Name: Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer bacteriële immobilisatie voor AFM-beeldvorming met gelatine-gecoate mica in vloeistof. Deze methode maakt hoogresolutie-imaging van levende Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek wordt gesponsord door het Bureau van biologische en milieu-onderzoek, het Amerikaanse ministerie van Energie en door subsidies van de Virginia Commonwealth&#39;s Health Research Board. Oak Ridge National Laboratory wordt beheerd door UT-Battelle, LLC, voor het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract nummer DE-AC05-00OR22725.

1. Mica voorbereiding: <ol><li> Snijd de mica (Electron Microscopy Wetenschappen) met een schaar aan de afmetingen die nodig zijn om de AFM microscoop (ca. 22 x 30 mm) passen. </li><li> Klieven van de mica aan beide zijden, over het algemeen met behulp van tape om de buitenste laag te verwijderen, totdat alleen glad ononderbroken lagen blijven. </li></ol> 2. Voorbereiding van de gelatine-oplossing: <ol><li> Voeg 100 ml gedestilleerd water tot een laboratorium fles. </li><li> Verwarm de fles in een magnetron totdat het water begint te koken. (Als een magnetron niet beschikbaar is, kan het water worden verwarmd in een bekerglas op een hete plaat.) </li><li> Weeg 0,5 g van de gelatine (Sigma G-6144, G-2625 of G-2500) en toevoegen aan het warm gedestilleerd water. </li><li> Zwenk de fles tot de gelatine volledig is opgelost. </li><li> Koel de gelatine oplossing voor 60-70 ° C. </li><li> Giet ongeveer 15 mL in een klein bekerglas (20 ml), waarin de snede gesplitst mica kan worden gedompeld. </li></ol> 3. Mica coating: <ol><li> Dompel de mica pleinen in de verwarmde gelatine-oplossing en trekt al snel zodanig dat de mica bedekt is (figuur 1a). </li><li> Na het coaten, onmiddellijk ondersteunen de mica, aan de rand, op een papieren handdoek om te drogen in de lucht (afb. 1b). De gelatine gecoate mica gebruikt kan worden voor minimaal 2 weken. De overtollige gelatine oplossing kan de koelkast worden bewaard en gebruikt worden voor ongeveer een maand door simpelweg verwarmen de voorraad oplossing om tussen de 60-70 ° C. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de gelatine niet gekookt is tijdens het opwarmen. </li></ol> 4. Montage bacteriën op gelatine gecoate mica: <ol><li> Pellet 1 mL van een bacteriecultuur (0,5 tot 1,0 OD bij 600 nm) bij 800 tot 4.500 RCF. Afhankelijk van de bacteriën, gebruik dan de minimum RCF die pellet van de cellen in ~ 5 minuten. </li><li> Was de pellet in dezelfde hoeveelheid gefilterd gedeïoniseerd water of buffer. </li><li> Opnieuw het verzamelen van de cellen door centrifugeren. </li><li> Prompt Resuspendeer de pellet in 500 ui van nanopure gedeïoniseerd water of buffer. (De bacteriële suspensie moet zichtbaar worden troebel in om een ​​voldoende concentratie van cellen voor AFM beeldvorming hebben.) </li><li> Breng de celsuspensie (10-20 pi) om de gelatine-gecoate mica en verspreid over het oppervlak met behulp van een pipet tip (afb. 1c). Zorg moet worden genomen om niet fysiek de gelatine oppervlak contact met de pipetpunt tijdens het aanbrengen of verspreiden van de bacteriële oplossing. </li><li> Laat het oppervlak rusten voor 10 minuten en met een stroom van water of buffer (Fig 1 cd) spoelen. Tijdens de gehele procedure, zorg om ervoor te zorgen dat het monster niet is toegestaan ​​om te drogen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Figuur 2 toont bijvoorbeeld beelden van bacteriële cellen die zijn gemonteerd op gelatine gecoate mica en afgebeeld door de AFM. In onze laboratoria, worden monsters meestal afgebeeld met behulp van een PicoPlus atomic force microscoop (Agilent Technologies, Temple, AZ), uitgerust met een 100 micrometer scannen hoofd. Het instrument wordt gebruikt op 128-512 pixels per lijn te scannen met een scansnelheid van 0,5-1,0 lijnen / s. De uitkragingen die meestal worden gebruikt zijn Veeco siliciumnitride sondes (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) met een nominale veerconstanten variërend 0,01 tot 0,1 nN / nm. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Gelatine bij een temperatuur van 60-70 ° C is geplaatst in een 20 ml beker. Met behulp van een pincet vers geknipte mica pleinen zijn volledig ondergedompeld in de gelatine (a) genomen en die rechtop op een papieren handdoek leunend tegen een micro-centrifuge rack (b). Een druppel van bacteriële monster wordt geplaatst op de mica en verspreid dit met een pipet tip in zowel de X-en Y-richting (c). Na aftrek van het monster tot op het mica oppervlak incubeer gedurende minstens 10 minuten, spoel het monster in een stroom van gedistilleerd water. Als de immobilisatie gewerkt zul je in staat zijn om een ​​ondoorzichtige stip te zien op de mica zoals getoond in het rechterpaneel van (d). Als de immobilisatie niet werkt krijgt u een helder stuk mica zoals in het linker paneel. De ondoorzichtige plek op de mica schalen om de concentratie van de bacteriën in de druppel die u op de gelatine behandeld mica. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. AFM beelden van E. coli. In paneel (a), worden de cellen gemonteerd op gelatine gecoate mica en afgebeeld in 0,005 M PBS. Ter vergelijking, is een beeld van de bacteriële cellen gemonteerd op gelatine gecoate mica en afgebeeld in de lucht die in paneel (b). Hoewel septa zijn duidelijk zichtbaar in beeld verzameld in vloeistof, hogere resolutie, zoals aangegeven door de aanwezigheid van pili (inzet paneel (b)), kunnen worden verkregen in de lucht.

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Verschillende factoren kunnen van invloed zijn microbiële cel montage en beeldvorming door de AFM. De gelatine die wordt gebruikt voor het coaten van het mica is belangrijk. Commerciële gelatine is geïsoleerd uit een aantal van de gewervelde dieren waaronder vissen, koeien en varkens. Zowel de oorsprong en de verwerkingsmethode bepalen de gelatine de geschiktheid voor bacteriële immobilisatie. Tal van bronnen en vormen van gelatine werden geëvalueerd op hun effectiviteit in immobiliseren bacteriën [1]. De twee meest eff...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> G6144, G2625 of G2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus Atomic Force Microscope </td><td> Agilent Technologies, Tempe, AZ </td><td></td></tr><tr><td> AFM uitkragingen </td><td> Veeco, Santa Barbara, Californië </td><td> MLCT-AUHW </td></tr></tbody></table>

bacteriële immobilisatie for imaging door atomic force microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is een hoge resolutie (nm schaal) imaging tool die mechanisch sondes een oppervlak. Het heeft de mogelijkheid om beeld cellen en biomoleculen, in een vloeibare omgeving, zonder de noodzaak om chemisch te behandelen van het monster. Om dit doel te bereiken, moet het monster voldoende houden aan de montage-oppervlak om de verwijdering te voorkomen door krachten uitgeoefend door de AFM te scannen cantilever tip. In veel gevallen succesvol beeldvorming hangt af van immobilisatie van het monster op de montage-oppervlak. Optimaal dienen immobilisatie worden minimaal invasieve aan het monster zodanig dat metabolische processen en functionele kenmerken niet in het gedrang komen. Door het bekleden van vers geknipt mica oppervlakken met varkens (varkens) gelatine, kan negatief geladen bacteriën worden geïmmobiliseerd op het oppervlak en afgebeeld in vloeibare door de AFM. Immobilisatie van bacteriële cellen op gelatine gecoate mica is het meest waarschijnlijk te wijten aan elektrostatische interactie tussen de negatief geladen bacteriën en de positief geladen gelatine. Verschillende factoren kunnen interfereren met bacteriële immobilisatie, inclusief de chemische bestanddelen van de vloeistof waarin de bacteriën zijn opgehangen, de incubatietijd van de bacterie op de gelatine gecoate mica, oppervlakte-eigenschappen van de bacteriële stam en het medium waarin de bacteriën worden afgebeeld. Over het algemeen is het gebruik van gelatine-gecoate mica vinden over het algemeen van toepassing voor de beeldvorming microbiële cellen.

Live-Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën kunnen worden geïmmobiliseerd op gelatine gecoate mica en beeld gebracht in een vloeistof met behulp van Atomic Force Microscopy (AFM).

Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy

AFM is een beeldvormingsinstrument met een hoge resolutie (nm-schaal) dat een oppervlak mechanisch aftast. Het is in staat om cellen en biomoleculen in een vloeistof af te beelden ...

Atomic force microscopie of een AFM maakt gebruik van mechanische probing van een oppervlak om beelden met een hoge resolutie te genereren zonder dat de monsterchemische behandeling noodzakelijk is. In deze video worden bacteriën geïmmobiliseerd op met gelatine gecoate mica en in een vloeibare omgeving afgebeeld met een AFM. Eerst worden mica-vierkantjes gesneden om op het platform van de AFM-microscoop te passen. De bovenste laag van de mica wordt verwijderd en de mica-vierkantjes worden gecoat met gelatine.Vervolgens wordt een druppel bacteriële suspensie op de met gelatine gecoate mica geplaatst en uitgespreid. Met behulp van een pipetpunt worden de monsters 10 minuten geïncubeerd. Daarna worden de ongebonden bacteriën van het oppervlak gewassen.Het monster wordt in de AFM-natcel geplaatst en afgebeeld om beelden met een hoge resolutie van levende bacteriën te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immobilisatie via ISO-poreuze filters, is dat zowel staafvormige als bolvormige bacteriën betrouwbaar geïmmobiliseerd kunnen worden. Daarnaast is een groter percentage van het celoppervlak toegankelijk voor de AFM-probe.Een belangrijk voordeel van atoomkrachtmicroscopie ten opzichte van andere microscopietechnieken is dat er studies op individuele cellen kunnen worden uitgevoerd, waardoor onderzoek naar celmorfologie, septumvorming en cytokinese mogelijk wordt. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen tegen problemen aanlopen omdat zij vaak gelatine gebruiken die niet bewezen effectief is voor het immobiliseren van bacteriën, of bacteriën gebruiken die zijn gekweekt in een complex medium waarin componenten concurreren met de adhesie van de bacteriën aan het gelatine-oppervlak. We haalden het eerste idee voor deze methode uit experimenten uit de jaren 1970 waarbij bacteriën werden geïmmobiliseerd.Met gelatine gecoate glazen objectglazen voor experimenten met lichtmicroscopie en autoradiografie. In deze demonstratie worden levende gramnegatieve bacteriën geïmmobiliseerd voor AFM-beeldvorming, maar de methode is ook toepasbaar op grampositieve bacteriën. Om de MICA voor te bereiden, begint u met het knippen ervan met een schaar zodat deze op de AFM-microscooptafel past en de AFM-natcel kan accommoderen.Plak vervolgens plakband op het mica-oppervlak en verwijder dit om de buitenste laag mica van het uitgesneden stuk af te pellen. Ga door met het verwijderen van de buitenste laag van beide zijden totdat er alleen gladde, ononderbroken lagen overblijven. Om de gelatineloplossing te bereiden, voegt u 100 milliliters gedestilleerd water toe aan een laboratoriumfles en verhit u dit in een magnetron.Wanneer het water begint te koken, haal je het uit de magnetron, voeg je 0,5 gram gelatine toe en schud je de fles voorzichtig tot de gelatine is opgelost. Let op dat rundergelatine niet goed werkt voor deze procedure. Varkensgelatine wordt aanbevolen.Plaats de fles op het werkvlak en laat deze afkoelen tot 60 tot 70 °C. Giet vervolgens een voldoende hoeveelheid van de gelatineloplossing in een klein bekerglas om ervoor te zorgen dat het MICA met een pincet volledig kan worden ondergedompeld. Dompel een MICA-vierkant in de warme gelatineloplossing en haal het onmiddellijk weer uit.Plaats de MICA op zijn zijkant op een papieren handdoek, leunend tegen een rek voor microcentrifuges, om gedurende de nacht aan de omgevingslucht te drogen. De met gelatine gecoate MICA kan gedurende ten minste twee weken worden gebruikt. Indien de met gelatine gecoate MICA gedurende enkele weken niet zal worden gebruikt.Plaats het op filterpapier in een afgedekte Petrischaal en bewaar het bij kamertemperatuur. Het overschot aan gelatineloping kan gekoeld bewaard worden en ongeveer een maand worden gebruikt door de voorraadoplossing simpelweg opnieuw te verwarmen tot tussen 60 en 70 °C. Er moet zorgvuldig worden toegezien op het feit dat de gelatine tijdens het opnieuw verwarmen niet kookt.Voordat de bacteriën op met gelatine gecoate MICA worden aangebracht, dient te worden gecontroleerd of de bacteriële concentratie adequaat is. Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid van het bacteriële monster te meten bij 600 nanometers. Een OD van 0,5 tot 1 is optimaal.Breng vervolgens één milliliter van de cultuur over naar een microcentrifugebuis en centrifugeer deze om een pellet te vormen. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en was de pellet vervolgens in één milliliter gefiltreerd gedeïoniseerd water of buffer. Pipetteer voorzichtig op en neer om te resuspenderen.Resuspendeer het pellet dat u heeft verkregen door centrifugatie prompt in 500 µL nanopure gedeïoniseerd water; de bacteriële suspensie moet zichtbaar troebel zijn om een adequate celconcentratie te hebben voor FM-beeldvorming.Indien osmotische shock een zorg is, kan 0,25 molair sucrose aan de beeldvormingsoplossing worden toegevoegd. Ik heb deze bacteriën geresuspendeerd in water, maar schroom niet om andere vloeistoffen te proberen. We hebben dit bijvoorbeeld gedaan met 0,25% sucrose, probeer dus andere vloeistoffen om te zien of dat ook werkt.Bereid twee objectglazen voor per monster. Voeg met een micropipet 10 tot 20 µL celstuspensie toe aan het met gelatine gecoate oppervlak. Gebruik vervolgens een micropipetpunt om de druppel in zowel de X- als Y-richting te verspreiden, zodat er een adequaat dekkingsoppervlak ontstaat voor FM-imaging.Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, waarbij u erop let dat de pipetpunt het gelatineoppervlak niet fysiek raakt. Spoel vervolgens met een waterstraal en verwijder overtollig vloeistof van het monster door de rand van het monster tegen een papieren handdoek of filterpapier te drukken. Droog een van de objectglazen snel met een stroom nitrogengas.Inspecteer vervolgens het preparaat visueel. Een ondoorzichtige plek geeft aan dat de bacteriën in de wasstap niet zijn verwijderd. Het andere preparaat, dat nu voor beeldvorming wordt gebruikt, mag niet uitdrogen.Plaats het in de natte stage van de AFM en zet het vast met de klemmen; voeg vervolgens met een micropipet water toe aan de natte stage. Het is raadzaam om de atoomkrachtmicroscoop voor te bereiden voordat er beelden in vloeistof worden gemaakt. Zorg ervoor dat de cantilever voor beeldvorming in vloeistof in de AFM is geplaatst en is uitgelijnd met de laser.Voer de beeldvorming uit met atoomkrachtmicroscopie met behulp van een pico plus atoomkrachtmicroscoop, uitgerust met een scanhead van 100 micron en vico siliciumnitride probes met nominale veerconstanten variërend van 0,01 tot 0,1 nano newton per nanometer. Zodra de microscoop is voorbereid, plaatst u de FM-scanner en de tafel in de microscoop. Meestal beginnen we bij een beeldvormingssnelheid van 0,5 lijnen per seconde tot één lijn per second en wordt de resolutie ingesteld van 128 datapunten per lijn tot 512.Stel het instrument zo in dat er beelden worden verzameld met 128 tot 512 pixels per lijn. Scan met een scansnelheid van 0,5 tot één lijn per seconde. Pas vervolgens, indien nodig, het instelpunt en de gains op de A FM aan om optimale beelden te verkrijgen.Verzamel tot slot de beelden. E coli-bacteriën werden gemonteerd op met gelatine gecoate MICA zoals beschreven in deze video, en vervolgens gefotografeerd in 0.005 molar PVS. Gebruik hiervoor deze methode.Scepters zijn duidelijk zichtbaar in de verzamelde afbeelding en de celoppervlakken zijn glad, zonder tekenen van dehydratatie. Ter vergelijking: afbeeldingen van dezelfde e coli in lucht, zoals hier getoond, vertonen vaak structuren die in vloeistof niet zichtbaar zijn. In dit geval vertonen de cellen een ringvormig uiterlijk door dehydratatie en zijn bacteriële aanhangsels zoals FIA zichtbaar.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het voorbereiden van bacteriële monsters voor FM-beeldvorming in een vloeistofomgeving. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer één uur worden uitgevoerd, mits de met gelatine gecoate micro-oppervlakken vooraf zijn voorbereid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de juiste gelatine te kiezen en een passende concentratie bacteriën te hanteren bij het volgen van deze methode.Andere metingen, zoals het gebruik van de FN-cantilever als krachtsensormiddel om krachtmetingen op bacteriële oppervlakken uit te voeren, kunnen worden gerealiseerd. Daarnaast kunnen specifieke sonde-moleculen aan de A FM-tip worden gebonden om te interageren met specifieke doelwitten op het bacteriële oppervlak, zodat interactiekrachten kunnen worden geïdentificeerd en gemeten. Vergeet over het algemeen niet dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen wanneer u met deze methode werkt met pathogene bacteriën.

bacterial-immobilization-for-imaging-by-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een tapping mode atomic force microscoop (AFM) methode voor de visualisatie van plasmide DNA, cytoplasmatische eiwitten en DNA-eiwitcomplexen is beschreven. De methode bestaat uit alternatieve benaderingen voor het bereiden van monsters voor AFM beeldvorming volgende biochemische manipulatie. DNA met specifieke eiwit interactie regio's zijn waargenomen in de buurt-fysiologische buffer omstandigheden.

Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

We presenteren een protocol voor het functionaliseren van atomaire kracht Microscoop (AFM) cantihefbomen met een enkele T-cel en kraal deeltje voor immunologische studies. Procedures voor het sonde-eenpaar T-cel-dendritische celbinding door de AFM en om de real-time cellulaire respons van macrofagen op één vast deeltje door de AFM te monitoren met fluorescentie beeldvorming worden getoond.

Functionalisatie van atomaire kracht Microscoop Cantihefbomen met single-T cellen of één deeltje voor immunologische eencellige kracht spectroscopie

Dit protocol heeft als doel afm-metingen op honderden microbiële cellen te automatiseren. Eerst worden microben geïmmobiliseerd in PDMS-stempelmicrostructuren en vervolgens worden krachtspectroscopiemetingen automatisch uitgevoerd op honderden geïmmobiliseerde cellen.

Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden C. albicans-cellen

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) biedt een krachtig platform voor bacteriële studies, waardoor resolutie op nanoschaal kan worden bereikt. Zowel het in kaart brengen van subcellulaire veranderingen (bijvoorbeeld bij celdeling) als vergelijkende studies van de chemische samenstelling (bijvoorbeeld als gevolg van medicijnresistentie) kunnen worden uitgevoerd op een enkel celniveau in bacteriën.

Atomic Force Microscopie gecombineerd met infraroodspectroscopie als hulpmiddel om single bacterium chemistry te onderzoeken

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Hier presenteren we de toepassing van atomic force microscopy (AFM) als een eenvoudige en snelle methode voor bacteriële karakterisering en analyseren we details zoals de bacteriële grootte en vorm, bacteriële cultuurbiofilms en de activiteit van nanodeeltjes als bactericiden.

Contactmodus Atomic Force Microscopie als een snelle techniek voor morfologische observatie en bacteriële celschadeanalyse

We presenteren een eenvoudige en toegankelijke methode voor filamenteuze cyanobacteriële visualisatie in het XY-vlak. Er werd een agarosematrix met een laag smeltpunt gebruikt, waardoor beelden van eiwitten die betrokken zijn bij de deling, in een verticale oriëntatie konden worden verkregen. Daarom kan deze methodologie worden toegepast op elk filamenteus organisme en verschillende soorten eiwitten.

Verticale immobilisatiemethode voor time-lapse microscopieanalyse in filamenteuze cyanobacteriën

Leer bacteriële immobilisatie voor AFM-beeldvorming met gelatine-gecoate mica in vloeistof. Deze methode maakt hoogresolutie-imaging van levende Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën mogelijk.

Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy

Meer video's verkennen