Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy
10 augustus 2011
Live-Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën kunnen worden geïmmobiliseerd op gelatine gecoate mica en beeld gebracht in een vloeistof met behulp van Atomic Force Microscopy (AFM).
Atomaire krachtmicroscopie of een FM gebruikt mechanische sondering van een oppervlak om afbeeldingen met hoge resolutie te genereren zonder dat het monster chemisch hoeft te worden behandeld. In deze video worden bacteriën geïmmobiliseerd op met gelatine gecoate mica en afgebeeld in een vloeibare omgeving door een FM.Eerst worden MICA-vierkanten gesneden om op het A FM-microscoopplatform te passen. De bovenste laag van de MICA wordt verwijderd en de mica-vierkanten worden bedekt met gelatine.
Vervolgens wordt een druppel bacteriënsuspensie op de met gelatine gecoate mica geplaatst en verspreid. Met behulp van een pipettepunt worden de monsters gedurende 10 minuten geïncubeerd. Vervolgens worden de ongebonden bacteriën van het oppervlak gewassen.
Het monster wordt in de A FM-natte cel geplaatst en afgebeeld om afbeeldingen met hoge resolutie van levende bacteriën te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals ISO-poriënfiltermobilisatie, is dat zowel staafvormige als sferische bacteriën betrouwbaar kunnen worden geïmmobiliseerd. Ook is een groter percentage van het celoppervlak toegankelijk voor de A FM-sonde.
Een belangrijk voordeel van atomaire krachtmicroscopie boven andere microscopieën is dat onderzoeken naar celmorfologie, septumvorming en cytokinese op één cel kunnen worden uitgevoerd. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen worstelen omdat ze de neiging hebben om gelatine te gebruiken die niet bewezen is om bacteriën te immobiliseren of de gebruikte bacteriën die in een complex medium zijn gekweekt waar componenten concurreren met de adhesie van de bacteriën aan het gelatineoppervlak. We hadden het idee voor deze methode voor het eerst uit experimenten uit de jaren 70 waar bacteriën werden geïmmobiliseerd.
Met gelatine gecoate glazen platen voor experimenten met behulp van lichtmicroscopie en autoradiografie. In deze demonstratie worden levende gram-negatieve bacteriën geïmmobiliseerd voor FM-beeldvorming, maar de methode is ook toepasbaar op gram-positieve bacteriën. Om de MICA voor te bereiden, begint u door deze met een schaar te snijden om te passen op het A FM-microscoopplatform en de A FM-natte cel te huisvesten.
Plaats vervolgens scotchtape op het MICA-oppervlak en verwijder deze om de buitenste laag MICA van het gesneden stuk te verwijderen. Blijf de buitenste laag van beide kanten verwijderen tot er alleen nog gladde ononderbroken lagen overblijven. Om de gelatineoplossing voor te bereiden, voegt u 100 milliliter gedistilleerd water toe aan een laboratoriumfles en verwarm deze in een magnetron.
Wanneer het water begint te koken, haalt u het uit de magnetron, voegt u 0,5 gram gelatine toe en zwelt u de fles voorzichtig op totdat de gelatine is opgelost. Merk op dat rundergelatine niet goed werkt voor deze procedure. Varkensgelatine wordt aanbevolen.
Plaats de fles op de werktafel en laat deze afkoelen tot 60 tot 70 graden Celsius. Giet vervolgens een voldoende hoeveelheid van de gelatineoplossing in een kleine beker om ervoor te zorgen dat de MICA volledig kan worden ondergedompeld met behulp van een pincet. Dompel een MICA-vierkant in de warme gelatineoplossing en trek het snel terug. Onmiddellijk.
Plaats de MICA op zijn rand op een papieren handdoek die tegen een microcentrifugerek leunt om de hele nacht in de lucht te drogen. De met gelatine gecoate MICA kan gedurende ten minste twee weken worden gebruikt. Als de met gelatine gecoate MICA gedurende een paar weken niet zal worden gebruikt.
Plaats het op filterpapier in een afgedekte petrischaal en bewaar het op kamertemperatuur. De overtollige gelatineoplossing kan gekoeld worden bewaard en gedurende ongeveer een maand worden gebruikt door de stamoplossing eenvoudig opnieuw te verwarmen tot tussen 60 en 70 graden. Celsius. Er moet voorzichtig worden omgegaan om ervoor te zorgen dat de gelatine niet wordt gekookt tijdens het opnieuw verwarmen.
Voordat de bacteriën op met gelatine gecoate MICA worden gemonteerd, moet worden gecontroleerd of de bacterieconcentratie voldoende is. Gebruik een spectrofotometer om een optische dichtheidswaarde van de bacteriemonster te verkrijgen bij 600 nanometer. Een OD van 0,5 tot één is optimaal.
Breng vervolgens één milliliter van de cultuur over in een microcentrifugebuis en centrifugeer deze om het te pelleten volgens de centrifugatie. Gebruik een pipettepunt om het supernatant te verwijderen, was vervolgens de pellet in één milliliter gefilterd gedeïoniseerd water of buffer. Voorzichtig pipetten op en neer om te resus.
Schors de pellet centrifuge uw gewin en resuspendeer snel het pellet. In 500 microliter nano pure gedeïoniseerd water, zou de bacteriënsuspensie zichtbaar moeten zijn om een adequate concentratie cellen te hebben. Voor een FM-beeldvorming.
Als osmotische shock een probleem is, kan 0,25 molaire sucrose worden toegevoegd aan de beeldvormingsoplossing. Ik heb deze bacteriën in water geresuspendeerd, maar wees niet bang om andere vloeistoffen te proberen. Bijvoorbeeld, we hebben dit gedaan met 0,25% sucrose, dus probeer andere vloeistoffen en kijk of dat ook zal werken.
Bereid twee platen voor elk monster voor. Voeg met behulp van een micropipetter 10 tot 20 microliter celsuspensie toe aan het met gelatine gecoate oppervlak. Gebruik vervolgens een micropipetpunt om de druppel in zowel de X- als Y-richting te verspreiden om een voldoende dekkingsgebied te geven voor FM-beeldvorming.
Zorg ervoor dat u het gelatineoppervlak niet fysiek raakt met de pipettepunt, incubeer het monster gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Spoel vervolgens met een stroom water om overtollig vocht van het monster te verwijderen door de rand van het monster aan een papieren handdoek of filterpapier te raken. Droog een van de platen snel af met een straal stikstofgas.
Inspecteer vervolgens de plaat visueel. Een ondoorzichtige vlek geeft aan dat de bacteriën niet zijn verwijderd in de wasstap. De andere plaat, die nu voor beeldvorming zal worden gebruikt, mag niet drogen.
Plaats het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie toont het gebruik van Atomic Force Microscopy (AFM) om levende Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën in een vloeibare omgeving te immobiliseren en te beeldvormen. De methode omvat het coaten van mica met gelatine om bacteriële adhesie en visualisatie te vergemakkelijken.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Beeldvormingstechnieken
- Atomic Force Microscopy
Achtergrond
- Atomic Force Microscopy maakt hoogwaardige beeldvorming van oppervlakken mogelijk.
- Levende bacteriën kunnen uitdagend zijn om te bestuderen vanwege hun beweging.
- Met gelatine bedekte oppervlakken kunnen bacteriële immobilisatie verbeteren.
- Beeldvorming in vloeibare omgevingen behoudt de natuurlijke toestand van bacteriën.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te demonstreren voor het immobiliseren van bacteriën op een oppervlak.
- Om bacteriën te visualiseren met behulp van AFM zonder chemische behandeling.
- Om een protocol te bieden voor onderzoekers geïnteresseerd in bacteriële beeldvorming.
Gebruikte methoden
- Mica-vierkanten worden gesneden en bedekt met gelatine.
- Een druppel bacteriële suspensie wordt aangebracht op het gelatine-oppervlak.
- Monsters worden geïncubeerd om bacteriën te laten hechten.
- Niet-gebonden bacteriën worden weggespoeld voordat er wordt beeldvormd.
Belangrijkste resultaten
- Levende bacteriën werden met succes geïmmobiliseerd op gelatine-bedekte mica.
- Hoge resolutie beelden van bacteriën werden verkregen met behulp van AFM.
- De methode maakt beeldvorming in een vloeibare omgeving mogelijk.
- Zowel Gram-negatieve als Gram-positieve bacteriën werden gevisualiseerd.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare manier om levende bacteriën te bestuderen.
- AFM kan effectief worden gebruikt voor het beeldvormen van biologische monsters.
- Verdere toepassingen in microbiologie en beeldvormingstechnieken zijn mogelijk.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy enables high-resolution imaging of live bacteria in liquid environments without chemical fixation, preserving native morphology and physiological state. This capability supports early-stage target validation by allowing direct observation of bacterial surface structures, division events, and membrane dynamics under near-native conditions. The gelatin-coated mica immobilization method provides a reproducible, minimally invasive platform for microbiological imaging that reduces sample preparation artifacts and enhances data reliability in discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of bacterial morphology, septum formation, and cytokinesis to interrogate therapeutic hypotheses about cell division targets.
- Operational Value: Provides label-free, liquid-phase imaging that avoids fixation artifacts and preserves functional bacterial attributes for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Gelatin-coated mica creates a standardized, reusable surface for consistent bacterial immobilization across screening campaigns.
- Operational Value: Supports preparation of validated biological systems with high surface accessibility for AFM probe interaction, enabling reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by imaging live bacteria in liquid, maintaining disease-relevant system integrity.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through quantitative, reproducible morphological and topological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a standardized preparation step for live bacterial imaging, supporting hypothesis testing and biological de-risking before lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct imaging of cell surface dynamics and division events in liquid.
- Screening: Enables assay readiness via reproducible bacterial immobilization on gelatin-coated mica, ensuring consistent sample presentation for AFM analysis.
- Analytics: Generates high-resolution topographical and force measurements that allow comparison of bacterial conditions, treatments, or genetic modifications.
- Translational Research: Maintains continuity with preclinical work by preserving native bacterial state in liquid, avoiding artifacts from fixation or dehydration.
- Enterprise Reuse: Gelatin-coated mica substrates can be prepared in advance and stored for up to two weeks, enabling platform reuse across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, label-free observation of bacterial ultrastructure.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined immobilization protocols, gelatin source specifications (porcine), and concentration controls (OD 0.5–1.0).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative morphological data that reduces late-stage biological risk in antimicrobial or antibacterial programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through standardized, scalable imaging outputs that enable cross-functional comparison of antibacterial candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, liquid-cell imaging, and bacterial handling under aseptic conditions.
- Depends on access to AFM systems with liquid cells, silicon nitride probes, and environmental control for scan speed and resolution.
- Necessitates standardization of gelatin preparation (porcine, 0.5% in distilled water), mica preparation, and bacterial concentration (OD 0.5–1.0 at 600 nm) across teams.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, media components, and imaging buffers (e.g., sucrose addition for osmotic sensitivity).
- Limited by the need to avoid gelatin boiling during preparation and potential interference from complex media components that compete with bacterial adhesion to gelatin.
