Name: Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Leer BrdU-etikettering en FACS voor identificatie van DOC-afbrekende bacterioplankton in aquatische ecosystemen. Deze methode isoleert actief groeiende cellen voor taxonomische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering van dit project werd verzorgd door de National Science Foundation verleent OCE1029607 (tot XM) en MCB0702125 (tot MAM) en de Gordon en Betty Moore Foundation (tot MAM).

1. Watermonster verwerking <ol><li> Filter 10L milieu water door middel van een urn-poriegrootte membraanfilters tot grote deeltjes en bacteriovores te verwijderen. Verzamel het water filtraat in een mandfles. </li><li> Transfer 36 ml filtraat elk in drie steriele Eppendorf buisjes (50 ml) met 4 ml vers bereide paraformaldehyde-oplossing (PFA, 10%). Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur aan cellen te behouden. Verzamel cellen op 0,22-um-poriegrootte wit membraanfilters door vacuüm filtratie. Was het filter door het passeren 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door het filter door vacuümfiltratie. Label de filters als negatieve controles en bewaar ze bij -20 ° C. </li></ol> Stappen 1.3-1.4 zijn optioneel voor de oprichting van DOC-beperkte voorwaarden. <ol start="3"><li> Voeg een mengsel van anorganische stikstof en fosfor (5 uM NH 4 Cl, 5 uM NaNO 3, en 1 uM NaH 2 PO 4 uiteindelijke concentratie) in de mandfles. </li><li> Incubeer in het donker bij in situ temperatuur gedurende 48 uur met af en toe onrust. </li></ol> 2. Microkosmos vestiging en incubatie <ol><li> Vul elk van de zes 1-L glazen bokalen met 800 ml water monster uit de mandfles van stap 1.4 tot microkosmossen vast te stellen. Voeg BrdU (10 uM, uiteindelijke concentratie) aan elke microkosmos. Meng goed. </li><li> Voeg 1 ml model DOC samengestelde oplossing in drie van de microkosmos, zullen deze dienen als DOC wijzigingen. Voeg 1 ml steriele PBS in de drie overgebleven microkosmos, zullen deze dienen als no-toevoeging controles. </li><li> Broed alle microkosmossen in een incubator shaker en incubeer in het donker bij in situ temperatuur, terwijl schudden bij 100 rpm. </li><li> Verzamel 36 ml water monster van de microkosmos en overbrengen naar 50 ml steriele Eppendorf buisjes op de tijdstippen van 0, 8, 16 en 24 uur. Onmiddellijk toevoegen 4 ml verse PFA (10%) aan inzameling buizen en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur om de cellen te behouden. </li><li> Filter bewaard cellen door middel van 0.22-um-poriegrootte membraanfilters van polycarbonaat. Was de filters met 10 ml PBS. Ga meteen naar de volgende stap of bewaar de filters bij -20 ° C. </li></ol> 3. In situ immunodetectie voor BrdU Incorporation <ol><li> Ontdooi de filters (DOC gewijzigd monsters, no-toevoeging controles en negatieve controles) bij kamertemperatuur. </li><li> Breng 1 ml van lysozym-oplossing [10 mg / ml lysozym eiwit in 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4 tot en met bacteriële cellen op het filter te dekken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was het filter door het passeren 10 ml PBS erdoor onder afzuiging. </li><li> Voeg 1 ml proteinase K-oplossing [2 mg / ml proteinase K in 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4 tot en met bacteriële cellen op het filter te dekken. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was het filter door het passeren 10 ml PBS erdoor onder afzuiging. </li><li> Voeg 1 ml exonuclease oplossing [exonuclease III (50 U / ml) in 5 mM MgCl 2 en 50 mM Tris-HCl] 5 om bacteriële cellen op het filter te dekken. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Was het filter door het passeren 10 ml PBS erdoor onder afzuiging. </li><li> Monteer frame-seal incubatie kamers (Bio-Rad) volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Snijd de filter in achtsten met behulp van een steriel mes op een alcohol-gereinigde droge ondergrond. </li><li> Met behulp van een tang, plaats een achtste deel van een filter in een samengesteld beeld-seal incubatiekamer (acht frame-seal kamers zijn nodig voor elk filter monster). De zijkant van de filter sectie die cellen bevat moet naar boven wijzen. Het vocht aan de achterkant van het filter kan de filter vasthouden aan de dia. Als filter wordt droog, breng een kleine druppel (2 pi) van dih 2 O in het midden van de kamer voor het plaatsen van de filter sectie op de dia. </li></ol> Stappen 3.8-3.20 gebruik van de reagentia van de ROCHE In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS volgende procedures gewijzigd ten opzichte van de instructies van de fabrikant. Behalve voor PBS, zijn alle reagentia voorzien in de kit. <ol start="8"><li> Breng voldoende incubatiebuffer (0,5% bovine serum albumine, 0,1% Tween20 in PBS,) om de gehele filter sectie in de incubatiekamer gelijkmatig te dekken zonder dat overloop als de afdichting wordt toegepast. </li><li> Plaats een polyester beeld cover over de incubatiekamer frame. Druk op DOWN om goed verzegeling van de incubatiekamer. Vermijd luchtbellen boven het filter. Incubeer de verzegelde kamers voor 10 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Verwijder de afdichting polyester en open de incubatie kamers. (Opmerking: het openen van de kamers soms trek het frame zegel van de glijbaan in dat geval een nieuwe kamer voor de volgende stappen voor te bereiden..) </li><li> Pipet uit de incubatie buffer van de ene hoek van de kamer. Vermijd contact met het filter. </li><li> Was het filter door voorzichtig pipetteren 100 pi PBS in enuit de kamer 3 keer. </li><li> Bereid anti-BrdU-FLUOS werkende oplossing de stappen te volgen zoals aanbevolen door de fabrikant onmiddellijk voor gebruik. </li><li> Pipet 120 ul anti-BrdU-FLUOS werkende oplossing op het filter, zorg ervoor dat gelijkmatig bestrijken het gehele oppervlak. </li><li> Sluit de kamer met een nieuwe polyester dekken. Vermijd luchtbellen op de top van het filter. Incubeer de kamer in het donker bij 37 ° C gedurende 3 uur. Deze stap zal label BrdU opgenomen DNA in situ met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC). </li><li> Verwijder de polyester deksel en open de incubatiekamer. Pipet uit de anti-BrdU-FLUOS werkende oplossing. Was het filter 3 keer met PBS. </li><li> Breng de filter uit de incubatiekamer om een ​​steriel oppervlak. Snijd de filter sectie in kleine stukjes met behulp van een steriel mes. </li><li> Breng de filter stukjes in 2 ml microcentrifuge buizen, die elk 1 ml PBS. Stevig dop van de tube en sluit met parafilm. Incubeer bij 37 ° C en 200 rpm gedurende 10 minuten. </li><li> Bevestig de buizen op een vortexer en vortex op de maximale snelheid gedurende 5 minuten. Pipet het supernatant in een steriele 15 ml Eppendorf buis. Herhaal de incubatie-en vortex stappen voor 5 keer. Combineer de bovenstaande vloeistof in dezelfde 15 ml Eppendorf buis voor elk monster. Meestal kan 80% cellen worden teruggevonden in de suspensie. </li><li> Bewaar het supernatant met geresuspendeerd cellen bij 4 ° C. Sorteer binnen 2 dagen. </li></ol> 4. FACS-analyse Een procedure voor een BD FACSAria flowcytometer en de bijbehorende software is hier beschreven. <ol><li> Optimaliseren van de instelling van de flowcytometer volgende stappen aanbevolen door de fabrikant. Dit houdt in: het aanpassen van de versterking controle op de gewenste breakoff parameters en de 'sweet spot' vast te stellen; het optimaliseren van de laser vertraging en het gebied schaalfactoren voor het experiment schede druk en het optimaliseren van de instellingen voor FSC en SSC voltages, FSC drempel, FSC fluorescentie schalen, fluorescentie PMT voltages , etc. </li><li> Run negatieve controlemonsters op de flowcytometer (FCM) op basis van fluorescentie-intensiteit van FITC en zijwaartse verstrooiing (SSC). Verhoog de FITC drempel tot er geen cellen in de negatieve controles kan worden gevisualiseerd door de FITC-SSC overname weer te geven. </li><li> Run no-toevoeging te controleren steekproeven en onderzoekt de distributie patroon van 10.000 cellen op basis van FITC en SSC acquisitie. Definieer een poort naar alle cellen omsluiten en te wijzen als "lage intensiteit cellen" (LIS). </li><li> Run DOC-gewijzigd samples en onderzoekt de distributie patroon van 10.000 cellen op basis van FITC en SSC. Sommige cellen zal verschijnen in de vooraf ingestelde LI poort. Definieer een poort naar de cellen die hogere fluorescentie-intensiteit (HIS) dan LI hebben omsluiten. Verwerven van statistieken om de relatieve overvloed van gated cellen te bekijken. </li><li> Sorteer HI-cellen in de collectie van buisjes die 500 ul PBS bij "zuiveren een drop"-modus. Beëindig het sorteren wanneer het aantal van zijn bereikt 500.000 telt. </li></ol> 5. Filter PCR-amplificatie van 16S rRNA genen Filter PCR-procedures zijn gewijzigd van Kirchman et al. 6. <ol><li> Filter gesorteerde cellen op een witte, 0,22 um-porie-formaat, 25 mm diameter, polycarbonaat membraanfilter. Snij de rand van het filter dat geen bacteriële cellen met behulp van een steriel mes bevat. Snijd de filter in acht even grote stukken. </li><li> Plaats een filter stuk in een PCR-reactie buis, met de cellen naar binnen van de buis. Voeg 45 ul PCR kwaliteit water in de PCR-reactie buis. Dompel het filter volledig in het water. </li><li> Voeg 2 ROCHE illustratie PuReTaq Read-To-Go PCR Beads in de PCR reactie buis, kort vortex. Voeg 2 pi van elk van de voor-en achteruit 16S rRNA-gen primers (0,4 uM uiteindelijke concentratie voor elke primer), zoals 27V en 1492R 7, in elk van de PCR-reactie buizen. </li><li> (Optioneel) Voeg 1μl bovine serum albumine-oplossing (BSA, uiteindelijke concentratie 30μg/100 ul) om de PCR-reactiemengsel te adsorberen versterking remmers te helpen. Als men ervoor kiest om niet toe te voegen BSA, in plaats toe te voegen 1μl van water. </li><li> Uitvoeren van PCR-amplificatie op een thermal cycler. Een touch down PCR-programma wordt aanbevolen, dat heeft de annealing temperatuur opeenvolgend af 62 tot 52 ° C met 1 ° C per cyclus voor 11 cycli, gevolgd door 15 cycli met een annealing temperatuur van 52 ° C. Alle cycli zijn denatureren (bij 95 ° C), gloeien (op 62 tot 52 ° C), en extensie (bij 72 ° C) stappen van jaren '50 duur. Een eerste 3-min denaturatie en laatste 10-min uitbreiding stap is ook opgenomen in het PCR-programma. </li><li> Bevestig PCR-amplificatie door elektroforese op een ethidiumbromide gekleurde 1% agarose gel. Accijnzen de PCR-amplicons uit de gel en schoon met de QIAGEN QIAquick gel extractie kit. </li><li> Voer twee extra PCR amplificaties voor elk monster, elke keer gebruik maken van een nieuwe filter sectie. Na de PCR-gel purificatiop, het zwembad van het amplicons van hetzelfde monster bij elkaar. Gezuiverd 16S rDNA amplicons zijn nu klaar voor een aantal moleculaire analyses die taxonomische identificatie, zoals kloon bibliotheek bouw en sequencing mogelijk te maken. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Representatieve resultaten worden beschreven met behulp van een studie van putrescine-afbrekende bacteriën als een voorbeeld. Watermonsters werden verzameld uit een kust plaats van Georgië en verwerkt volgens de hierboven beschreven procedures. FACS-analyse toonde aan dat putrescine toevoeging ontwikkeling van een groep van bacteriën met een hoge FITC fluorescentie-intensiteit veroorzaakt, wat aangeeft hoge BrdU incorporatie (Figuur 1). Deze cellen werden aangeduid als high-BrdU incorporatie-cellen (HIS) en werd verwacht dat ze meestal bevatten putrescine-afbrekende bacteriën. HIs ontbraken in de no-toevoeging controles, die alleen die cellen met lagere niveaus van BrdU incorporatie (LIS). LI werd verwacht dat vooral bevatten bacterioplankton die niet in staat waren om toegevoegd putrescine gebruiken. HIs werden gesorteerd in aparte buizen en vervolgens verzameld op membraanfilters. 16S rRNA-gen amplicons werden verkregen voor hoge HI cellen met behulp van PCR-filter. <img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Flowcytometrische analyse van no-naast-controle en model-compound-gewijzigd (putrescine als een voorbeeld hier) monsters verzameld na 24 uur incubatie. Celverdeling analyse was gebaseerd op (1) fluorescentie-intensiteit van FITC etikettering (x-as), wat positief is gerelateerd aan het niveau van BrdU incorporatie, en (2) zijwaartse verstrooiing (SSC, y-as), dat is positief gerelateerd aan cel grootte. Gate notatie is gebaseerd op het niveau van BrdU incorporatie, (HI, high-BrdU-opname, LI, low-BrdU-opname). Het relatieve aandeel van de HI-en LI-cellen worden weergegeven in de overeenkomstige poorten.

<ol><li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li>
<li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li>
<li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li>
<li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li>
<li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+%28BrdU%29+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+%28Exo+III%29+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li>
<li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li>
<li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+stains%3A+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li>
<li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li>
<li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li>
<li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li>
<li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Onze aanpak koppels BrdU incorporatie, FACS en 16S rDNA analyse soort-niveau identificatie van bacterioplankton dat de afzonderlijke DOC componenten metaboliseren in het aquatisch milieu mogelijk te maken. De BrdU incorporatie assay labels bacteriële cellen op basis van metabolische activiteiten, die analyse maakt het mogelijk alleen op actieve bacteriën en dus bevat geen slapende cellen. In onze aanpak, BrdU incorporatie is in situ immunodetected en bacteriën die verschillende niveaus van BrdU incorporatie heb...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> B5002-5G </td><td></td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> L6876-5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> P2308-25mg </td><td></td></tr><tr><td> In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS </td><td> Uitrusting </td><td> Roche </td><td> 11810740001 </td><td> Verbruiken meer van anti-BrdU-FLUOS en Incubatiecentrum buffer per reactie dan wordt gesuggereerd door de fabrikant. </td></tr><tr><td> Frame-Seal Incubatie Chambers </td><td> Materiaal </td><td> Bio-Rad </td><td> SLF-1201 </td><td></td></tr><tr><td> Membraanfilters van polycarbonaat (142 mm diameter, 1,0 um-porie-formaat) </td><td> Materiaal </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> Membraanfilters van polycarbonaat (25-mm-diameter van 0,2 micrometer-porie-formaat) </td><td> Materiaal </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> illustratie PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads </td><td> Uitrusting </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick gelextractiekit </td><td> Uitrusting </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> FailSafe PCR-systeem </td><td> Uitrusting </td><td> EPICENTRUM </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

broomdeoxyuridine (brdu) etikettering en latere fluorescentie activated cell sorting voor cultuur-onafhankelijke identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Microben zijn belangrijke agenten bemiddelen de afbraak van een groot aantal opgeloste organische koolstof (DOC) substraten in het aquatisch milieu. Echter, de identificatie van bacteriële taxa die specifieke zwembaden van DOC te transformeren in de natuur vormt een technische uitdaging. Hier beschrijven we een aanpak die paren broomdeoxyuridine (BrdU) incorporatie, fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), en 16S rRNA-gen op basis van moleculaire analyse van de cultuur-onafhankelijke identificatie van bacterioplankton in staat vernederende een specifieke DOC compound in het aquatisch milieu mogelijk maakt. Drievoud bacterioplankton microkosmossen zijn ingesteld om zowel BrdU en een model DOC verbinding (DOC amendementen), of alleen BrdU (no-toevoeging controle) te ontvangen. BrdU vervangt de posities van thymidine in nieuw gesynthetiseerde bacteriële DNA en BrdU-gelabeld DNA kan gemakkelijk immunodetected 1,2 te zijn. Door middel van een 24-uurs incubatie bacterioplankton die in staat zijn om gebruik maken van de toegevoegde DOC compound wordt verwacht dat ze selectief worden geactiveerd, en dus hogere niveaus van BrdU incorporatie (HI cellen) dan niet-ontvankelijk cellen in de DOC wijzigingen en cellen in no- Naast controles (lage BrdU incorporatie cellen, LI-cellen). Na de fluorescentie immunodetectie, zijn HI cellen onderscheiden en fysiek gescheiden van de LI cellen door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) 3. Gesorteerd DOC-responsieve cellen (HI-cellen) zijn gewonnen voor DNA en taxonomisch geïdentificeerd door middel van de volgende 16S rRNA gen-gebaseerde analyses waaronder PCR, klonen bibliotheek bouw en sequencing.

Milieu-bacterioplankton worden geïncubeerd met een model opgeloste organische koolstof (DOC) verbinding en een DNA-etikettering reagens, broomdeoxyuridine (BrdU). Daarna zijn DOC-afbrekende cellen gescheiden van de bulk-gemeenschap op basis van hun verhoogde BrdU incorporatie met behulp van fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS). Deze cellen worden vervolgens geïdentificeerd door de volgende moleculaire analyses.

Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton

Microben zijn belangrijke agentia die de degradatie van talrijke opgeloste organische koolstofsubstraten (DOC) in aquatische omgevingen bemiddelen. Echter, identificatie ...

Microben bemiddelen de afbraak van talrijke opgeloste organische koolstofsubstraten of DOC-verbindingen, zoals in aquatische omgevingen. Om de rol van microben bij de transformatie van DOC volledig te begrijpen, is een gelijktijdige identificatie van hun taxonomie en functie noodzakelijk. Deze video demonstreert een procedure voor de taxonomische identificatie van vrijlevende bacteriën of bacterieel plankton dat specifieke DOC-pools in aquatische omgevingen transformeert.Watermonsters die zijn verzameld uit een testomgeving worden verwerkt en geïncubeerd met een verbinding van belang en bromo deoxy uridine, BRDU, dat wordt ingebouwd in nieuw gesynthetiseerd DNA en actief groeiende cellen. Vervolgens worden BRDU-gelabelde bacteriële plankton gelabeld met ZI-geconjugeerde anti-BRDU-antilichamen. Bacterieel plankton met hoge niveaus van BRDU-labeling worden geïsoleerd via fluorescentie-geactiveerde celsortering.Vervolgens wordt het DNA uit de gesorteerde cellen geëxtraheerd en wordt de taxonomische identificatie uitgevoerd op basis van de resultaten van PCR-gebaseerde analyse van het 16 s ribosomaal RNA-gen. Hallo, mijn naam is Steven Robbins van het laboratorium van Dr. Chen Mao van

bromodeoxyuridine-brdu-labeling-subsequent-fluorescence-activated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

Bijhouden kleine veranderingen in de progressie en kinetiek van celcyclus stadia worden door gebruik van een combinatie van metabolische labeling van nucleinezuren met BrdU en totaal genomisch DNA kleuring via propidium jodide. Deze methode wordt voorkomen dat van de chemische synchronisatie van fietsen cellen, waarbij de introductie van niet-specifieke DNA-schade die op zijn beurt invloed celcyclus.

Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

The video describes the stepwise pulse labeling assay of mammalian cells with bromodeoxyuridine (BrdU) for measuring cell proliferation. The BrdU uptake permits the temporal tracking of cells that were in the synthesis phase at a specific point in time, without requiring the cells to be synchronized.

Bromodeoxyuridine Pulse Labelling Assay: A Technique to Measure Cell Proliferation

This video describes the protocol for BrdU immunofluorescence staining. The technique allows the identification of cells in different phases of cell cycle. Addition of DNA dyes and antibody labeling allows the detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

BrdU Immunofluorescence Staining: A Technique to Identify Cells in Different Phases of Cell Cycle

Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.

Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

Lasers worden vaak gebruikt in studies van de cellulaire respons op DNA-schade. Echter, ze genereren lesies waarvan de afstand, frequentie en botsingen met replicatievorken worden zelden gekenmerkt. We beschrijven een benadering die de bepaling van deze parameters laser gelokaliseerde crosslinks tussen de strengen mogelijk maakt.

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

Hier is een protocol voor een eencellige, epifluorescentie microscopie gebaseerde techniek om Graas percentages te kwantificeren in aquatische roofzuchtige eukaryoten met een hoge precisie en taxonomische resolutie.

Fluorescentend gelabelde bacteriën als een Tracer om nieuwe trajecten van organische koolstof stromen in aquatische ecosystemen te onthullen

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Leer BrdU-etikettering en FACS voor identificatie van DOC-afbrekende bacterioplankton in aquatische ecosystemen. Deze methode isoleert actief groeiende cellen voor taxonomische analyse.

Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton (Video) | JoVE Journal

Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton

Meer video's verkennen