ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine ​​Sensor eiwitten in cellen

Het algemene doel van deze procedure is om cellen die een tetra cysteïne en fluorescent gelabeld eiwit tot expressie brengen te markeren met de kleurstoffen flash of ash, en de resultaten kwantitatief te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst een plasmide, dat een fluorescent eiwit en het doelwiteiwit bevat met een tetra cysteïne-tag, in de cellijn van belang te transfecteren. Vervolgens wordt het tot expressie gebrachte eiwit gelabeld met R of flash, en wordt het niet-specifiek gebonden dieet verwijderd door wassen met BAL om voor te bereiden op microscopisch beeldvorming.

Vervolgens wordt een confocale microscoop gebruikt om fluorescente beelden van de cellen te verzamelen met de ash of flash en fluorescente eiwitkanalen. Ten slotte worden de beelden geanalyseerd met behulp van image J om de binding van ash of flash aan het doelwiteiwit te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de mate van ash of flash-binding aan het doelwiteiwit in cellen laten zien door de correlatie van ash-fluorescentie met fluorescente eiwitfluorescentie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals het eenvoudigweg nemen van het doelwiteiwit met GFP, is dat een tweede eigenschap van het eiwit kan worden gevolgd, zoals een conformationele verandering naast de lokalisatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwitsubstructuur en functie, zoals ionisatiefase-gebeurtenissen, conformationele veranderingen en LI-bindingsgebeurtenissen die het vermogen van de TAC om ash of flash te verbannen veranderen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we wilden beoordelen hoe kleine submicroscopische polygame van met Huntington zich in cellen vormden.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de stappen voor gegevensanalyse moeilijk te leren zijn omdat ze technisch complex zijn. Het demonstreren van de experimentele procedures. Stappen één tot drie zullen Yasmin Ranson zijn, een onderzoeksassistent uit ons laboratorium, die de gegevensanalyse demonstreert. Stap vier zal Sevki GaN zijn, een afstudeerstudent uit ons laboratorium. Gebruik standaard celkweekmethoden voor uw cellijn van belang en een live celbeeldvormingsplaat die klaar is voor transfectie.

Bereid een cultuur van adhererende cellen voor, transfecteer uw plasmide dat het TC-taggen van belang bevat. Volgens een methode naar keuze is het belangrijk om positieve en negatieve controles te hebben om de mate van specifieke binding aan de TC-tags te beoordelen, evenals om de bleekte van de fluence tussen kanalen te beoordelen bij het verzamelen van confocale micrografieën. Daarom moet u voor twee kleuren ervoor zorgen dat monsters worden voorbereid voor enkele kleuren, ofwel het fluorescente eiwit alleen en indien mogelijk een T ctech-eiwit gebonden aan vlees of versus.

Maar zonder een fluorescent eiwit. Een tot twee dagen na transfectie, spoel de cellen voorzichtig met 300 microliter voorverwarmde Hank's balanced salt solution of HBSS, bereid vers voorverwarmde HBSS voor met 10 micromolair, een, twee, et Ethaandithiol of EDT en een micromolair flash of ash. En na het verwijderen van de HBSS van de cellen, vervang deze voorzichtig met 300 microliter ash-medium en incubeer gedurende exact 30 minuten bij 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator.

Volgens onze ervaring verhogen langere incubatietijden de achtergrondfluorescentie aanzienlijk. Zuig voorzichtig de labeloplossing van de cellen af en vervang deze door 300 microliter voorverwarmde HBSS met 250 micromolair, twee drie dimer, cap propanol, of BAL gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder de wasoplossing door voorzichtig te zuigen en vervang deze door 300 microliter voorverwarmde HBSS.

Na deze wasbeurt kunnen de cellen worden gefixeerd met paraform hoogte, hoewel we hebben vastgesteld dat dit de niet-specifieke cynische fluorescentie verhoogt. Daarom beeld we meestal de cellen levend af bij kamertemperatuur. Bovendien voorkomt fixatie van cellen vóór het labelen bindende bial-kleurstof.

Om cellen op de confocale microscoop te beginnen met beeldvorming, stel de parameters in voor het beeldvormen van de individuele fluoroforen en zorg ervoor dat er verwaarloosbare doorlaat tussen de kanalen is. Pas vervolgens de fotovermenigvuldiger-instellingen aan zodat de maximale fluorescentie in het monster de detector niet verzadigt. Zodra de beste beeldvormingsinstellingen zijn bepaald, verandert u deze niet tussen monsters.

Gebruik een scanfrequentie van 200 hertz, verzamel vier lijngemiddelden en stel de pinholesdiameter in op één area-eenheid. De pinholesdiameter kan worden uitgebreid als signaal-ruis een probleem is. Dit kan echter resulteren in enige verlies van beeldresolutie.

Verzamel de confocale beelden in een 12-bits of hoger formaat indien mogelijk. Om de kwaliteit van kwantitatieve gegevensanalyse te maximaliseren. Verzamel beelden voor het kanaal van het fluorescente eiwit en ook voor het BI-arsenaal-dye-kanaal voor alle monsters.

Gebruik voor het analyseren van de gegevens Image J-software met de volgende plug-ins. Als u een versie van Image J gebruikt die ouder is dan versie 1.32 C, klikt u op de volgende opties. Om meerdere afbeeldingen tegelijkertijd te openen, bewerkt u opties invoer slash uitvoer, klikt u op het vakje om j file chooser te gebruiken om slash te delen.

Klik op OK. Open de afbeeldingen van belang. Image J zal automatisch de maximale en minimale pixelintensiteiten definiëren die voor elke afbeelding afzonderlijk op het scherm worden weergegeven, omdat verschillende afbeeldingen verschillende pixelintensiteiten zullen hebben.

Dit betekent dat de weergegeven afbeeldingen niet vergelijkbaar zijn zoals bekeken. Om ervoor te zorgen dat de geopende afbeeldingen allemaal op dezelfde schaal staan, definieert u fysiek de bovenste en onderste pixelintensiteiten die moeten worden bekeken. Om deze waarden in te stellen, kiest u afbeelding, pas helderheid slash contrast aan.

Klik op instellen, definieer de minimale en maximale weergegeven waarden. Kies vervolgens voor propagatie naar alle geopende afbeeldingen en klik op OK. Plaats alternatief alle afbeeldingen voor een bepaald kanaal samen in één bestand of stack.

Image J zal vervolgens alle afbeeldingen automatisch aanpass