Name: ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine Sensor eiwitten in cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Leer ReAsH/FlAsH-labeling van tetracysteïne-eiwitten in levende cellen voor kwantitatieve eiwitanalyse. Deze methode maakt gedetailleerde studie van eiwitconformaties en oligomerisatiestatussen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door subsidies aan DMH en TDM (NHMRC projectsubsidies). DMH is een Grimwade Fellow, gefinancierd door de Miegunyah Trust.

1. De voorbereiding van cellen voor het labelen met ReAsH / Flash <ol><li> Met behulp van standaard celcultuurmethoden voor uw cellijn van belang zijn, voor te bereiden van een cultuur van hechtende cellen direct in een live-cell imaging slide klaar voor transfectie. </li><li> Transfecteren uw plasmide dat TC-gelabeld gen van belang op basis van uw transfectie methode van keuze. </li></ol> Nota is het belangrijk om positieve en negatieve controles te gebruiken om de mate van specifieke binding te beoordelen aan de TC tags en te beoordelen voor de bleedthrough van fluorescentie tussen de kanalen bij het verzamelen van confocale microfoto. Vandaar dat voor de twee kleuren (bijv. Flash / Cherry of ReAsH / GVB of ReAsH / GFP-combinaties), zorgen voor monsters worden voorbereid op een kleur (bijvoorbeeld TL-eiwit alleen of indien mogelijk een TC-gelabeld eiwit gebonden aan Flash / ReAsH, maar met geen fluorescerende eiwit) <ol start="3"><li> Een tot twee dagen na transfectie, voorzichtig spoelen van de cellen met 300 pi voorverwarmde (bij 37 ° C) HBSS. </li><li> Voorzichtig onderdompelen van de cellen met 1 uM Flash (of ReAsH) in 300 pi van de voorverwarmde HBSS en 10 uM 1,2-ethanedithiol (EDT). </li></ol> Het is belangrijk om eerst toe te voegen EDT voor het toevoegen van Flash / ReAsH en de buffer te maken net voor de toe te voegen aan de cellen. Incubeer gedurende precies 30 min bij 37 ° C in weefselkweek incubator. In onze ervaring langere incubatietijd aanzienlijk verhoogt de achtergrond fluorescentie. Nieuwe constructen moet ook worden geoptimaliseerd voor het labelen van tijd en Flash / ReAsH concentratie (0,5-2 uM). <ol start="5"><li> Zuig voorzichtig etikettering oplossing van cellen en vervolgens te vervangen door 300 ul voorverwarmde HBSS + 250 uM 2,3-dimercaptopropanol (BAL) gedurende 15 minuten bij 37 ° C. </li><li> Verwijder de wasoplossing door behoedzame aspiratie en met 300 ul voorverwarmde HBSS te vervangen. </li></ol> Na deze wasbeurt, kunnen de cellen worden vastgesteld met paraformaldehyde (15 min met 3,2%-oplossing), maar we hebben gemerkt dat deze niet-specifieke biarsenical kleurstof fluorescentie toeneemt. Vandaar dat we meestal het imago van de cellen wonen bij kamertemperatuur. (Merk op dat fixatie van cellen voor de etikettering voorkomt biarsenical kleurstof bindend.) 2. Beeldvorming van de cellen op een confocale microscoop <ol><li> Op de confocale microscoop, parameters instellen voor de beeldvorming van de individuele fluoroforen (zie tabel 1) en ervoor te zorgen dat er is te verwaarlozen bleedthrough tussen de kanalen. Dit kan worden bereikt door het controleren van de individuele fluoroforen (in control monsters) tegen elkaar verschillende fluorescerende overname instelling voor fluorescentie. Instellen van de emissie golflengte kan helpen om bleedthrough minimaliseren (hoewel dit ook kan de signaal / ruis te verminderen). </li><li> Ook aanpassen van de fotomultiplicator instellingen, zodat de maximale fluorescentie in de steekproef niet de detector te verzadigen. (Dit kan worden gedetecteerd met behulp van de Q-LUT omgeving op de SP2 Leica confocale). Zodra de beste imaging-instellingen worden bepaald, niet veranderen een van hen tussen de monsters. </li><li> Andere instellingen die we gebruiken meestal (hoewel deze kan worden geoptimaliseerd) zijn een scansnelheid van 200 Hz en het verzamelen van 4 lijn gemiddelden en een pinhole diameter van een Airy-eenheid. De pinhole diameter kan worden uitgebreid als signaal / ruis is een probleem, maar dit kan resulteren in een verlies van beeldvorming. </li><li> Verzamel de confocale beelden in 12-bit (of hoger) formaat indien mogelijk. 12-bit formaat vangt een groter dynamisch bereik van de waarden (0-4.095) voor elke pixel de intensiteit dan de 8-bit (0-255). Dit is belangrijk voor het waarborgen van de rijkste dataset is opgenomen, dat maximaliseert de kwaliteit van de kwantitatieve data-analyse. </li><li> Verzamel beelden voor het fluorescerende eiwit kanaal (Cherry, GFP of GVB) en ook voor de biarsenical kleurstof kanaal (Flash of ReAsH) voor alle monsters. </li></ol> 3. Analyse van de gegevens <ol><li> Installeer de software ImageJ op uw computer 8. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> Zorg ervoor dat uw versie van ImageJ de volgende plugins: <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li> Open ImageJ, en als het gebruik van een versie ouder dan v1.32c, klikt u op de volgende opties om meerdere beelden worden geopend in een keer (die kan worden gedaan door de control-toets ingedrukt terwijl u klikt op de verschillende files): <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"></li><li> Open de beelden van belang in ImageJ. ImageJ zal automatisch bepalen van de maximale en minimale pixel intensiteiten die worden weergegeven op het scherm voor elk beeld afzonderlijk. Gezien het feit dat verschillende beelden zullen d hebbenAllerlei mensen pixel intensiteiten, betekent dit dat de weergegeven beelden zijn niet te vergelijken zoals ze worden weergegeven. </li><li> Om ervoor te zorgen dat de geopende afbeeldingen zijn allemaal op dezelfde schaal, dan kunt u fysiek definiëren de bovenste en onderste pixel intensiteiten worden bekeken (dit zal niet veranderen de feitelijke gegevens de inhoud van de beelden zoals het geval in sommige andere software). Deze waarden kunnen worden ingesteld onder de volgende menu: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"></li><li> Een alternatieve benadering is om te werken met stapels, die alle beelden brengt samen in een bestand en wordt automatisch schaal (voor het bekijken van) alle beelden in de stapel op dezelfde schaal. De eenvoudigste manier om te werken met de gegevens om te zetten elk kanaal om een ​​stack. Zo is voor het fluorescerende eiwit kanaal allemaal bekeerd zijn tot stack zoals afgebeeld. U kunt een kanaal eenvoudig selecteren door het stapelen van alle afbeeldingen met een gewone naam (bv "ch00") in de titel. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"></li><li> Nu zetten alle geopende afbeeldingen naar 8-bits voor analyse. Dit ook daadwerkelijk het herschalen bekeken serie in een 0-255 range (die definieert 8-bit). BELANGRIJK: niet opslaan opzichte van de originele 12-bit (of hoger) formaat of je zal informatie-inhoud te verliezen. Merk op dat sommige software pakketten alleen 8-bits beelden weer te geven, zodat dit formaat is handig voor het maken van figuren, etc. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"></li><li> Een kopie opslaan in een nieuwe map genaamd "8-bit omgezet" met behulp van het "Opslaan als ..." optie. </li><li> Een methode om de mate van biarsenical kleurstof verbindend in al een hele beeld te onderzoeken is het uitvoeren van een pixel intensiteit correlatie plot. Deze percelen elke pixel waarde in een kanaal ten opzichte van de overeenkomstige pixelwaarde in een tweede kanaal. Vandaar dat een pixel positie hoog in het GVB fluorescentie zal ook hoog in ReAsH fluorescentie als er sprake is hoog bindend. </li><li> Voor het analyseren van de pixel co-correlatie, zorg ervoor dat de 8-bit ReAsH en Cerulean / GFP beelden geopend in ImageJ. </li><li> Open de "Image Correlator" plugin zoals hieronder aangegeven. Selecteer "Image1" als de ReAsH of Flash-stack en "Image2" als het fluorescerende eiwit stack. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"></li><li> De resulterende stapel kan geeft geen gedetailleerde informatie - dit is normaal. Sla de stapel in een nieuwe map genaamd "scatterplots" en geef het dezelfde bestandsnaam als het monster het verwijst naar (bijvoorbeeld "Flash-cherry correlatie plot") </li><li> Om de gegevens zinvol kun je een van de twee opties. Eerst transformeren van de data, zodat deze in log-formaat. Dan visueel herschalen van de gegevens als volgt: <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"></li><li> U kunt ook visueel herschalen de gegevens zodat alleen lage waarden (bijv. 1-255) en de gegevens met behulp van een speciale LUT weer te geven. Een LUT (Look Up Table) is een tabel van de kleuren die voor elke pixel waarde die wordt toegekend in een beeld . Dit kan gebruikt worden om een pseudokleur regeling voor een afbeelding te definiëren en is nuttig voor het definiëren van bepaalde functies in een afbeelding. Om een ​​aangepaste LUT klik op "LUT-editor" te creëren en maken een nieuwe, zoals de een weergegeven (dit kan worden opgeslagen en later gebruikt). <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"></li><li> De helderheid / contrast range 0-255 (zoals beschreven in stap 13 hierboven). Om "lock in" het beeld zoals dat op het scherm getoond, kan het beeld worden omgezet naar RGB formaat dat een 8-bit waarde voor elk van de rode, groene en blauwe kleur van elke pixel bespaart. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="Figuur 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 8"> Te kopiëren en te plakken beelden naar andere programma's open je eerst de 8-bit of 16-bits afbeeldingen. Zoals beschreven in stap 14 hierboven, wijst u een LUT kleurenschema op de afbeelding. Voor het GVB, wijs de "Turquoise" LUT zoals hieronder beschreven ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="Figuur 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 9"></li><li> Selecteer de afbeelding en te kopiëren naar het klembord, kies ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg"></li></ol> 4. Representatieve resultaten: Het succes van etikettering cellen met biarsenical kleurstoffen is afhankelijk van een paar belangrijke parameters. Ten eerste de timing van de etikettering met kleurstoffen is cruciaal. We hebben ontdekt dat lange periodes van etikettering (meer dan 30 min) resulteert in een hoge mate van niet-specifieke achtergrond kleuring. Fig. 1 toont een typisch resultaat voor een wild-type vorm van huntingtin fragment (25Q) gefuseerd aan het GVB afgeleide Cerulean met een TC-tag zoals eerder is beschreven 7. Dit monster werd gekleurd voor 30 min met ReAsH en er is een minimale achtergrond in het monster zonder de TC tag. We hebben gemerkt dat de vaststelling van cellen met paraformaldehyde verhoogt achtergrond terwijl bevestiging met methanol de fluorescentie van het fluorescerende eiwit tag heft. Vandaar dat we waar mogelijk het imago van de cellen te wonen. Het is belangrijk om ook vooraf rekening mee dat fixatiede etikettering met biarsenical kleurstoffen verhindert hun binding, waarschijnlijk als gevolg van wijzigingen van de TC motief. Een andere kritische factor voor consistente resultaten is de dichtheid van de cellen. We hebben gemerkt dat het cruciaal om de afbeelding cellen die los worden verspreid en ook dat uitgebreide klonteren kan leiden tot ongelijke kleuring van de biarsenical kleurstoffen in verschillende cellen. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Tetracysteine ​​tags en ​​ReAsH kleuring in levende cellen getransfecteerd met huntingtin (exon1-25Q)-Cerulean fusies. De TC tag is gelegen op het kruispunt van de huntingtin-Cerulean fusie (zoals beschreven in 7). De pixel intensiteit correlatie plot maakt een evaluatie van verschillen in ReAsH binding in de cel en kan gebruikt worden om veranderingen in de ReAsH binding als gevolg van conformationele verandering of ligand interacties kaart.

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li>
<li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li>
<li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li>
<li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li>
<li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li>
<li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li>
<li>Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluor%22%5BJournal%5D)">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li>
<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+Synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De aanpak van label eiwit lokalisatie met een fluorescerend eiwit en conformationele eigenschappen met een tweede kleurstof biedt veel mogelijkheden voor in kaart brengen van waar verschillende conformaties van eiwitten opbouwen in cellen en evenementen die de dynamiek van eiwit conformatie te veranderen. ReAsH / Flash werd voor het eerst gebruikt als een in-cel-sensor voor het vouwen van eiwitten van de zoogdieren cellulaire retinoïnezuur-bindend eiwit I 4. In dit voorbeeld is de FLASH gebonden aan een TC ta...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 8-well μ-slides </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td> We vinden deze kamer dia&#39;s aan met name nuttig zijn voor het kweken van cellen voor beeldvorming. </td></tr><tr><td> TC-Flash II In-cel Tetracysteine ​​Tag Detection Kit * groene fluorescentie * * voor live-cell imaging </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (Flash) of T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> Balanced Salt Hanks &#39;Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3-dimercapto-1-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1129-5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Ethanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02390-25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash / flash labeling en beeldanalyse van tetracysteine ​​sensor eiwitten in cellen

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescerende eiwitten en kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor de studie van proteïne mensenhandel, lokalisatie en functie in cellen. Terwijl fluorescerende eiwitten zoals groene fluorescentie eiwit (GFP) zijn uitgebreid gebruikt als fusiepartners om eiwitten aan de eigenschappen van een eiwit van belang een, recente ontwikkelingen track met kleinere labels in staat stellen nieuwe functionaliteiten van eiwitten worden onderzocht in cellen, zoals conformationele verandering en eiwit-vereniging 2, 3. Een kleine tag-systeem omvat een tetracysteine ​​motief (CCXXCC) genetisch ingebracht in een doelwit eiwit, dat bindt aan biarsenical kleurstoffen, ReAsH (rood fluorescerend) en Flash (green fluorescent), met een hoge specificiteit, zelfs in levende cellen 2. De TC / biarsenical dye-systeem biedt veel minder sterische beperkingen op de host eiwit dan fluorescerende eiwitten die in staat heeft gesteld een aantal nieuwe benaderingen van conformationele verandering en eiwit-eiwit interacties 4-7 te meten. We hebben onlangs een nieuwe toepassing van TC tags als sensoren van oligomerisatie in cellen die mutant huntingtine, die, wanneer gemuteerd aggregaten in neuronen in de ziekte van Huntington 7. Huntingtine werd getagd met twee fluorescente kleurstoffen, een een fluorescerend eiwit bewerkt om locatie volgen, en de tweede een TC-tag die alleen biarsenical kleurstoffen bindt in monomeren. Vandaar dat veranderingen in de colocalization tussen eiwit en biarsenical kleurstof reactiviteit ingeschakeld submicroscopische oligomeer inhoud ruimtelijk in kaart worden gebracht in de cellen. Hier beschrijven we hoe de TC-gemerkte eiwitten gefuseerd met een fluorescerend eiwit (Cherry, GFP of GVB) met Flash of ReAsH in levende zoogdiercellen en hoe je de twee kleuren fluorescentie (Cherry / Flash, GVB / Flash of GFP / kwantificeren label ReAsH combinaties).

De biarsenical kleurstoffen Flash en ReAsH binden specifiek aan tetracysteine ​​motieven in eiwitten en kan selectief label eiwitten in levende cellen. Onlangs is dit de etikettering strategie is gebruikt om sensoren voor verschillende eiwitten conformaties of oligomere staten te ontwikkelen. Beschrijven we de etikettering van aanpak en methoden om kwantitatief te analyseren bindend.

ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine ​​Sensor eiwitten in cellen

Fluorescerende eiwitten en kleurstoffen zijn essentiële instrumenten voor de studie van eiwittransport, lokalisatie en functie in cellen. Terwijl fluorescerende eiwitten ...

Het algemene doel van deze procedure is om cellen die een tetra-cysteïne en fluorescentie-gelabeld eiwit tot expressie brengen te labelen met de kleurstoffen flash of ash, en om de resultaten kwantitatief te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst een plasmide dat een fluorescent eiwit en het doeleiwit met een tetra-cysteïne-tag bevat, te transfecteren in de betreffende cellijn. Vervolgens wordt het tot expressie gebrachte eiwit gelabeld met R of flash, en wordt de aspecifiek gebonden kleurstof verwijderd door te wassen met BAL ter voorbereiding op microscopische beeldvorming.Vervolgens wordt een confocale microscoop gebruikt om fluorescentiebeelden van de cellen op te nemen met de ash- of flash- en fluorescentie-eiwitkanalen. Ten slotte worden de beelden geanalyseerd met ImageJ om de binding van ash of flash aan het doeleiwit te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de mate van ash- of flash-binding aan het doeleiwit in cellen aantonen via de correlatie van ash-fluorescentie met fluorescentie-eiwitfluorescentie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het simpelweg labelen van het doeleiwit met GFP, is da

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is een krachtige aanpak van de structuren te observeren in de buurt van het celoppervlak bij hoge contrast en temporele resolutie. We laten zien hoe TIRF kan worden gebruikt om eiwitten dynamiek te studeren aan de cortex van de celwand-ingesloten bacteriën en schimmels cellen.

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Cellulaire levensvatbaarheid hangt af van een tijdige en efficiënte beheer van eiwit misfolding. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van de verschillende potentiële lot van een verkeerd gevouwen eiwitten: hervouwing, afbraak of opslag in insluitsels. We demonstreren het gebruik van een opvouwbare sensor,...

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Eiwit interacties vormen de kern van de functie van een cel. Calorimetrische en spectroscopische technieken worden gewoonlijk gebruikt om ze te karakteriseren. Hier beschrijven we fluorescentie anisotropie als middel om de interactie tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor-1 achtige GTPase (EFL1) te bestuderen.

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Dit artikel wordt beschreven specifieke methoden voor biochemische hoeveelheid wasmiddel-ontbindend TRPV1 spectroscopische p.a.. De gecombineerde protocollen bieden biochemische en biofysische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast om de structurele en functionele studies voor zoogdieren ionenkanalen in een membraan-gecontroleerde omgeving.

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) zijn flexibele eiwitdomeinen die hun conformatie wijzigen als reactie op veranderingen in de omgeving. Ensemble fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET) kan eiwitdimensies onder verschillende omstandigheden schatten. We presenteren een FRET-benadering om de structurele gevoeligheid van IDR te beoordelen in levende Saccharomyces cerevisiae-cellen onder hyperosmotische stress.

Schatting van structurele gevoeligheid van intrinsiek ongeordende regio's als reactie op hyperosmotische stress in levende cellen met behulp van FRET

Leer ReAsH/FlAsH-labeling van tetracysteïne-eiwitten in levende cellen voor kwantitatieve eiwitanalyse. Deze methode maakt gedetailleerde studie van eiwitconformaties en oligomerisatiestatussen mogelijk.

ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine ​​Sensor eiwitten in cellen

Meer video's verkennen

ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine Sensor eiwitten in cellen