Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopie of een AFM maakt gebruik van mechanische probing van een oppervlak om beelden met een hoge resolutie te genereren zonder dat de monsterchemische behandeling noodzakelijk is. In deze video worden bacteriën geïmmobiliseerd op met gelatine gecoate mica en in een vloeibare omgeving afgebeeld met een AFM. Eerst worden mica-vierkantjes gesneden om op het platform van de AFM-microscoop te passen. De bovenste laag van de mica wordt verwijderd en de mica-vierkantjes worden gecoat met gelatine.

Vervolgens wordt een druppel bacteriële suspensie op de met gelatine gecoate mica geplaatst en uitgespreid. Met behulp van een pipetpunt worden de monsters 10 minuten geïncubeerd. Daarna worden de ongebonden bacteriën van het oppervlak gewassen.

Het monster wordt in de AFM-natcel geplaatst en afgebeeld om beelden met een hoge resolutie van levende bacteriën te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immobilisatie via ISO-poreuze filters, is dat zowel staafvormige als bolvormige bacteriën betrouwbaar geïmmobiliseerd kunnen worden. Daarnaast is een groter percentage van het celoppervlak toegankelijk voor de AFM-probe.

Een belangrijk voordeel van atoomkrachtmicroscopie ten opzichte van andere microscopietechnieken is dat er studies op individuele cellen kunnen worden uitgevoerd, waardoor onderzoek naar celmorfologie, septumvorming en cytokinese mogelijk wordt. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen tegen problemen aanlopen omdat zij vaak gelatine gebruiken die niet bewezen effectief is voor het immobiliseren van bacteriën, of bacteriën gebruiken die zijn gekweekt in een complex medium waarin componenten concurreren met de adhesie van de bacteriën aan het gelatine-oppervlak. We haalden het eerste idee voor deze methode uit experimenten uit de jaren 1970 waarbij bacteriën werden geïmmobiliseerd.

Met gelatine gecoate glazen objectglazen voor experimenten met lichtmicroscopie en autoradiografie. In deze demonstratie worden levende gramnegatieve bacteriën geïmmobiliseerd voor AFM-beeldvorming, maar de methode is ook toepasbaar op grampositieve bacteriën. Om de MICA voor te bereiden, begint u met het knippen ervan met een schaar zodat deze op de AFM-microscooptafel past en de AFM-natcel kan accommoderen.

Plak vervolgens plakband op het mica-oppervlak en verwijder dit om de buitenste laag mica van het uitgesneden stuk af te pellen. Ga door met het verwijderen van de buitenste laag van beide zijden totdat er alleen gladde, ononderbroken lagen overblijven. Om de gelatineloplossing te bereiden, voegt u 100 milliliters gedestilleerd water toe aan een laboratoriumfles en verhit u dit in een magnetron.

Wanneer het water begint te koken, haal je het uit de magnetron, voeg je 0,5 gram gelatine toe en schud je de fles voorzichtig tot de gelatine is opgelost. Let op dat rundergelatine niet goed werkt voor deze procedure. Varkensgelatine wordt aanbevolen.

Plaats de fles op het werkvlak en laat deze afkoelen tot 60 tot 70 °C. Giet vervolgens een voldoende hoeveelheid van de gelatineloplossing in een klein bekerglas om ervoor te zorgen dat het MICA met een pincet volledig kan worden ondergedompeld. Dompel een MICA-vierkant in de warme gelatineloplossing en haal het onmiddellijk weer uit.

Plaats de MICA op zijn zijkant op een papieren handdoek, leunend tegen een rek voor microcentrifuges, om gedurende de nacht aan de omgevingslucht te drogen. De met gelatine gecoate MICA kan gedurende ten minste twee weken worden gebruikt. Indien de met gelatine gecoate MICA gedurende enkele weken niet zal worden gebruikt.

Plaats het op filterpapier in een afgedekte Petrischaal en bewaar het bij kamertemperatuur. Het overschot aan gelatineloping kan gekoeld bewaard worden en ongeveer een maand worden gebruikt door de voorraadoplossing simpelweg opnieuw te verwarmen tot tussen 60 en 70 °C. Er moet zorgvuldig worden toegezien op het feit dat de gelatine tijdens het opnieuw verwarmen niet kookt.

Voordat de bacteriën op met gelatine gecoate MICA worden aangebracht, dient te worden gecontroleerd of de bacteriële concentratie adequaat is. Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid van het bacteriële monster te meten bij 600 nanometers. Een OD van 0,5 tot 1 is optimaal.

Breng vervolgens één milliliter van de cultuur over naar een microcentrifugebuis en centrifugeer deze om een pellet te vormen. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en was de pellet vervolgens in één milliliter gefiltreerd gedeïoniseerd water of buffer. Pipetteer voorzichtig op en neer om te resuspenderen.

Resuspendeer het pellet dat u heeft verkregen door centrifugatie prompt in 500 µL nanopure gedeïoniseerd water; de bacteriële suspensie moet zichtbaar troebel zijn om een adequate celconcentratie te hebben voor FM-beeldvorming.

Indien osmotische shock een zorg is, kan 0,25 molair sucrose aan de beeldvormingsoplossing worden toegevoegd. Ik heb deze bacteriën geresuspendeerd in water, maar schroom niet om andere vloeistoffen te proberen. We hebben dit bijvoorbeeld gedaan met 0,25% sucrose, probeer dus andere vloeistoffen om te zien of dat ook werkt.

Bereid twee objectglazen voor per monster. Voeg met een micropipet 10 tot 20 µL celstuspensie toe aan het met gelatine gecoate oppervlak. Gebruik vervolgens een micropipetpunt om de druppel in zowel de X- als Y-richting te verspreiden, zodat er een adequaat dekkingsoppervlak ontstaat voor FM-imaging.

Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, waarbij u erop let dat de pipetpunt het gelatineoppervlak niet fysiek raakt. Spoel vervolgens met een waterstraal en verwijder overtollig vloeistof van het monster door de rand van het monster tegen een papieren handdoek of filterpapier te drukken. Droog een van de objectglazen snel met een stroom nitrogengas.

Inspecteer vervolgens het preparaat visueel. Een ondoorzichtige plek geeft aan dat de bacteriën in de wasstap niet zijn verwijderd. Het andere preparaat, dat nu voor beeldvorming wordt gebruikt, mag niet uitdrogen.

Plaats het in de natte stage van de AFM en zet het vast met de klemmen; voeg vervolgens met een micropipet water toe aan de natte stage. Het is raadzaam om de atoomkrachtmicroscoop voor te bereiden voordat er beelden in vloeistof worden gemaakt. Zorg ervoor dat de cantilever voor beeldvorming in vloeistof in de AFM is geplaatst en is uitgelijnd met de laser.

Voer de beeldvorming uit met atoomkrachtmicroscopie met behulp van een pico plus atoomkrachtmicroscoop, uitgerust met een scanhead van 100 micron en vico siliciumnitride probes met nominale veerconstanten variërend van 0,01 tot 0,1 nano newton per nanometer. Zodra de microscoop is voorbereid, plaatst u de FM-scanner en de tafel in de microscoop. Meestal beginnen we bij een beeldvormingssnelheid van 0,5 lijnen per seconde tot één lijn per second en wordt de resolutie ingesteld van 128 datapunten per lijn tot 512.

Stel het instrument zo in dat er beelden worden verzameld met 128 tot 512 pixels per lijn. Scan met een scansnelheid van 0,5 tot één lijn per seconde. Pas vervolgens, indien nodig, het instelpunt en de gains op de A FM aan om optimale beelden te verkrijgen.

Verzamel tot slot de beelden. E coli-bacteriën werden gemonteerd op met gelatine gecoate MICA zoals beschreven in deze video, en vervolgens gefotografeerd in 0.005 molar PVS. Gebruik hiervoor deze methode.

Scepters zijn duidelijk zichtbaar in de verzamelde afbeelding en de celoppervlakken zijn glad, zonder tekenen van dehydratatie. Ter vergelijking: afbeeldingen van dezelfde e coli in lucht, zoals hier getoond, vertonen vaak structuren die in vloeistof niet zichtbaar zijn. In dit geval vertonen de cellen een ringvormig uiterlijk door dehydratatie en zijn bacteriële aanhangsels zoals FIA zichtbaar.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het voorbereiden van bacteriële monsters voor FM-beeldvorming in een vloeistofomgeving. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer één uur worden uitgevoerd, mits de met gelatine gecoate micro-oppervlakken vooraf zijn voorbereid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de juiste gelatine te kiezen en een passende concentratie bacteriën te hanteren bij het volgen van deze methode.

Andere metingen, zoals het gebruik van de FN-cantilever als krachtsensormiddel om krachtmetingen op bacteriële oppervlakken uit te voeren, kunnen worden gerealiseerd. Daarnaast kunnen specifieke sonde-moleculen aan de A FM-tip worden gebonden om te interageren met specifieke doelwitten op het bacteriële oppervlak, zodat interactiekrachten kunnen worden geïdentificeerd en gemeten. Vergeet over het algemeen niet dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen wanneer u met deze methode werkt met pathogene bacteriën.