschade te voorkomen. Volg deze procedure.Andere methoden, zoals immunohistochemie of in situ hybridisatie, kunnen worden uitgevoerd om vast te stellen of de expressie van de genen van belang is opgereguleerd of neergereguleerd in de elektro-retina's.

in-vivo-electroporation-of-developing-mouse-retina

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren wij twee technieken voor het manipuleren van genexpressie in muriene retinale ganglioncellen (RGC)...

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om de activiteit van cis-regulatorische elementen (dat wil zeggen, enhancer / promotor) te kwantificeren in levende muis netvlies via explantatie elektroporatie. DNA-voorbereiding, retinale dissectie, elektroporatie, retinale Explantatie cultuur, en post-fixatie analyse en kwantificering worden beschreven.

Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van...

In vitro Elektroporatie van de Tweede Rhombic Lip van Midgestation muizenembryo&#39;s

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

Deze procedure laat zien hoe interneuronen in de zich ontwikkelende voorhersenen van muizen kunnen worden gericht door middel van in utero elektroporatie. Deze techniek was bijzonder efficiënt om selectieve genexpressie in interneuron-subtypen te bereiken die bestemd zijn voor de oppervlakkige lagen van de cortex.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Dit protocol beschrijft een methode te ontleden, experimenteel manipuleren en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explantkweken zijn bruikbaar wanneer hoge succespercentage, werkzaamheid en reproduceerbaarheid nodig om de effecten van elektroporatie van plasmiden en / of reagens stoffen, dat wil zeggen enzymatische inhibitoren testen.

Hele netvlies Explantaten van kippenembryo&#39;s voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen

Leer in vivo-elektroporatie van het netvlies bij neonatale muizen om genetisch materiaal stabiel te introduceren. Deze methode maakt gain- en loss-of-function studies mogelijk voor onderzoek naar retinale biologie en visuele functie.

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

Meer video's verkennen