Broomdeoxyuridine (BrdU) etikettering en Latere Fluorescentie Activated Cell Sorting voor cultuur-onafhankelijke Identificatie van opgeloste organische koolstof-afbrekende bacterioplankton

Microben mediëren de afbraak van talrijke opgeloste organische koolstofsubstraten of DOC-verbindingen, zoals in Racine en aquatische omgevingen. Om de rol van microben bij de transformatie van DOC volledig te begrijpen, is een gelijktijdige identificatie van hun taxonomie en functie noodzakelijk. Deze video demonstreert een procedure voor de taxonomische identificatie van vrijlevende bacteriën of bacterieel plankton dat specifieke pools van DOC in aquatische omgevingen transformeert.

Watermonsters die zijn verzameld uit een testomgeving worden verwerkt en geïncubeerd met een verbinding van belang en bromo deoxy uridine, BRDU, dat wordt ingebouwd in nieuw gesynthetiseerd DNA en actief groeiende cellen. Vervolgens worden BRDU-gelabelde bacteriële plankton gelabeld met ZI-geconjugeerde anti-BRDU-antilichamen. Bacterieel plankton met hoge niveaus van BRDU-labeling wordt geïsoleerd door middel van fluorescence activated cell sorting.

Vervolgens wordt het DNA uit de gesorteerde cellen geëxtraheerd en wordt de taxonomische identificatie uitgevoerd op basis van de resultaten van PCR-gebaseerde 16 s ribosomaal RNA-genanalyse. Hallo, mijn naam is Steven Robbins van het laboratorium van Dr. Chen Mao van de afdeling Biologische Wetenschappen aan de Kent State University. Vandaag zal ik u een cultuuronafhankelijke methode tonen voor de identificatie van DOC-afbrekend bacterieel plankton in aquatische omgevingen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals nutriëntentoevoegingen gevolgd door analyse van het DNA van de bacteriële gemeenschap, is dat de analyse zich richt op zeer actieve bacteriën en slapende en langzaam groeiende cellen uitsluit. We tonen hier de identificatie van bacteriëlen plankton dat één specifieke DOC-verbinding gebruikt. Deze methode kan echter ook worden toegepast om bacteriëlen plankton te bestuderen dat andere enkelvoudige DOC-verbindingen of groepen DLC's, zoals algenexudaten, gebruikt.

Laten we enkele watermonsters pakken en beginnen. Voordat watermonsters worden geanalyseerd op DOC-afbrekend bacterieel plankton, moeten de watermonsters op de juiste wijze worden verwerkt. De hier getoonde monsters zijn verzameld aan de kust van Georgia om grote deeltjes en ER VRE's uit het watermonster te verwijderen.

Gebruik een peristaltische pomp om water van de opvangcarboy over te brengen naar een filtratie-eenheid met een filter met een poriegrootte van 1 micrometer. Breng vervolgens aliquoten van 36 milliliter van het filtraat over in drie steriele polypropyleen buisjes van 50 milliliter. Elk hiervan bevat vier milliliter vers bereide 10% Paraformaldehyde-oplossing. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur om de cellen na de incubatie te conserveren.

Giet het water in de filtratietoren van een glazen vacuümfiltratie-eenheid met witte membraanfilters met een poriegrootte van 0,22 µm en pas vacuüm toe om de oplossing erdoorheen te trekken. Was het filter door 10 ml PBS door het vacuümfilter te leiden. Label de filters als negatieve controles en bewaar deze bij -20 °C.

Om een experimenteel ecosysteem of microkosmos op te zetten, begint u met het vullen van zes vooraf gespoelde glazen kolven van één liter met 800 milliliters van het vooraf gefilterde watermonster. Voeg BRDU toe aan elke microkosmos tot een eindconcentratie van 10 micromolar. Draai de kolf snel met de hand om te mengen.

Elk monster zal in triplikaat worden geanalyseerd. Voeg daarom aan drie van de microcosmen de model-DOC-verbinding toe. Hier wordt reine toegevoegd aan de microcosmen tot een uiteindelijke concentratie van 100 nanomolair.

Voeg vervolgens steriele PBS toe aan de overige drie microcosmen. Deze dienen als controles zonder DOC. Plaats alle microcosmen in een schuddende incubator bij 100 RPM in het donker bij de in situ temperatuur, welke 25 °C is. Neem hier monsters op tijdstippen van 0, 8, 16 en 24 uur.

Verzamel 36 milliliters van elk microkosmos in een steriele polypropyleen buis van 50 milliliter die vier milliliters verse 10%paraform aldehyde bevat; incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Filtreer vervolgens de gepreserveerde cellen door witte membraanfilters met een poriegrootte van 0,22 micrometer. Breng 10 milliliters PBS aan via het vacuümfilter om de resten PFA af te spoelen.

Ga direct over tot INS situ immuno-detectie of bewaar de filters bij minus 20 graden Celsius om de BRDU-incorporatie in bacterieel plankton te analyseren. Begin met het brengen van de monsterfilters op kamertemperatuur om de bacteriële celwand te compromitteren. Plaats het filter op een filtratie-eenheid, pipetteer vervolgens één milliliter lysozymoplossing op het filter om de cellen te bedekken en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Pas na de incubatie een vacuüm toe om de oplossing te verwijderen. Zodra de oplossing door het filter is gegaan, worden de cellen gewassen door 10 milliliters PBS toe te voegen en opnieuw een vacuüm toe te passen. Voeg vervolgens één milliliter proteinase K-oplossing toe aan het filter om de cellen te bedekken en de celwand verder te beschadigen.

Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Was met PBS om enkelstrengs DNA te verkrijgen. Voeg één milliliter exonuclease-oplossing toe om de cellen op het filter te bedekken.

Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Was na de incubatie het filter door 10 mL PBS door het vacuümfilter te leiden. Trim vervolgens de randen van het filter af om het gedeelte zonder cellen te verwijderen.

Snijd vervolgens op een met alcohol gereinigd, droog oppervlak met een steriel mesje het filter in acht gelijk grote stukken. Er zijn acht incubatiekamers met frame-afdichting nodig voor elk monster; plaats een achtste van het filter met de monsterzijde naar boven in de gemonteerde incubatiekamer met frame-afdichting. Gebruik, zodra de kamers zijn gemonteerd, de Roche Intu cell proliferation kit flus om A-B-R-D-U gelabelde cellen in situ aan te tonen.

Zodra de standaardprocedures zijn voltooid, verwijdert u het filtergedeelte uit de incubatiekamer en plaatst u dit op een steriel oppervlak; snijd het filtergedeelte vervolgens met een steriel mesje in kleine stukjes. Breng de filterstukjes over in een microcentrifugebuisje van twee milliliter met één milliliter PBS, sluit het buisje stevig en verzegel het met parafilm. Incubeer het buisje vervolgens in een schudincubator bij 37 °C en 200 RPM gedurende 10 minuten.

Zet na de incubatie de buis vast en vortex deze op de maximale snelheid. Pipetteer gedurende vijf minuten het SUP-supernatans in een steriele polypropyleen buis van 15 milliliter. Resuspendeer vervolgens het filter in PBS en herhaal de vortex- en incubatiestappen nog twee keer, waarbij u voor elk monster het supernatant telkens aan dezelfde 15 milliliter buis toevoegt.

Bewaar de geresuspendeerde cellen bij vier graden Celsius. Het monster moet binnen twee dagen via fax worden geanalyseerd. Sorteer tot slot de cellen om de populatie met een hoog niveau van BRDU-incorporatie te verkrijgen.

Hier worden een BD FACs Area flowcytometer en de bijbehorende software gebruikt. Zodra de cellen zijn gesorteerd, kan de BrdU-verrijkte populatie worden geanalyseerd om de taxonomische identiteit te bepalen. Om de 16S ribosomale RNA-genen van de gesorteerde bacteriën via filter-PCR's te amplificeren, worden de gesorteerde cellen op een wit polycarbonaat membraanfilter met een poriegrootte van 0,22 µm gepipetteerd en wordt de vacuümpomp ingeschakeld; gebruik vervolgens een steriel mesje om de celvrije randen van het filter af te snijden.

Snijd het filter in vier stukken van gelijke grootte voor elke conditie en plaats één filterstuk in elk van de drie PCR-reactiebuisjes, waarbij de cellen naar de binnenkant van het buisje zijn gericht. Voeg 45 µL PCR-kwaliteitswater toe. Laat het filtergedeelte volledig onderdompelen in het water.

Voeg vervolgens twee Roche illustra pure T ready to go PCR-beads toe en vortex kort om de beads te helpen oplossen. Voeg daarna telkens twee µL van de forward- en reverse 16 s ribosomaal RNA-genprimers toe.

Voeg ofwel één microliter BSA toe om amplificatieremmers te helpen absorberen, of één microliter water. Voer de PCR-amplificatie uit op een thermische cycler. Een touchdown PCR-programma wordt aanbevolen, waarbij de annealingtemperatuur sequentieel afneemt van 62 naar 52 graden Celsius met één graad Celsius per cyclus, gevolgd door 15 cycli bij 52 graden Celsius.

Bevestig de PCR-amplificatie via elektroforese op een met ethidiumbromide gekleurde 1% Agarosegel, snijd de PCR-ampliconen uit de gel en zuiver deze met een KaiGen cayo quick gel extraction kit. Voeg na de PCR-gelzuivering de ampliconen van hetzelfde monster samen. De gezuiverde 16s ribosomaal DNA-ampliconen zijn nu gereed voor een reeks moleculaire analyses.

Monsters werden verzameld op een kustlocatie in Georgia en verwerkt om Racine-afbrekende bacteriën te bestuderen volgens de procedures die in deze video worden beschreven. Racine is een polyamoor verbinding dat overal in mariene omgevingen wordt aangetroffen. Zoals hier wordt aangetoond, kan het dienen als voedingsstof en energiebron voor mariene bacteriën.

Analyse van de feiten van de monsters onthulde dat er na een incubatie van 24 uur in met Racine aangerijkte microcosmen een groep bacteriën ontstond met een hogere FXI-fluorescentie-intensiteit, welke positief gecorreleerd was met de mate van BRDU-incorporatie. Deze cellen werden aangeduid als cellen met hoge BRDU-incorporatie of HI en naar verwachting bevatten zij hoofdzakelijk Racine-afbrekende bacteriën. Geen hi.

In de controles zonder toevoeging werden cellen aangetroffen, die enkel cellen bevatten met lagere niveaus van BRDU-incorporatie; deze werden aangeduid als lii-cellen en werden geacht voornamelijk bacterieel plankton te bevatten dat niet in staat was tot gebruik. Toegevoegde Racine HI-cellen werden in gescheiden buisjes gesorteerd en vervolgens op membraanfilters verzameld. Gedeeltelijke 16S ribosomaal RNA-gen amplicons werden verkregen na filter-PCR en bevestigd via gelelektroforese.

Na het sorgefilter kan PCR-amplificatie van functionele genen worden uitgevoerd om de functionele diversiteit tussen de gesorteerde cellen te onderzoeken. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe functionele bacteriële cellen in een aquatisch milieu fysiek kunnen worden gescheiden en geïdentificeerd met behulp van een aanpak die fluorescentie-geactiveerde celsortering en BrDU-incorporatie koppelt. Houd er rekening mee dat BrDU schadelijk is; draag daarom altijd een laboratoriumjas en handschoenen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.