Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Het algemene doel van het volgende experiment is om subcellulaire gebeurtenissen tijdens vroege embryogenese Insino Ratu elegance vast te leggen. Dit wordt bereikt door het gebruik van transgene stammen met meerdere fluorescent gelabelde eiwitten die de visualisatie van DNA mogelijk maken, evenals subsets van blaasjes. In het vroege embryo worden specifieke organellen gelabeld door micro-injectie van fluorescente kleurstoffen, zoals Lyo tracker of MIT tracker in de gonaad van de volwassen worm. Vervolgens worden embryo's uit volwassen wormen gesneden en waargenomen met een confocale microscoop om time-lapse opnamen te verkrijgen van de bewegingen van de gelabelde eiwitten in organellen.

Uiteindelijk onthult het protocol interessante bewegingen van lysosomen en GFP-gelabelde blaasjes tijdens de vroege ontwikkeling in CL allergans. Mijn naam is Connie Hedger, en vandaag laat ik zien hoe we time-lapse microscopie uitvoeren in ons lab, het Boyd lab aan de Universiteit van Alabama in Huntsville. Voor dit experiment, gro nematoden op NGM agri platen, bezet met een OP 50 bacteriën-mat op 25 graden Celsius de dag voor het experiment, pluk ten minste 40 L vier larven op bezette platen en incubeer ze een nacht op 25 graden Celsius.

Deze wormen worden jonge volwassenen. Voor het experiment. Maak een injectiepad door twee druppels van 2% aros in water van een past pipette tussen twee dekglasjes te plaatsen en druk uit te oefenen om de agros in een cirkel van 1,5 centimeter diameter te vormen.

Verwijder het bovenste dekglas en dehydrateer het pad door het een uur in een oven van 80 graden Celsius te plaatsen, of laat het een nacht op de werkbank staan. Op de dag van de injectie, bereid een verdunde MIT tracker of lyo tracker kleurstofoplossing en trek injectienaalden uit een 1,2 od glazen capillair. Vul de naalden terug met een verdunde kleurstofoplossing en bewaar ze in een donkere bevochtigde kamer. Monteer de injectienaald op de micro manipulator en verbind de naald met een drukregelaar met een buis met een interne diameter van 1,2 millimeter.

Plaats nu twee druppels zware minerale olie op het injectiepad. Plaats het injectiepad op de microscoop en laat de naald in de olie zakken. Oefen injectiedruk uit en observeer of er vloeistof uit de naald stroomt.

Indien niet, moet u het uiteinde van de naald voorzichtig breken door de punt voorzichtig in een klein stukje gebroken dekglas op het injectiepad te duwen. Nadat de naald stroomt, gaat u verder met de injectie een uur voorafgaand aan het bekijken van embryo's. Gebruik een pic om jonge volwassen wormen over te brengen naar de oliedruppel op het injectiepad.

Rij drie tot 10 wormen parallel en iets minder dan een wormlengte uit elkaar. Het is nu belangrijk om de wormen snel te injecteren voordat de wormen uitdrogen. Verplaats het pad met wormen naar de microscooptafel.

Focus op het centrale deel van de distale gonaad. Gebruik vervolgens de micro manipulator om de punt van de naald naar hetzelfde brandpunt te bewegen. Prik de worm door de tafel horizontaal te bewegen.

Wanneer de naaldpunt binnen de cus is, oefen druk uit om de gonaad te vullen met het kleurstofmengsel. De gonaad zal uitzetten met het volume van de injectie. Ga verder met injecteren.

Beide go net armen van elke worm na injectie. Bedek de wormen met 0,5 milliliter eierbuffer. Gebruik een getrokken weidepipet en laat de wormen vervolgens één tot twee uur herstellen bij kamertemperatuur in een lichtvrije bevochtigde kamer.

Begin met het voorbereiden van een nieuw agros pad voor het bekijken van de geïnjecteerde embryo's met een past pipette. Doe drie druppels gesmolten agros op een schone microscoopslide en plaats die slide tussen twee andere slides die in één laag etiket zijn gewikkeld. Plak de tape aan de tape controleert de dikte van het pad.

Druk vervolgens de schone microscoopslide neer op de agros druppels zodat deze op de tape slides rust. Verwijder de bovenste slide niet totdat de embryo's klaar zijn om te monteren. Laat nu 20 microliter eierbuffer vallen op het midden van een dekglas en breng de geïnjecteerde wormen over in de buffer. Onder een dissectiemicroscoop, snijd de wormen open nabij de vulva.

Gebruik een 26 gauge hypodermische naald, de embryo's zullen uit de worm lopen. Verwijder nu de bovenste slide van de beeldslide en laat de aros pad ondersteboven op het dekglas met de embryo's zakken. Als de embryo's gedurende een langere periode worden afgebeeld, verzegel de randen van het dekglas met vaseline om uitdroging te voorkomen.

Begin nu met afbeelden door embryo's te lokaliseren onder de 10 x objectief om embryo's in een vroeg stadium te vinden, zoek naar embryo's die in het proces zijn van het voltooien van maternale meiose. Myotische embryo's kunnen worden onderscheiden van latere embryo's omdat ze geen verkorting hebben ondergaan. Na het voltooien van de meiose, is er een significante opening tussen het celmembraan en de eierschaal aan het voorste uiteinde van het embryo.

Zodra een embryo in een geschikt stadium is geïdentificeerd, gaat u naar een lens met hogere vergroting voor het opnemen van embryogenese. Dit embryo toont zowel M kersenhistone twee B als GFP ubiquitine gelabelde eiwitten. Het maternale en vaderlijke DNA is zichtbaar via de M kersen H twee B, en toont dus de stadia van vroege ontwikkeling.

Dit embryo werd geïnjecteerd met OC Tracker blauw en toont GFP Ubiquitine. De afbeeldingen werden gemaakt met behulp van een 63 x 1,4 NA lens met 4 88 en 5 55 lasers ingesteld op minimale vermogen en maximale versterking. Typisch worden Zacks verzameld om de 10 tot 15 seconden gedurende maximaal 60 tijdstippen voordat fotobleken optreedt.

Voor deze TimeLapse video werden de Z stacks samengevouwen tot maximale projectieafbeeldingen Tijdens het uitvoeren van time-lapse microscopie zouden embryo's binnen een paar minuten na het voltooien van myosis twee moeten beginnen met pronucleaire migratie, en binnen 20 minuten. De eerste cytokinese zou moeten beginnen.

Als u een gestopte ontwikkeling van uw embryo's observeert, probeer dan de laserintensiteit te verlagen of gebruik een dikker auguros pad pad